《慢病毒介导的Bcl2基因RNAi联合TRAIL基因共表达对淋巴瘤细胞生长作用研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《慢病毒介导的Bcl2基因RNAi联合TRAIL基因共表达对淋巴瘤细胞生长作用研究（132页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、At h e s i ss u b m i t t e dt oZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yf o rt h ed e g r e eo fD o c t o rT h eE f f e c t so fL e n t i v i r u s - - M e d i a t e dC o e x p r e s s i o no fT R A I La n ds h R N Aa g a i n s tB c l - - 2o nt h eG r o w t ho fL y m p h o m aCe l l sB yX u d o n gZ h a
2、 n gS u p e r v i s o r ：P r o f M i n g z h iZ h a n gD e p a r t m e n to fO n c o l o g yT h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yM a y2 0 1 2原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已
3、在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。靴做储。祆想系汐人9b 可、日期) 厂月可日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑卅I 大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：涿瑚泵F 1 物抄年月
4、穸日中文摘要慢病毒介导的B c l 2 基因R N A i 联合T R A I L 基因共表达对 淋巴瘤细胞生长作用研究博士研究生张旭东导师张明智教授郑州大学一附院肿瘤科河南郑州4 5 0 0 5 2摘要肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - r e l a t e da p o p t o s i si n d u c i n gl e g a n d ，T R A I L ) 是近年发现的具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常 细胞没有毒性的肿瘤坏死因子家族成员。T R A I L 可与胞膜死亡受体D R 4 、D R 5结合
5、来激活死亡受体通路，继而通过线粒体通路和非线粒体通路引起肿瘤细胞凋亡。以T R A I L 为基础的肿瘤治疗策略已应用于临床试验，越来越多证据表明T R A I L 在肿瘤治疗方面具有很大潜力和诸多优势。但单独应用T R A I L 治疗血液系统肿瘤存在一定局限性，因为在血液系统恶性肿瘤中，常常因P 5 3 基因突变和B 细胞淋巴瘤2 ( Bc e l ll y m p h o m a - 2 ，B c l 2 ) 基因的高表达等因素，导致肿瘤 细胞对T R A I L 敏感性下降，并诱导血液系统恶性肿瘤对T R A I L 的耐药。B c l 一2基因最初是在非霍奇金滤泡状B 细胞淋巴瘤中分
6、离出来的，是B c l 2 家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子，主要分布在淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、肠癌、前列腺癌、白血病等恶性肿瘤中，通过与B c l 2 家族的促凋亡蛋白形成异源二聚体，维持促凋亡成员在细胞内的定位分布，保护细胞不进入凋亡程序。我们猜想T R A I L 的高表达和B c l 2 低表达可能对于抑制肿瘤细胞生长具有协同作用。首先，T R A I L 和B c l 2 在肿瘤细胞凋亡途径的机制不同，T R A I L 能够结合细胞表面的死亡受体，激活外源性途径进而激活C a s p a s e 8 ，剪切B H 3 结构域凋亡诱导蛋白( B c l 2h o m o l o g y3
7、i n t e r a c t i n gd o m a i nd e a t hp r o t e i n ，B I D ) ，增强线粒体途径细胞凋亡信号；B c l 2 蛋白导致线粒体膜电位的丢失和通透性增加，从而引起细胞凋亡。另外，许多研究已经证明肿瘤细胞对化疗药物和放疗I中文摘要的耐药性与B c l 2 高表达有关，同时，B c l 2 的表达下调可以增加肿瘤细胞对药物凋亡诱导的敏感性。近年来慢病毒载体己成为转基因操作中重要的工具，它具有转移基因容量大、转导效率高以及可将外源基因整合至靶细胞基因组实现外源基因持续稳定表达等特点，已被广泛应用于包括淋巴瘤在内的多种肿瘤的研究。因此，本课题
8、利用慢病毒载体和R N A i 技术，构建了同时高表达外源基因和s h R N A 表达盒的重组慢病毒载体，实现了对T R A I L 和B c l 2 基因的同步调控；同时还评价了所构建的重组慢病毒系统感染不同来源( N K 细胞、B 细胞和T 细胞) 淋巴瘤细胞的效率，鉴定了对T R A I L 和B c l 2 基因的调控能力。通过对淋巴瘤细胞生长抑制、凋亡诱导作用以及旁观者效应的研究，深入探讨了T R A I L和B c l 2 基因对淋巴瘤细胞的生长作用以及协同抗肿瘤效应，探索了淋巴瘤治疗新模式。实验目的：构建共表达B c l 2 s h R N A 和T R A I L 基因的慢病
9、毒载体系统，评价重组慢病毒系统对不同来源淋巴瘤细胞的感染效率，鉴定此重组慢病毒系统下调B c l 2 基因和上调T R A I L 基因表达的功能。研究慢病毒介导的B c l 一2 基因R N A i 联合T R A I L 基因表达对于淋巴瘤细胞生长抑制、凋亡诱导作用，评价B c l 2 基因表达下调和T R A I L 表达上调抗淋巴瘤生长的协同效应，探索携带T R A I L 基因和B c l - 2s h R N A 的重组慢病毒对淋巴瘤细胞的旁观者效应。主要内容：第一部分：慢病毒表达载体p W P I t r a i l b c l 2 s h R N A 的构建方法：1 将b c
10、l 2 s h R N A 寡核苷酸片段退火，产物插入p L L 3 7 慢病毒表达载体m U 6 启动子下游，筛选阳性菌落，构建p 1 1 b c l 2 s h R N A 慢病毒表达载体。I I中文摘要2 提取人胎盘组织总R N A ，R T P C R 扩增T R A I Lc D N A ，克隆至p G M T克隆载体，筛选阳性菌落，酶切及测序鉴定p G M T t r a i l 的构建；将T R A I L 基因从p G M T t r a i l 克隆载体上切下，并克隆至p W P I 慢病毒表达载体E F 1Q 启动子下游( I R E S G F P 上游) ，筛选阳性菌落
11、，构建p W P I t r a i l 慢病毒表达载体。3 从p 1 1 b c l 2 s h R N A 质粒上获取m U 6 b c l 2 s h R N A 表达盒，克隆至p W P I t r a i l 质粒E F l Q 启动子上游，筛选阳性菌落，构建p W P I t r a i l b c l 2 s h R N A 慢病毒表达载体。结果：1 酶切鉴定及测序显示p l l - b c l 一2 - s h R N A 慢病毒表达载体构建成功。2 酶切鉴定及测序显示p G M - T t r a i l 构建成功；酶切鉴定显示p W P I - t r a i l慢病毒表达
12、载体构建成功。3 酶切鉴定显示p W P I - t r a i l b c l 一2 - s h R N A 慢病毒表达载体构建成功。第二部分：重组慢病毒l e n t i t r a i l b e l 2 s h R N A 的制备和感染淋巴瘤细胞效率测定方法：1 使用p W P l ( p L L 3 7 ) v s v g 68 0 慢病毒包装系统，在2 9 3 T 细胞中包装慢病毒l e n t i b c l 2 s h R N A 、l e n t i t r a i l 和l e n t i t r a i l b c l 2 s h R N A , 将粗提液用超速离心法浓缩
13、纯化；利用绿色荧光蛋白( G F P ) 表达测定慢病毒滴度。2 利用荧光计数和流式细胞仪测定重组慢病毒l e n t i b c l 2 一s h R N A 、l e n t i t r a i l 和l e n t i t r a i l b c l 2 s h R N A 对不同淋巴瘤细胞( 人滤泡B 淋巴瘤细胞系D O H H 2 ，人T 细胞淋巴瘤细胞系J u r k a t 和人N K 细胞淋巴瘤细胞系Y T S ) 的感染效率，评价不同淋巴瘤细胞株对慢病毒的敏感性。结果：1 成功包装出三种重组慢病毒l e n t i b c l 2 s h R N A 、l e n t i t
14、 r a i l 和l e n t i t r a i l b c l 2 s h R N A ，纯化浓缩后的滴度可达1 0 9 I F U m l 。I I I中文摘要2 重组慢病毒l e n t i b c l s h R N A 、l e n t i t r a i l 和l e n t i t r a i l b c l 2 s h R N A 可有效感染淋巴瘤细胞株，感染滴度较小时( M O I 1 0 ) ，重组慢病毒对不同淋巴瘤细胞感染效率无明显差别( 尸 O 0 5 ) ，但在感染滴度较大时( M O I 1 0 ) ，重组慢病毒对Y T S 细胞的感染效率较其他两种细胞高(
15、氏O 0 5 ) ，但对于三种淋巴瘤细胞，重组慢病毒的感染效率最终进入平台期，部分淋巴瘤细胞始终不能被有效感染。第三部分：重组慢病毒l e n t i t r a i l b c l 2 s h R N A 功能测定和抗淋巴瘤生长作用研究方法：1 重组慢病毒l e n t i t r a i l b c l 2 s h R N A 感染淋巴瘤细胞( 人滤泡B 淋巴瘤细胞系D O H H 2 ，人T 细胞淋巴瘤细胞系J u r k a t 和人N K 细胞淋巴瘤细胞系Y T S ) ，R T P C R 测定B c l 2 和T R A I Lm R N A 表达情况，W e s t e r n
16、b l o t 测定B c l 2 和T R A I L 蛋白表达情况。2 M T T 法测定重组慢病毒l e n t i b c l 2 s h R N A 、l e n t i t r a i l 和l e n t i t r a i l b c l 2 s h R N A 对于不同淋巴瘤细胞的生长抑制作用，评价b c l 2 s h R N A 和T R A I L 的协同抗淋巴瘤生长作用。3 采用F l o wc y t o m e t r y ( F C M ) 检测重组慢病毒l e n t i b c l s h R N A 、l e n t i t r a i l和l e n t i t r a i l b c l 2 s h R N A 对人淋巴瘤细胞周期和凋亡率的影响；评价重组慢病毒l e
