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1、中山大学硕士学位论文利福平抑制-突触共核蛋白聚集作用的实验研究姓名：徐杰申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：陶恩祥20060401利福平抑制a 突触共核蛋白聚集作用的实验硝f 究中文摘要利福平抑制Q 突触共核蛋白聚集作用的实验研究一研究背景专业：神经病学硕士生：徐杰导师：陶恩祥教授摘要帕金森病( P a r k i n s o n Sd i s e a s e ，P D ) 是一种常见于中老年人的中枢神经系统变性疾病，主要病理改变为黑质一纹状体多巴胺能神经元进行性变性、死亡，同时伴随残存神经元内出现嗜酸性包涵体( 路易小体，L e w y d , 体) ，纹状体多巴胺含量降低。a 突触共
2、核蛋白( o s y n u c l e i n ) 聚集形成的不溶性纤维积聚物，是构成路易小体( 帕金森病主要病理特征) 主要成份；并且随着对帕金森病的深入研究，在其病因及发病机制方面己取得了很大的进展。越来越多的证据显示，可溶性。一s y n u c l e i n 向异常纤维状的q s y n u c l e i n 转化是帕金森病发病机制的关键环节，是帕金森病各种诱发因素的共同通路。研究表明，在基因突变及环境因素协同作用下，多巴胺能细胞内n s y n u c l e i n发生错误折叠和聚集，导致细胞内多巴胺浓度提高，进而引起氧化应激反应。ns y n u c l e i n 的聚集
3、亦能影响泛素一蛋白酶体系统对其降解，进一步造成大量的。一s y n u c l e i n 的聚集并形成细胞内包涵体，影u 向细胞正常功能及代谢，从而引起细胞死亡，导致帕金森病。目前帕金森病新的治疗方法有外科手术、脑深部电极高频刺激、基因治疗、神经干细胞移植等，但疗效均未有很大突破，大多数病人仍需药物治疗。外源性左旋多巴是最有效的抗帕金森病药物，但只能控制症状而无法阻止疾病的进展，利福平抑制“突触共梭蛋白聚集作用的实验研究中文摘要并且长期使用左旋多巴会引起一些症状波动、运动障碍和精神异常等并发症，其中尤其是开一关现象、异动症等并发症使患者及其家属产生畏惧感。因此，寻找一种能够阻止疾病进展的药物
4、，将为帕金森病的治疗带来新的希望。利福平( r i f a m p i c i n ，R F P ) 是半合成利福霉素的衍生物，为广潜抗生紊，是诺卡氏菌的发酵产物，在临床应用已久，为抗结核的主要药物之一。另可用于麻风病治疗，并且随着药理学和药效学研究的深入开展，利福平的应用己越来越广泛。流行病学研究显示，服用抗麻风病药物利福平或氨苯砜几年的麻风病人，其老年性痴呆的患病率明显减低，推测抗麻风药物可能有抑制口淀粉样蛋白f 口- a m y l o i d AB ) 聚集的作用。并有大量研究表明利福平有抑制B 淀粉样蛋白聚集的作用，但具体的机制仍不清楚，推测利福平可能作为种自由基清除剂起作用。由。一
5、s y n u c l e i n 及其碎片聚集形成的病理性包涵体除存在于帕金森病外，还存在于老年性痴呆患者的老年斑中，而且o s y n u c l e i n 与1 3 一淀粉样蛋白共同的结构特点以及它们之间的相互作用，提示了帕金森病和老年性痴呆病理过程的相似性。另据美国加州大学生化部的生化物理实验研究结果显示，抗生素利福平以浓度依赖的形式抑制。一s y n u c l e i n 纤维形成，使其现有的纤维解聚。该研究的结果是令人兴奋的，因为阻l E 了。一s y n u c l e i n 的聚集，就有可能阻止帕金森病的进展，而使已经聚集的a - s y n u c l e i n 纤维
6、解聚，甚至有可能使疾病逆转。但目前围内外尚未见到利用细胞和动物模型来验证这一结论。我们利用1 一甲基- - 4 - - 苯基一吡啶离子( M P P + ) 诱导P C I 2 细胞大量表达s y n u c l e i n ，并产生聚集，观察利福平抑制a - s y n u c l e i n 聚集的作用，为进一步动物实验及其应用于帕金森病的临床治疗提供初步实验依据。二研究目的1 构建大量表达Q - s y n u c l e i n 并产生聚集的帕金森病细胞模型。2 明确利福平对帕金森病细胞模型有保护作用。3 探讨利福平具有抑制。一s y n u c l e i n 聚集的作用。4 为进一
7、步动物实验及应用于帕金森病的临床治疗提供依据。利福平抑制叶突触共核蛋白聚集作用的实验研究中文摘要三实验对象和方法1 细胞株P C I 2 ：大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞株。2 细胞培养及药物处理P C I 2 细胞置于D M E M F 1 2 培养基中进行培养，每隔4 8 h 换培养液，当单层培养细胞汇合以后，传代培养。将P C I 2 细胞传入9 6 或6 孔培养板中，待细胞进入对数生长期后加药，加入不同剂量的利福平，利福平溶解于甲醇中，使终浓度分别达到0 、1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 “m o l L ，2 h 后分别加入M P P + ，终浓度为1 m m o l L ，以
8、上剂量用于所有实验。实验分为6 个组：( 1 ) 正常对照组；( 2 ) 0 m o l L 利福平& M P P + ( M P P + 组) ；( 3 )1 0 0 p m o l L 利福平& M P P + ；( 4 ) 2 0 0 J r n o l L 利福平& M P P + ；( 5 ) 3 0 0 m o l L 利福平& M P P + ；( 6 ) 等体积甲醇& M P P + 组六组。3 研究方法( 1 ) 四甲基偶氮唑盐法( M T T ) 检测干预4 8 h 后每孔加入2 1M T T ，3 7 。C 、5 C 0 2 培养箱内培养4 h ，弃液，每孔加入1 5 0
9、 p JD M S O ，振荡仪振荡1 0 m i n ，至晶体颗粒溶解，在酶标仪上测定5 9 5n e f f 的吸光度。( 2 ) W e s t e r nB l o t 免疫印记检测a s y n u c l e i n 的表达干预4 8 h 后，细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白；B C A 1 0 0 蛋白质定量测定试剂盒测定样品总蛋白含量；每泳道加总蛋白2 0 p g 进行S D S - P A G E 凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭3 h ，一抗孵育4 孵育过夜，与辣根过氧化物酶标记二抗室温下孵育l h ，X 线胶片曝光1 1 0m i n ，显影、定影，图像分析
10、处理。( 3 ) 流式细胞仪检测细胞凋亡P C I 2 细胞接种于6 孔培养板中，培养4 8 h 后干预处理，继续培养4 8 h 后P B S漂洗，加入A n n e x i nV o F I T C 和P I 染液重悬细胞，室温避光温育1 0 分钟，H E P E S洗涤后过滤上机检测，分析结果。利福平抑制a 突触共棱监白聚集作用的实验研究中文摘要4 统计学处理结果以均数标准差表示。两组间均数比较采用两独立样本的t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。数据采用S P S S I O 0 统计软件包分析，P O 0 5 无差异。( 见表2 1 、图21 )2 2W e s t e r n b
11、l o t 免疫印记检测s y n u e l e i n 显示通过W e s t e r n b l o t 免疫印记法检测o s y n u c l e i n 的结果显示，M P P + 能够促进一s y n u c l e i n 的表达并聚集形成三聚体，利福平( 1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 1 t m o l L ) M P P +组各浓度组n s y n u c l e i n 的表达及聚集均较空白对照组及M P P + 处理组降低，并且随着利福平的浓度增加，蛋白的表达量逐渐减少，甲醇& M P P + 处理组的qs y n u c l e i n 的表达亦较对照组增加
12、，与M P P + 处理组无差异。( 见图2 - - 2 )2 3 流式细胞仪检测凋亡结果显示利用磷脂酰丝氨酸外翻分析法，通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况结果显示：空白对照组存活细胞为8 8 4 5 1 6 7 、M P P + 处理组存活细胞为2 5 4 2 2 1 7 、甲醇& M P P + 处理组存活率细胞为1 8 6 2 3 5 1 、而利福平( 】0 0 、2 0 0 、3 0 0 I t m o l L ) & M P P + 各组的存活细胞为2 9 2 8 2 ，1 、6 4 5 5 O 9 6 、6 6 8 3 2 5 8 ；空白对照组、M P P + 组、甲醇& M P P
13、+ 及利福平( 1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 I _ t m o l L ) & M P P + 各组的细胞凋亡率分别为1 0 6 3 O 9 8 、6 7 3 5 l ，7 2、7 4 7 4 1 8 5 、6 3 4 5 1 _ 2 4 、2 7 ，0 1 2 7 4 、2 2 - 3 5 2 9 ，M P P +利福平抑制1 1 - 突触共核蛋白聚集作用的实验研究实验结果处理组较空白对照组细胞凋亡率明显增加，而利福平M P P + 各组随着利福平浓度的增加，细胞凋亡率随之降低，甲醇& M P P + 组的细胞凋亡率较M P P + 处理组降低。( 见表2 - - 3 、见图2
14、- - 3 1利福平抑制q 一突触共核蛋白聚集作用的实验研究讨论3 讨论3 1M P P + 对多巴胺能细胞的影响在实验中我们观察到M P P + 对多巴胺能细胞具有毒性作用，降低细胞活性，并诱导多巴胺能细胞凋亡坏死，我们用l m MM P P + 处理细胞，细胞活性较空白对照组细胞活性下降约3 0 ，流式凋亡细胞检测细胞的早期凋亡率约为1 0 3 3 ，晚期凋亡坏死率为5 7 0 3 ，分别较空白对照组约提高8 _ 8 1 和4 7 ，9 。1 甲基4 苯基一吡啶离子( M P P + ) 是1 一甲基一4 一苯基一l ，2 ，3 ，6 一四氢毗I 症( M P T P ) 的代谢产物。M
15、P T P 发现于2 0 世纪8 0 年代，具有特异性的神经毒性作用，能导致人类及多种动物出现帕金森病的症状和病理改变，目前常用于建立帕金森病动物模型。实验发现M P T P 对小鼠多巴胺系统的损害程度与纹状体内M P P + 浓度直接相关。给予M A O B 抑制剂，可以明显拮抗M P T P 导致的小鼠纹状体多巴胺水平的降低。直接在大鼠纹状体或内侧前脑束注射M P P + ，可以产生与M P T P 相同的毒性作用，但不被M A O B 抑制剂所阻断 3 9 , 4 0 3 。因此，M P T P在体内是被代谢分解为M P P + 而起作用。通过对M P T P 的深入研究发现M P T
16、P 是哌替啶的一种衍生物，它本身没有细胞毒性，但具有高度脂溶性，极易透过细胞膜。在体内很快进入细胞，先在神经胶质细胞内由单胺氧化酶B ( M A O B ) 氧化为其活性产物M P P + ，后者被多巴胺神经元经多巴胺转运体摄取，在细胞质中M P P + 主要集中在线粒体阻碍呼吸链复合物1 的活动，导致能量代谢障碍，C a ”内流，使活性氧R O S 和一氧化氮( N O )增多，引起D N A 、蛋白质和脂质的氧化损害H ；另外线粒体功能障碍可导致细胞色素C 从线粒体内释放至胞浆，激活天冬半胱氨酸蛋白酶c a s p a s e ，从而激发细胞凋亡的蛋白酶级联反应，最终导致多巴胺能神经元的死亡”。另外M P P +还对囊泡单胺转运体2 ( V M A T 2 ) 具有高度亲和力，能与之结合并被转运至多巴胺能神经元的
