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1、中国医科大学博士学位论文Ap-1基因siRNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移、分化及 细胞外基质的影响姓名：张宏伟申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：张强20080301中文论著摘要A p - 1 基因SiR N A 干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移、分化及细胞外基质的影响目的再狭窄是影响经皮冠状动脉腔内血管成形术( P T C A ) 远期疗效的主要障碍。尽管血管成形术后的再狭窄机制目前尚不十分清楚。，但有很多因素参与，包括血栓形成，平滑肌细胞增值和迁移，血管的弹性回缩，细胞外基质堆积弓| 起的慢性重构。每一环节都是治疗的关键。尸体解剖报告证明再狭窄一定程度上是内膜增生引起的。平滑
2、肌细胞增殖和迁移是动脉壁损伤和动脉粥样硬化的内膜形成的主要机制。中膜的平滑肌细胞有较低的分裂活性，在动脉壁损伤和动脉粥样硬化的早期阶段，各种生长因子刺激动脉平滑肌细胞由收缩型向合成型转变，并开始增殖，引起动脉内膜增厚。平滑肌细胞由收缩型向合成型转变在血管疾病的发生机制中起着关键作用。除生长因子的作用，平滑肌细胞增值和迁移还要求细胞周围的缨脆强基质分解和再塑型，平淤胍细胞合成细胞外基质的重要成分包括胶原，弹力蛋白，蛋白聚糖。在血管介入治疗损伤中，细胞外基质的积聚和分解的失调是内膜增厚的主要原因，基质的再塑型要求蛋白水解酶的活动，其中基质金属蛋白酶( M M P s ) 起着关键作用。M M P
3、2 ，M M P 9 活性在球囊损伤后第7 天可达到高峰，与平滑肌细胞由中层向内膜迁移的时间过程相吻合。有研究显示，A P 1 在球囊动脉损伤中活性明显增加。AP 1 主要圭J u n 弱F os 两大类蛋自质因子家族组成。J u n 亚类中包括e J u n 、J u n B 、J u n D ；F os 亚类中包括c F os 、F os B 、Fr a l 、Fr a 2 等。J u n 亚类成员可以与任何A P 1 家族因子结合形成同源或异源二聚体，或与另外一类含b Z I P 的转录激活因子( A T F ) 家族形成J u n A T F 2 异源二聚体；而F os 亚类只能和J
4、u n 亚类之间形成异源二聚体。A P 1 的D N A 特舜性识别结合序列是只能被二聚体所介导。大量研究显示，艘1 同D N A 亲和力( 或高或低) 位点的存在，可能是莱一特定基因诱导Ap 差结合的重要机制之一。因此，我们通过A P lO D N 或反义C 。J u n 或反义C F o s 来降低AP 1 总的D N A 结合活性抑制平滑肌细胞增生，都取得明姓效果。抑制平滑肌细胞增值的基因治疗作为P T C A 术后减少狭窄的潜在方法。可是，体外用d e c o yO D N 被核酸酶消忧问题没有解决。S t e a l t h 蹦R N A i 克服了这一难题。霹蓠，R N A 于扰是
5、最近发展超来憋一释快速关闭基因的薪方法。撂当细胞孛导入与蠹源性m R N A 编码区阚源的双链R N A ( d s R N A ) 时，该m R N A 发生降解瑟导致蒸因沉默的现象，称为转录后基因沉默。由2 1 - 2 5 个核苷酸组成的小片段干涉R N A 是R N A i 过程中直接起作用的分子，细胞表现出特定缺失的表型。R N A i 对染色体D N A 序列的复制和转录过程不产生任何影响。假设慕因沉默能使A P 1 复合物的活性减弱或丧失。我们设计了大鼠A P l 的s i R N A ，分别在c - J u n 赧c F o s 两个亚基设置靶点，采霹J L i p o f e
6、c t a m 逊e 刑2 0 0 0 事# 隽转染试裁。把A p 。l s i R N A 转染入立营平滑腿绸胞，通过搦翻A P 1 基嚣豹表达，检测V S M C s 靛增蒲、迁移及去分化是否改变，衄清刺激对A P 一1 基因沉默的V S M C s 的作用有无相应的变化。方法l 、采用组织块贴壁法行大鼠平滑肌细胞原代细胞培养，倒置显微镜下观察其形态小鼠抗大鬣旺S M a c t i n 单克隧抗体免疫荧光鉴定。2 、s i R N A s 壹美国I n v i t r e g e n 公司设计合藏3 对S t e a l t h t M s i R N A , 。弱露合成与A P 。l
7、基因序列无关的s i l 越N A 作涛阴性对照( n e g a t i v ec o n t r 0 1 ) 。把特异性s i R N A 序列输入N C B I 数据库进行比较( B l a s t ) ，与其他基因和E S T 序列没有同源性。实验设置未转染组、阴性s i R N A 组及阳一t 生( A P 1 + A 、A P I + B 和A P 1 十C ) s i R N A 组。使用L i p o f e c t a m i n e T M2 0 0 0 ，转染A p 1 s i R N A 入平滑肌细胞。3 、甭R T - P C R 方法检测A P 1 及下游基因斡m
8、R N A 的表达，W e s t e m b l o t 方法检测e 韵s 帮e 。J u n 及A P 。l 下游基因的蛋鑫瓣表达, T r a m A M 方法捡 A P 1 活性，4 、应用P C N A 和M T T 法检灏l J V S M C s 增殖的变化；流式细胞仪检测细胞周期；期T r a n s w e l l 和刮痕实验方法检测平滑肌细胞迁移情况，5 、用R T P C R 方法检测S M aa c t i n 的m R N A 的表达，W e s t e m b l o t 方法检测S M 。娃a e t i n 的蛋皂的表达，免疫荧光共聚焦显微镜( O l y m
9、p u sF V - 5 0 0 ) 下观察平滑肌缨胞分化情瑟。26 、用R T P C R 方法检测M M P 2 、T I M P 2 的m R N A 的袭达，W e s t e m b l o t 方法检测M M P 2 和u P A 的蛋白的表达，明胶酶谱分析M M P 。2 和M M P 9 活性。结果差、阳性A P - 1 Bs i R N A 转染惹的V S M C s 的A P - l r r d q N A 霸f l e J u n , c - F o s 表达量显著降低，其余2 个露性转染组熬艘。l 表达量与未转染组及阴性s i R N A 转染组差异不显著，A P 1
10、活性降低。A P i 斗鹊s i R N A 的抑制效果最显著，故选择第A P 1 Bs i R N A作为阳性s i R N A 干预实验。2 、A P 1 + Bs i R N A 组的增殖活性明显低于未转染组和阴性s i 鼬妊干扰组。提示A P 1 基因沉默后V S M C 增娥能明显受到抑制，A P 1 + 8s i R N A 转染后V S M C s的P C N A 阳性染色率较来转染缀释阴性s i R N A 缰均显著下降( P 00 5 ，图5 ) 。阴性s i R N A组c - J u n c - F o s 表达量与未转染组问差异无显著性( P ) 00 5 图5 ) 。
11、表明转染特异性s i R N A 后在蛋白水平上品著地抑制c - J u n p F o s 基因表达。符合A 口1 m R N A 表达结果，表明A P l + B s i R N A 组抑制效果虽有效。12345- - - e - - F 0 8- 一- - e - J u n圈5 ，c _ J t m , c F o s 蛋白表达W e s t e m b l o t 分析 1 ：未转染照组，2 ：阴性s i R N A 转染组；3 ：A P I 十As i R N A 转染组；4A P 一1 + B s i R N A 转染组：5 ：A P 1 + Cs i R N A 转染组六、E
12、L l s 定量检测A P 一1 活性用A P Is i R N A 转染平滑肌细胞后，用E L I S A 定量法测得A P 1 活性。A P - 1 +B 组下降明显，与未转染组对比，下降7 06 ( p 00 5 ) 。( 图6 ) 。来转染蛆与阴性s i R N A 组比较：* P O0 5 ，与A P - 1 + B s i K N A 组比较4p ( O0 11814霉12未转染组g P 一1 + B s i R N A 组阴1 陛s i R N A 组图6 ，E f f e c t so f A P 一】s i R N AO nt h eD N A B i n d i n gA
13、c t i v i t yo f A P七、M T T 比色法检测结果M T T 检测结果转染A P I + B s i R N A 后V S M C 的增殖受到显著的抑制，A P 一1 + B s i R N A i 组的吸光度在2 4 h ，4 8 h 和7 2 h 为未转染组的4 74 士54 8 ，3 86 土46 9 和3 19 土48 7 ( P O0 5 ，与A P I + B s i R N A 组比较，p 00 5 ) 见( 图8 D ) ，表2 。图8 A V S M C s 静息状态( 饥饿2 4 h ) V S M C s 大部分停留在G 。G 期V S M C s 大
14、部分进入S 期和G ：M 期图8 c ，转染A P 一1 + B s i R N A ( I V 组) V s 眦s 大部分被阻滞在G G 期图8 D ，转染阴性A P1s i R N A ( I I 组) V S M C s 大部分进入S 期和G ：肺期表2 ，A P 一1 + B s i R N A 转染对V S M C 细胞周期的影响( z s ，n = 6 )C r o u pO d O ,G 2 G MS未转染组4 35 9 62 l3 8 1 04 75 26 0 76 9 阴性s i R N A 组4 3l O 54 5A P I + B s i R N A 组7 02 4 1
15、01 947 3 06 195 5 l3 65 2 1 7 87 42 02 1 38 2讨论P C I 术是目前解决缺血心肌再灌注的主要措施，但导管在血管内的操作将不可避免地造成内皮的损伤，内皮损伤后，各种转录调节基因随之激活，女I A P - I i i 川，平滑肌细胞， 始增殖并分泌细胞外基质，形成增厚的新生内膜。阻断这些转录调节基因的表达，以抑制平滑肌细胞的增殖，减轻内膜的增生I l 引，达到阻止再狭窄的目的。A P 1 是细胞内重要的转录因子，可与某些D N A 结合，影响D N A 复制的启动过程或对转录进行调控从而调节细胞生长、增殖和分化。研究表明，A P - 1( a c f
16、i v a t o r p r o t e i n - 1 ，激活荆蛋白1 ) 是指一类能与许多基因上的A P 一1 位点 佛波酯应答元件( T R E ) 1 结合，而在细胞中发挥多种重要作用的蛋白质家族因子”。作为反式作用因子，它们能直接或间接地识别或结合在同一顺式作用元件8 1 2 b p 核心序列上，参与调控靶基因转录效率，从而在基因转录调控中有重要作用【1 q 。A P 一1 属于基本亮氨酸拉链蛋白家族，由J u n ( 争J u n 、J u a B 和J u n D ) F o s ( - F o s 、F o s B 、F r a l 和F r a 2 )M a f ( c M a f M a f B 、M a f A 、M a f K 和N r l ) 或A T F ( A T F 2 、L R F l L R F 3 、B - A T F
