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1、广州医学院硕士学位论文产前筛查及多重实时荧光定量PCR快速分子诊断非整倍体技术的 建立姓名：眭建忠申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：孙筱放20100501广州医学院硕士学位论文 产前筛查及多重实时荧光定量 PCR 快速分子诊断非整倍体技术的建立 2产前筛查及多重实时荧光定量产前筛查及多重实时荧光定量 PCR 快速快速 分子诊断非整倍体技术的建立分子诊断非整倍体技术的建立 硕士研究生：硕士研究生：眭建忠 导 师：导 师：孙筱放 教授 专 业：专 业：妇产科学 广州医学院第三附属医院 广州 510150 中中 文文 摘摘 要要 一、目的 一、目的 1. 探讨国外唐氏筛查软件在中国人群应用的
2、可行性。 2. 应用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技术，建立多重实时荧光定量PCR快速诊断唐氏及爱德华综合征技术。 二、方法 二、方法 应用时间分辨荧光免疫法检测孕早期（1113+6周）1517 例孕妇血清的妊娠相关血浆蛋白-A （Pregnancy-associated plasma protein，PAPP-A） 、-人绒毛膜促性腺激素（Beta-human chorionic gonadotropin，-hCG） ，孕中期（1420 周）4858 例孕妇血清的 -hCG 及甲胎蛋
3、白（Alpha-fetoprotein，AFP） ，超声测量孕早期胎儿颈部半透明厚度（Nuchal translucency，NT） ，然后将孕早期检测数据输入英国胎儿医学基金会 （FMF） 提供的 The First Trimester Screening Program, version 2.2 软件进行风险评估， 将孕中期检测数据输入PerkinElmer 公司提供的 LifeCycle软件进行风险评估。 采用多重实时荧光定量 PCR 技术，设计 21、18 号染色体上的APP及TYMS广州医学院硕士学位论文 产前筛查及多重实时荧光定量 PCR 快速分子诊断非整倍体技术的建立 3基因相应
4、的引物和探针在同一管中作为相互内参照基因同时扩增，对 36 例外周血的正常核型样本（A 组）、16 例羊水的正常核型样本（B 组）、21 例唐氏综合征（C 组）及 6 例爱德华综合征样本（D 组）进行检测，对 4 组样本CT 值进行统计学分析，建立正常核型样本CT 值的参考范围，再利用已建立的方法对 182例临床未知样本进行检测。 三、结果 三、结果 1. 孕早期唐氏筛查 1517 例孕妇中，高风险孕妇 40 例，检出 1 例唐氏综合征，随访未发现漏诊，假阳性率为 2.6%，检出率为 100%；孕中期唐氏筛查 4858例孕妇中，高风险孕妇 209 例，检出 3 例唐氏综合征和 2 例爱德华综合
5、征，随访发现漏诊 2 例唐氏综合征，假阳性率为 4.2%，检出率为 71.4%。 2. 1517 例孕早期唐氏筛查与 4858 例孕中期唐氏筛查的假阳性率比较有统计学意义（P0.05） ；C 组与 A 组、D 组与 A 组间有统计学意义（P0.05） , the CT value from Group C was dramatically different from Group A （P0.05）；C组与A组、 D组与A组间有显著差异 （P0.05 唐氏综合征（C组） 21 -1.57 -1.01 -1.26土0.17 P Mean正常核型正常核型+ 3SD CT 标 本 Mean n正常核
6、型正常核型- 3SD 18三体 CT 标 本 介 于 Mean正常核型正常核型土 3SD 正常核型 血清筛查高风险、胎儿超声软指标异常、高龄等高危孕妇 广州医学院硕士学位论文 产前筛查及多重实时荧光定量 PCR 快速分子诊断非整倍体技术的建立 41三、临床应用三、临床应用 (一一) 应用多重实时荧光定量应用多重实时荧光定量 PCR 快速分子诊断羊水、脐血、绒毛及外周血样本快速分子诊断羊水、脐血、绒毛及外周血样本 1. 142 例羊水样本的产前快速分子诊断结果 2009 年 8 月至 2010 年 4 月，孕妇因高龄、唐氏筛查高风险、中孕胎儿超声筛查示胎儿畸形或胎儿超声软指标异常、生育过染色体异
7、常胎儿、新生儿死亡史等原因，来本院产前诊断科进行遗传咨询，并抽取羊水进行染色体核型分析，同时利用已建立的多重实时荧光定量 PCR 快速分子诊断胎儿非整倍体技术进行快速分子诊断，结果见表 2-12。 表2-12 多重实时荧光定量PCR扩增142例产前诊断羊水样本CT值的实验结果 标本 CT 值 产前诊断 羊水样本 (142 例) -0.515,-0.707,-0.323,-0.535,-0.447,-0.715,-0.773,-0.435,-0.439,-0.223-0.465,-1.239,-0.543,-0.699,-0.389,-0.701,-0.624,-0.481,-0.534,-0.
8、420-0.523,-0.665,-0.584,-0.398,-0.598,-0.489,-0.284,-0.627,-0.635,-0.325-0.465,-0.540,-0.392,-0.871,-0.234,-0.271,-0.132,-0.251,-0.384,-0.434-0.374,-0.497,-0.601,-1.513,-0.561,-0.735,-0.533,-0.357,-0.487,-0.625-0.279,-0.446,-0.748,-0.334,-0.428,-0.230,-0.448,-0.230,-0.763,-0.687-0.663,-0.578,-0.342,
9、-0.361,-0.491,-0.351,-1.321,-0.778,-0.566,-0.672-0.493,-0.542,-0.712,-0.187,-0.550,-0.384,-0.564,-0.511,-0.498,-0.391-0.211,-0.542,-0.779,-0.468,-1.180,-0.647,-0.162,-0.285,-1.337,-0.475-0.402,-0.493,-0.551,-0.308,-0.360,-0.649,-0.987,-0.710,-0.382,-0.712-0.672,-0.772,-0.359,-1.230,-0.259,-0.368,-0.
10、779,-0.218,-0.568,-0.493-0.557,-0.748,-0.649,-0.320,-1.289,-0.178,-0.483,-0.265,-0.498,-0.627-0.359,-0.662,-0.579,-0.241,-0.132,-0.456,-0.449,-0.601,-0.290,-0.381-0.512,-0.461,-0.557,-0.217,-0.471,-0.341,-0.287,-0.812,-0.461,-0.224-0.441,-0.502 2. 23 例脐血样本的产前快速分子诊断检测结果 2009 年 8 月至 2010 年 4 月，孕妇因高龄、中
11、晚孕胎儿超声筛查示胎儿畸形或胎儿超声软指标异常等原因，来本院产前诊断科进行遗传咨询，并抽取脐血进广州医学院硕士学位论文 产前筛查及多重实时荧光定量 PCR 快速分子诊断非整倍体技术的建立 42行染色体核型分析，同时利用已建立的多重实时荧光定量 PCR 快速分子诊断胎儿非整倍体技术进行快速分子诊断，结果见表 2-13。 表2-13 多重实时荧光定量PCR扩增23例产前诊断脐血样本CT值的实验结果 标本 CT 值 产前诊断 脐血样本 （23 例） -0.689,-0.465,-0.334,-0.467,-0.584,-0.246,-0.550,-0.475,-0.642,-0.203 -0.742
12、,-0.532,-0.607,-0.286,-0.449,-1.321,-0.148,-0.384,-0.670,-0.519-0.392,-0.481,-0.370 3. 1 例孕早期孕妇 B 超发现胎儿 NT 异常增厚（4.2mm）的绒毛样本 朱，27 岁，LMP 2009-7-3，孕 12+周，2009-9-29 早孕 B 超检查，结果：CRL 66mm，NT 4.2mm，单活胎。 遗传咨询：NT 增厚，建议行绒毛染色体核型分析及快速分子诊断，孕期超声动态观察胎儿情况。 快速分子诊断结果：该样本CT 值为-0.68。 4. 16 例外周血的快速分子诊断结果 2009 年 8 月至 201
13、0 年 2 月，因不育不孕、曾生育过染色体异常胎儿、多次自然流产等原因的夫妇，来本院就诊，抽取外周血进行染色体核型分析，同时利用已建立的多重实时荧光定量 PCR 快速分子诊断染色体非整倍体技术进行快速分子诊断，结果见表 2-14。 表2-14 多重实时荧光定量PCR扩增16例外周血样本CT值的实验结果 标本 CT 值 外 周 血 样本（16 例） -0.568，-0.497，-0.764，-0.558，-0.438，-0.469， -0.652， -0.385，-0.681，-0.405，-0.702，-0.635，-0.497， -0.286， -0.635，-0.459 (二二) 结果分析
14、结果分析 51 例正常核型样本CT 值的正常参考范围 Mean 土 3 SD：-0.93 -0.03，CT 值小于-0.93 诊断为 21 三体， 大于-0.03 诊断为 18 三体， 介于-0.93 -0.03之间则可排除 21 及 18 三体。根据此诊断标准，对上述羊水、脐血、绒毛及外周血样本CT 值结果做出判断：142 例羊水样本中有 7 例样本CT 值小于-0.93，广州医学院硕士学位论文 产前筛查及多重实时荧光定量 PCR 快速分子诊断非整倍体技术的建立 43诊断为 21 三体； 23 例脐血样本中有 1 例样本CT 值小于-0.93， 诊断为 21 三体；其余样本CT 值均介于-0
15、.93 -0.03 之间，可排除 21 及 18 三体。 核对以上样本的细胞遗传学核型结果， 多重实时荧光定量 PCR 诊断为 21 三体的 8 例样本中有 3 例是正常核型， 其余样本的诊断结果与细胞遗传学核型分析结果一致，见表 2-15。 表 2-15 多重实时荧光定量 PCR 快速分子诊断临床应用结果 实际 21 三体（例） 实验结果 实际总数 5 3 0 174 5 177 根据上表计算得出：实验的灵敏度为 5/(5+0) 100%=100%；特异性为174/(174+3) 100%=98.3%。 广州医学院硕士学位论文 产前筛查及多重实时荧光定量 PCR 快速分子诊断非整倍体技术的建
16、立 44讨讨 论论 一、实验背景一、实验背景 1866 年英国医生 J.L.Down 首先描述报道唐氏综合征 （Downs Syndrome,DS）OMIM190685的临床表现，所以该征以发现者的名字命名。1959 年法国细胞遗传学家 Lejune 证实此病的病因是多了一个小的 G 组染色体， 后来确定为 21 号染色体， 故此综合征又称为21三体综合征, 其发病率在活婴中为1/6001/80032，因智力发育障碍突出，故俗称先天愚型儿。其发病机制是由于生殖细胞减数分裂过程或合子早期卵裂过程中的染色体不分离导致。 1960 年，Edwards 等首先报道 1 例多发畸形患儿，发现此患者核型中 E 组染色体多一条，后命名为爱德华综合征（Edward
