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1、含量测定方法的评价含量测定方法的评价含量测定方法的评价(Analytical performance parameters)任何一种分析测定方法，根据其使用的对象和要求，都应有相应的效能指标。一般常用的分析效能评价指标包括：精密度、准确度、检测限、定量限、选择性、线性与范围、重现性、耐用性等；测定方法的效能指标可以作为对分析测定方法的评价尺度也可以作为建立新的测定方法的实验研究依据。a、精密度(precision) 系指用该法测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度。它们越接近就越精密。在药物分析中，常用 标准(偏)差(standard deviation，SD 或 S)； 相对标准(偏)差
2、(relative standard deviation，RSD)，也称变异系数(coefficient of variation，CV)，表示。生物样品分析时，常用 RSD 表示精密度，并可细分为批内(或日内)精密度及批间(或日间)精密度。批内精密度(within-run precision)：是同一次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品各 7-10 份，每种浓度的样品按所拟定的分析方法操作，一次开机后，一一测定。计算每种浓度样品的 SD 值及 RSD 值。批内精密度也可视为日内精密度(with- in-day precision)。所得 RSD 应争取达到 5以内，但不能超过
3、 10%。批间精密度(between-run precision)：是不同次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品，每种浓度配制 7-10 份，置冰箱冷冻。自配制样品之日开始，按所拟定的分析方法操作，每天取出一份测定，计算每种浓度样品的 SD 值及 RSD 值。批间精密度也可视为日间精密度(day to day precision)。所得 RSD 应控制在15以内。b 、准确度(accuracy) 是指测得结果与真实值接近的程度，表示分析方法测量的正确性。由于“真实值”无法准确知道，因此，通常采用回收率试验来表示。生物药物分析中，常用标准添加法来计算回收率，即取已准确测定药物含量
4、P (present)的真实样品(如人血浆样品等)，再加入药物标准品已知量 A (added)，混合物作为测定液，其测定值为 M (measured)。测定液要配制成高、中、低三种浓度，每个浓度测定3-5 次，求出每种浓度的平均测定值 M，且 RSD 应符合要求。由于预先要准确测定样品中原含有的药物量 P，因此也应测定 3-5 次，求其平均值 P，且 RSD 应符合要求。回收率 （测定液平均测定值 M - 原样品液含量平均值 P）/ 加入量 A100回收率结果越接近 100表明分析方法准确度越高。生物样品分析时，一般控制回收率范围应为 85-115(样品药浓200ugL)及 80%-120(样
5、品药浓200ugL)。制剂的含量测定时，采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法作回收试验及计算 RSD，还应作单独辅料的空白测定。每份均应自配制模拟制剂开始，要求至少测定高、中、低三个浓度，每个浓度测定三次，共提供 9 个数据进行评价。回收率（平均测定值 M -空白值 B）/ 加入量 A100回收率的 RSD 一般应为 2以内。c检测限(limit of detection，LOD)是指分析方法能够从背景信号中区分出药物时，所需样品中药物的最低浓度，无需定量测定。LOD 是一种限度检验效能指标，它既反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白(本底)值的高低。要根据采用的方法来确
6、定检测限。当用仪器分析方法时，可用已知浓度的样品与空白试验对照，记录测得的被测药物信号强度 S 与噪音(或背景信号)强度 N，以能达到 SN2 或 SN3 时的样品最低药浓为LOD；也可通过多次空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差(即 3 空或 3S 空)作为检测限的估计值。为使计算得到的LOD 值与实际测得的 LOD 值一致，可应用校正系数(f)来校正，然后依之制备相应检测限浓度的样品，反复测试来确定 LOD。如用非仪器分析方法时，即通过已知浓度的样品分析来确定可检出的最低水平作为检测限。d定量限 (limit of quantitation，LOQ)是指在保证具有一定可靠性(
7、一定准确度和精密度)的前提下，分析方法能够测定出的样品中药物的最低浓度。它反映了分析方法测定低药物浓度样品时具有的可靠性。它与上述的检测限的差别在于：定量限要定量测定某一药物在样品介质中的最低浓度，且定量限规定的最低浓度应该符合一定的精密度和准确度的要求。确定定量限的方法也因所用方法不同而异。当用非仪器分析方法时，与上述检测限的确定方法相同；如用仪器分析方法时，则往往将多次空白试验测得的背景响应的标准差(即空白标准差)乘以 10，作为定量限的估计值，继之，再通过分析适当数量已知接近定量限或以定量限制备的样品来验证。e选择性(selectivity)是指在样品介质中有其他组分共存时该分析方法对供
8、试物质准确而专属的测定能力。它与专属性(specificity)的含义稍有不同。专属性是指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号；选择性则可对多种化学成分产生不同响应，而主要成分的响应可与其它响应区分。因此，选择性是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的量度。在药物分析中考察一个分析方法的选择性时，应着重考虑杂质、降解产物、相关化合物以及制剂辅料等其他组分是否对被测药物的测定有干扰。一般，通过添加上述物质的样品与未曾添加的样品所得分析结果进行比较而确定。f线性与范围 (linearity and range)分析方法的线性是在给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力。换句话说，就是
9、供试物浓度的变化与试验结果(或测得的响应信号)成线性关系。所谓线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而且成线性的供试物浓度的变化范围，其最大量与最小量之间的间隔，可用 mgL mgL、 ugml ugml 等表示。线性与范围的确定可用作图法(响应值 Y浓度 X)或计算回归方程(Ya+bX)来研究建立。测定样品时所有生物药物分析方法都必须同时作标准曲线。每次作标准曲线时，方法应与分析方法考核时完全一致。标准浓度应包括一定梯度的 5-8 个浓度(非线性者如免疫分析可适当增加)，每个浓度只需测定一次(免疫分析可测定两次并取均值)；标准曲线应覆盖样品可能的浓度范围，对于含量测
10、定要求一般浓度上限为样品最高浓度的 120，下限为样品最低浓度的 80 (但应高于 LOQ)；目前仍广泛采用相关系数(r)表示标准曲线的线性度、并控制r0.9900。对照品的 LOQ 必须包括在线性范围。g. 耐用性 (robustness)是指利用相同的方法在各种正常实验条件下对同一样品进行分析所得结果的重现程度。所谓各种正常实验条件，包括不同的实验室、不同的分析人员、不同的仪器、不同批号的试剂、不同的测试耗用时间、不同的分析温度、不同的测定日期等等。分析方法重现性的测定是通过在不同实验室由不同的实验者(操作和环境条件虽有差别但仍在规定的分析参数内)对同一样品的分别测试而获得的。h、重现性
11、(ruggedness) 即是指在不同实验室中使用此种分析方法的精密度。是评价其保持不受参数微小变差影响的能力，并可作为正常使用的一个可靠性指标。i. 与参比方法测得结果的相关程度的比较由于生物样品中含有许多干扰测定的杂质，特别是与原型药物相似的代谢物常对药物的测定有影响。因此，除考察选择性外，有时还用参比方法对实际生物样品同时测定并进行比较。比较试验时，取若干份实际样品 (如病人服药后采取的血样)，用一个已证明有相当专属性和可靠性的方法与新建立的方法同时进行测定，以参比方法测得的药浓为横坐标(X)，以新建立方法测得的药浓为纵坐标(Y)作成散布图(scatter diagram)，并求出直线回
12、归方程 (ya+bx)及相关系数 (r)。r 最大值为 1，表示两法完全相关(结果完全吻合)；r0 时，表示两法完全不相关。一般要求两法的相关系数 r095，而相关直线的斜率 (b) 应接近于 1。评价一种分析方法的效能，并不一定对上述各项指标都有要求。一般根据方法的使用对象有所区别。大体上有以下四种情况：A用于原料药中主要组分或制剂中有效组分含量测定的方法：除了检测限和定量限二项指标外，对精密度、准确度、选择性、线性与范围、耐用性等均应有所要求；B用于原料药中杂质测定或制剂中降解产物测定的方法又可分为两种：用于含量测定；用于限度检查。对于法的要求是：除检测限和精密度指标不必要求外，对准确度、选择性、线性与范围、定量限、耐用性等均应有所要求；对于法的要求是：只对检测限、选择性和耐用性三项指标有所要求，其余均无需要 求。C用于溶出度测定的方法及药物释放度测定的方法，只有精密度和耐用性有所要求，其余项目均不作要求。D用于生物样品中药物测定的方法，对精密度、准确度、检测限、选择性、可测线性范围、定量限、对生物样品的耐用性以及与参比方法测得结果的相关程度的比较等指标应有所要求。
