《siRNA阻断PPARγ基因表达预防激素性股骨头坏死的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《siRNA阻断PPARγ基因表达预防激素性股骨头坏死的实验研究（166页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、At h e s i ss u b m i t t e dt oZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yf o rt h eD e g r e eo fD o c t o rA ne x p e r i m e n t a ls t u d yo nt h ep r e v e n t i o no fs t e r o i d i n d u c e dI s t e o n q ：r o s i so ff e m o r a lh e a db ys i R N n h i b i t i n 9 0 s t e o n e c r o S i Sr e
2、m o r aA | n h删e x p r e s s i o no fP P A R 7g e n eB yM i n gL I l l一一S u p e r v i s o r ：P r o f Y i s h e n gW a n gD e p a r t m e n to fO r t h o p e d i c sT h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yJ a n 2 0 1 2学位论文使用授权声明1 1 1 11 11 111 11 1 1I I
3、II IU I Y 2 10 4 13 0，独立进行研任何其他个人献的个人和集E l本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者冽一刍日期：历见年月E l博士研究生：刘鸣导I ) i l
4、 i 王义生教授专业外科学( 骨科)激素性本课题为国家自然科学基金( 8 1 0 7 1 5 2 0 ) 资助项目郑州大学第一附属医院骨科骨头坏死的实验研究导师王义生教授郑州大学第一附属医院骨科河南郑州4 5 0 0 5 2中文摘要激素性股骨头坏死( o s t e o n e c r o s i so ft h ef e m o r a lh e a d ，O N F H ) 为骨科的一种常见疾病，患者数量逐年增多，在未经有效治疗者中约8 0 将发生股骨头塌陷，关节功能受损毁坏，有极高的致残率且缺乏有效防治方法，多数患者只得接受人工髋关节置换等手术治疗，O N F H 的治疗和预防成为骨科领
5、域的一项世界性难题。过氧化物酶体增殖子活化受体吖( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r a c t i v a t e dr e c e p t o r - - q , ，P P A R T ) 属于细胞核激素受体家族成员，是一种成脂转录因子，主要在脂肪组织中参与脂肪细胞的分化，是诱导脂肪细胞分化的特异性转录因子。它在脂肪分化中表达，但在前脂肪细胞中不表达，并比大多数脂肪基因先表达，前脂肪细胞没在有P P A R T 时很难分化为脂肪细胞。细胞学研究和动物实验表明，激素可诱导兔、人骨髓间充质干细胞内成脂转录因子P P A R Tm R N A
6、的高表达，诱导这些细胞大量成脂分化，并抑制其成骨分化，导致股骨头内脂肪生成增多、成骨减少，股骨头骨细胞内脂质沉积而脂肪变性死亡，最终发生骨坏死，说明P P A R T 是激素性骨坏死发病的重要靶基因。由此推断，若能阻断P P A R T 的基因表达，可以阻止激素诱导M S C s 成脂分化，有可能预防激素性股骨头坏死的发生。本研究采用目前较 成熟的R N A 干扰( R N A i n t e r f e r e n c e ，删) 技术，使用一种新型的腺病毒载体系统构建出针对P P A R T 这一可以导致激素性股骨头坏死的重要致病靶基因的s i R N A 腺病毒载体。将重组P P A R
7、 T s i R N A 腺病毒感染家兔体外M S C s 和活体股骨头内M S C s ，通过使用细胞学、分子生物学、生物化学和组织学等多种检测方法对s i R N A 腺病毒预防激素性股骨头坏死的作用效果进行观察。为在致病的始发中文摘要始环节预防激素性股骨头坏死提供可靠的科学依据。第一部分：P P A R ys i R N A 腺病毒穿梭载体的构建和重组腺病毒的制备l 方法依据s i R N A 片段的设计原则和G e n B a n k 中兔P P A R 7 基因( N M 0 0 1 0 8 2 1 4 8 )序列筛选设计出3 条针对P P A R y 的s i R N A 的特异性
8、靶序列和1 条无关对照序列，并合成相应的发卡R N A ( s h R N A ) 寡核苷酸引物，两端分别加入X h oI 和S p eI 的酶切位点。将合成的3 对互补寡核苷酸引物( P P A R T 9 7 1 1 、P P A R T 9 7 1 2 、P P A R T - 1 2 5 3 1 、P P A R 7 - 1 2 5 3 2 、P P A R y 一1 3 6 7 1 、P P A R y - 1 3 6 7 - 2 ) 以及对照序列引物分别进行退火反应。然后利用胶回收试剂盒将四个P P A R ys h R N A 和对照s h R N A 退火产物回收纯化，再将回收
9、片段重组入腺病毒穿梭载体( s h u t t l ev e c t o r1 0 C M V ) ，转化入感受态细菌D H 5 a ，提取阳性菌落，提取质粒，并进行酶切和测序鉴定，从而得到正确的重组腺病毒穿梭载体：s h u t t l ev e c t o r1 0 C M V - 9 7 1 ，s h u t t l ev e c t o r1 0 C M V - 1 2 5 3 ，s h u t t l ev e c t o r1 0 C M V - 1 3 6 7 ，s h u t t l ev e c t o r1 0 C M V - C o n 。利用质粒提取试剂盒提取上述鉴定成
10、功的重组腺病毒穿梭载体质粒，并使用紫外分光光度计测定浓度。然后将其和腺病毒骨架载体质粒酶切线性化，并利用L i p o f e c t a m i n e T M2 0 0 0 将线性化的穿梭质粒和腺病毒骨架质粒转染至培养好的H E K 2 9 3 细胞中，4 5 天观察有8 0 以上C P E 形成时收集腺病毒液，同时再次感染H E K 2 9 3 细胞扩增腺病毒，最后使用腺病毒纯化试剂盒纯化，最终得到四种重组腺病毒：a d e n o1 0 C M V - 9 7 1 ，a d e n o1 0 C M V 1 2 5 3 ，a d e n o1 0 C M V - 1 3 6 7和a d
11、 e n o1 0 一C M V - c o n 。同时利用空斑分析法( P l a g u eA s s a y ) 测定腺病毒液的滴度。2 结果2 1 过氧化物酶增殖子活化受体吖s i R N A 腺病毒穿梭载体的构建结果显示s i R N A 单链寡核苷酸退火后，电泳可见明亮的靶条带；将退火产物克隆入s h u t t l ev e c t o r1 0 C M V 得至l J s h u t t l ev e c t o r1 0 C M V - 9 7 1 ，s h u t t l ev e c t o r1 0 - C M V - 1 2 5 3 ，s h u t t l ev e
12、 c t o r1 0 C M V - 1 3 6 7 ，克隆得到的重组质粒经酶切鉴定显示正确条带，测序鉴定证实插入序列与设计序列完全一致。化后的腺第二部分：s i R N A 腺病毒阻断激素诱导兔M S C s 内P P A R l f 表达的实 验研究1 方法7选取新西兰大白兔处死后取骨髓，制备兔M S C s 。实验分为6 组，干扰1 、2 、3 组( s i R N A l ，S 1 、s i R N A 2 ，S 2 、s i R N A 3 ，S 3 ) ：激素诱导同时感染兔P P A R T基因的s i R N A 腺病毒( a d e n o1 0 C M V 9 7 1 ，a
13、 d e n o1 0 一C M V - 1 2 5 3 ，a d e n o1 0 C M V 1 3 6 7 ) ；无关s i R N A 组( C o n t r o l1 ，C o n ) ：激素诱导同时感染无关对照的s i 砌悄腺病毒( a d e n o1 0 C M V c o n ) 。模型组( M o d e l ，M ) ：单纯激素诱导；空白对照组( N o r m a l ，N ) ：未作特殊处理的M S C s ；将制各的第二代M S C s 接种子6 孔培养板中，在每孔加病毒1 x 1 0 5 1 U ，感染1 2h 后换完全高糖D M E M 培养基，同时在需要激素
14、诱导的各组中加入激素，激素终浓度为1 0 7 m o l L ，进行诱导。在以后的培养中，换液时对需要激素诱导的各组均加入激素，激素终浓度均保持在1 0 。7 m o l L 。每日倒置显微镜观察M S C s 的形态及生长情况。在激素诱导1 、3 、5 、7 天时，采用T a q M a nR T - P C R 和W e s t e r n b l o t 方法分别 检测各组M S C s 内P 脚m R N A 、o s t e o c a l c i nm R N A 、R u n x 2m R N A 以及P P A R T 、o s t e o c a l c i n 、R u n
15、 x 2 蛋白表达水平。在激素诱导1 4 天时，用相应试剂盒检测M S C s骨钙素分泌量、细胞的甘油三酯( t r i g l y c e r i d e ，T G ) 含量和碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h m a s e ，A L P ) 活性；在激素诱导2 1 天时用苏丹I I I 对培养的M S C s 染色，进行脂肪细胞计数。2 结果中文摘要对照组差异有统计学意义( P O 0 5 ) 。2 4M S C s 的成骨分化碱性磷酸酶活性及培养液中骨钙素含量检测结果：在实验第1 4 天检测细胞内碱性磷酸酶活性及培养液中骨钙素含量，与空白对照组比较，无关
16、s i R N A 组、模型组中碱性磷酸酶活性均降低、培养液中骨钙素含量减少，差异有统计学意义( P O 0 5 ) 。第三部分：s i R N A 腺病毒预防兔激素性O N F H 的动物实验研究1 方法选取健康新西兰大白兔4 8 只，雌雄不拘，2 3 月龄，体重2 5 O 5 k g 只。随机分4 组，每组1 2 只。空白对照组( N 组) ：每次臀肌注射2 m L 生理盐水，连续注射3 天：模型组( M 组) ：每次臀肌注射地塞米松2 0 m g k g ，连续注射3 天；干扰组( S组) ：给予大剂量激素，每次臀肌注射地塞米松2 0 m g k g ，连续注射3 天。并于实验I V中文摘要1 、3 、6 周的第1 天，随机选择侧别，取重组病毒滴液2 耻l ( 台 3 x 1 0 9I U ) 注入动 物一侧股骨头内；无关s i R 蝴( C o n 组) ：同法同量注射激素，同法将无关s i R N A组病毒滴液注入动物一
