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1、第一章: 小鼠免疫 第二章: 滋养细胞的制备 第三章: 细胞融合 第四章: 筛选分泌抗体的杂交瘤细胞 (ELISA 法) 第五章: 杂交瘤细胞的亚克隆培养 第六章: 杂交瘤细胞系的冻存与复苏 第七章：腹水制备 第八章：附件第一章第一章 小鼠免疫小鼠免疫小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。好的免疫效果： 血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上。小鼠的选择：小鼠的选择：选择与所用骨髓瘤细胞同源的 Balb/c 健康雌性小鼠，鼠龄在 812 周。为避 免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫 34 只小鼠。免疫原：免疫原：免疫原的纯度一般并不重要。但有
2、时免疫原纯度也会造成很大影响，若杂质存在 使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以 及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应。 上述诸情况下使用纯化抗原会更有利。 常用的免疫方案：常用的免疫方案： （一）（一） 可溶性抗原可溶性抗原 初次免疫： 50100g 蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部 皮下多点注射，注射体积 500l/只小鼠，四周后进行第二次免疫第二次免疫：50100g（2550ug，为初免剂量一半）蛋白抗原（与初免等量），加等 体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，
3、注射体积 500l/只 小鼠 两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价 （用 ELISA 方法检测） 效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原 25g（50100ug，与初免剂量相同）加强免疫， 尾静脉注射，注射体积 200l/只 300ul/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫第三次免疫：50g 蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注 射，注射体积 500l/只，小鼠融合前三天取抗原 25g 加强免疫，注射体积 200l/只。 （二）（二） 颗粒性（细胞）抗原颗粒性（细胞）抗原 可用 51062107 细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，23 周后重复一次，但佐 剂改为不完
4、全佐剂，再待 23 周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，34 天后取脾融 合。 为挑选免疫反应较好的动物进行融合，第二次免疫后 10 天左右应从尾部取血，检查抗体滴 度。 另外，还有脾内注射法和体外培养法。第二章第二章 饲养细胞的制备饲养细胞的制备体外培养细胞时，一般单个或极少数分散状态细胞是不能存活的（或生长不良）必需加入 一定量的其他细胞达一定的密度才能生长得好，加入的细胞称为饲养细胞。用细胞融合术 建立杂交瘤细胞时，饲养细胞的加入是不可缺少的，常用的有正常小鼠腹腔巨噬细胞、脾 细胞、胸腺细胞，也有人用经过照射或丝裂霉素处理的纤维母细胞，如 3T3 或 Putler 等。 一、一、 实验
5、材料实验材料 1.1 RPMI-1640 完全培养液：具体配法见实验方法细胞融合 2.3。 1.2 HAT 培养液或 HT 培养液：具体配法见实验方法细胞融合 2.4 和 2.5。 1.3 实验动物： Balb/c 或昆明种健康小鼠（雌雄均可）1 只，610 周龄，体重 18 22 克，本院动物中心繁殖和饲养。每只小鼠可取得 35106 的滋养细胞，可供铺 6 块板用， 应在融合或克隆前 12 天制备。 1.4 离心机一台，血细胞计数板，无菌塑料离心管，96 孔细胞培养板。小鼠解剖台板或平 皿；无菌眼科剪刀、镊子各数把；大镊子一个；止血钳两个。一次性 5ml 注射器 2 套。 二、实验方法二、
6、实验方法 2.1 将 Balb/c 小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于 75%酒精 5 分钟，随即放入超净工作台内，腹部 朝上放于平皿内或固定于解剖板上。 2.2 用眼科镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜， 以免腹腔液外流。然后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹 膜消毒。 2.3 用注射器吸取 5ml RPMI-1640 基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停 留不动，晃动小鼠或反复抽吸几次。用原注射器抽回腹腔内液体，注入离心管。如此反复 操作 34 次。 2.4 1000rpm 离心 10min，弃上清。 2.5 用 2050ml 完全培养液重悬细胞，100l/
7、孔滴加到培养板，置培养 箱备用。 2.6 观察饲养细胞的生长状态，一般生长良好的饲养细胞和巨嗜细胞呈梭形或多角形、细 胞透亮、折光性强。第三章第三章 细胞融合细胞融合细胞融合是人工定向制造新细胞品系的重要手段，也是制造单克隆细胞系的关键技术。在 保证有良好的亲本细胞、稳定和良好的培养体系的条件下，细胞融合的成败和融合率则取 决于融合剂和操作技巧。细胞融合的助融剂和助融手段主要有三种； 生物学方法：用仙台病毒或鸡新城疫病毒作助融剂。 物理学方法：用电融合仪发出的脉冲电流使相邻的两细胞穿孔而融合。 化学方法：用聚乙二醇或血卵磷脂作助融剂。 PEG 作助融剂是比较方便简单的操作方法，具体方法如下：
8、一、实验材料一、实验材料 1.1 眼科镊子、剪刀数把、固定板。 1.2 37温水。 1.3 酒精灯、离心管架、离心管、离心机、5-10ml 吸管、1ml 吸管、滴管、计数池、平皿 数个。 二、实验试剂二、实验试剂 2.12.1 融合剂：融合剂：50%PEG W=3000PEG3000 1gRPMI1640 1ml 8-10 磅灭菌 2.22.2 基础培养液（基础培养液（RPMI1640RPMI1640） RPMI1640 一包 (10.4g) L-G （L-谷氨酰胺） 0.3gHEPES 3.0g 碳酸氢钠 3.0g 庆大霉素 一支 三蒸水加至 1000ml 2.32.3 16401640 完
9、全培养液完全培养液 基础培养液 180ml 胎牛血清 20ml 2.42.4 HTHT 培养液（终浓度培养液（终浓度 H H 为为 110-4M110-4M，T T 为为 1.610-5M1.610-5M） 基础培养液 197.5ml HT 浓缩液（100） 2.5ml 胎牛血清 50ml 一次融合约配 250 毫升 2.52.5 HATHAT 培养液（终浓度培养液（终浓度 A A 为为 410-7M410-7M） 基础培养液 197.5ml HAT 浓缩液（100） 2.5ml 胎牛血清 50ml 2.62.6 细胞冻存液细胞冻存液 1640 完全培养液 70mlDMSO 10ml 胎牛血清
10、 20ml 2.72.7 3%3%醋酸溶液醋酸溶液 30%乙酸 10mldH2O 90ml三、实验步骤三、实验步骤 3.13.1 脾细胞制备：脾细胞制备：取加强免疫小鼠一只，眼眶采血后脱臼处死，在 75%酒精中消毒后取脾 脏，去除结缔组织，制备脾细胞悬液，转移到 50ml 离心管中，加 RPMI1640 至 30ml，15002000rpm 离心 5 分钟，弃上清，加 RPMI1640 至 30ml，白细胞稀释液稀释 20 倍， 计数，取 1108 个细胞待用。 3.23.2 骨髓瘤细胞制备：骨髓瘤细胞制备：取 3 瓶生长状态良好的（活细胞数95%）骨髓瘤细胞，将之完全吹 下，转移到 50ml
11、 离心管中，加 RPMI1640 至 30ml，15002000rpm 离心 5 分钟，弃上清，加 RPMI1640 至 30ml，RPMI1640 稀释 10 倍，计数，取 2107 个细胞待用。 3.33.3 细胞混合：细胞混合：脾细胞:骨髓瘤=5：1，混合，15002000rpm 离心 5 分钟。 注意：由于细胞融合是个随机过程，母细胞比例不一，会影响融合产物；或是两种母细胞 融合而成的杂交细胞，或是一种细胞自身融合产物。多数实验者采用骨髓瘤细胞：脾细胞 1：5，也有人采取其他比例，如骨髓瘤细胞：脾细胞1：5，甚至是 1：1。减少脾细胞 用量目的是降低脾细胞自身融合的机率。 3.43.4
12、 细胞融合：细胞融合：将离心上清倒干，把沉淀细胞块弹成糊状，置 37水浴， 在 1 分钟内加入 1ml 融合剂，并搅拌细胞，37水浴放置 45 秒，在 1 分钟内加入 1ml 1640 并搅拌细 胞 2 分钟内加入 5ml 1640 并搅拌细胞 2 分钟内加入 10ml 1640 并搅拌细胞2 分钟内加入 10ml 1640 并搅拌细胞终止融合剂的融合作用，500rpm 离心 7 分钟，弃上 清。3.53.5 细胞培养：细胞培养：轻轻将细胞弹匀，缓缓加入 HAT 培养液至所需体积，将细胞重悬，轻轻地 将之混匀，加到预先准备好的饲养细胞板中。 10ml 吸管滴加 1 滴（配 8ml/板），排枪滴
13、 加 80100 微升（配 10ml/板），37，CO2 培养箱培养、观察。 3.63.6 细胞培养、换液：细胞培养、换液：细胞融合后第一天开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长 状态、每孔杂交细胞瘤个数、块数、培养液有无污染、饲养细胞的状况。培养 35 天 HAT 培养液换液一次，10 天换 HT 培养液培养至 20 天，换 1640 完全培养液。四四HATHAT 选择培养液的作用选择培养液的作用 在细胞融合时，可以出现：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，脾细胞之间的融合，骨髓瘤之间 融合，此外还有大量的未融合细胞。如何除去大量未融合及自身融合的细胞呢？下面简介 HAT 液作用。 谷氨酰胺（L-
14、Glutamine），尿核苷单磷酸都是正常细胞及肿瘤细胞用来合成 DNA 的重要成 分（主要途径），但是这条途径可以被氨基喋呤（Aminopterin）切断。另外还有一条应急 途径即细胞内的 HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转化酶）利用（H）和 TK（胸腺嘧啶激 酶）利用（T）合成 DNA。 骨髓瘤细胞株是经过 8-偶氮鸟嘌呤筛选出来的，不含 HGPRT，因此不能借用应急途径合成 DNA，只能靠主要途径合成 DNA。骨髓瘤细胞在 HAT 液中，因缺少 HGPRT 和 TK，不能利用 HT 合成 DNA，主要途径又被氨基喋呤阻断，因此细胞死亡。免疫鼠脾细胞，虽含有 HGPRT 但不适应体外
15、培养，一般十天左右自然灭亡。杂交细胞，在融合时脾细胞的 HGPRT 被带入，通过应急途径利用 HT 合成 DNA，并继承骨髓瘤细胞体外繁殖的特性，所以能存 活。 一般融合后常用含 20%胎牛血清培养液，通过筛选，亚克隆选出有关杂交细胞后，则可换 成含 10%胎牛血清培养液。对已确定的杂交瘤株，则可换成含 5%胎牛血清的培养液培养。第四章第四章 筛选分泌抗体的杂交瘤细胞筛选分泌抗体的杂交瘤细胞融合后当杂交细胞集落生长到一定大小，培养液开始变黄，便可开始筛选抗体活性。 许多方法都可以用来筛选，但应注意到筛选单克隆抗体时的一些特点；首先，培养上清中 的抗体含量低于高效抗血清的抗体含量。其次，与普通抗
16、血清不同，单克隆抗体不能多价 地识别抗原。所以用来筛选单克隆抗体的方法应照顾到单克隆抗体的特点，而且要准确、 迅速和方便。此外应根据所需要抗体的特点，选择不同类型的方法。 一般常用的有：免疫荧光、放射免疫（RIA）、组织化学法和酶联免疫 分析（ELISA）法等。最经常用方法是 ELISA 法。 在收集上清时，应在上次换液后 3-4 天进行，以便抗体积累。 上清可不经稀释或 1：51：10 稀释后再测抗体活性，用稀释抗体进行筛选时可以筛掉弱阳 性的抗体，也可以去掉因高本底所造成的假阳性。 融合后第一次筛选出的阳性克隆可能因阴性克隆或其他阳性克隆的过度生长而丢失，故应尽早亚克隆。 第一次筛选后也可能没筛选到阳性抗体，这可能由于分泌阳性抗体的细胞为数尚少，应重 复测定活性 2-3 次。现将 ELISA 法检测杂交瘤细胞抗体的方法
