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1、重组人表皮生长因子外用溶液（重组人表皮生长因子外用溶液（）Chongzu Ren Biaopi Shengzhangyinzi Waiyong rongye()Recombinant Human Epidermal Growth Factor Derivative for External Use，Liquid本品系由高效表达人表皮生长因子衍生物基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后制成。 含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。 1 基本要求基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造制造2.1 工程菌菌种 2.1.1 名称及来源 重组人表皮生长因
2、子衍生物工程菌株系由带有人工合成人表皮生长因子衍生物基因（较天然 人表皮生长因子 5N 端多 3 个氨基酸序列：Ala-Arg-Ile）的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。2.1.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。2.1.3.1 划种 LB 琼脂平板 应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。2.1.3.2 染色镜检 应为典型的革兰阴性杆菌。2.1.3.3 对抗生素的抗性 应与原始菌种相符。2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做） 应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
3、2.1.3.5 生化反应 应符合大肠杆菌生物学性状。2.1.3.6 人表皮生长因子衍生物表达量 在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量（10%） 。2.1.3.7 质粒检查 该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。 2.1.3.8 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做） 目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。2.2 原液 2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适宜抗生素）中培养，供发酵罐接 种用。2.2.2 发酵用培养基采用适宜的不含任何抗生素的培养基。2.2.3 种子液接种及发酵培养 2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。 2.2.3.2 在适宜的
4、温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件， 如温度、pH 值、溶氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（附录 G） 。2.2.4 发酵液处理 用适宜的方法收集处理菌体。收集的菌体原则上应立即进行初步纯化，必要时可在-20冻存， 并规定贮存期。2.2.5 纯化 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化和高度纯化，使其达到 3.1 项要求，即为人表皮生长因 子衍生物原液。加入稳定剂，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。2.2.6 原液检定 按 3.1 项进行。2.3 半成品 2.3.1 配制与除菌 2.3.1.1 稀释液配制 按经批准的配方配制稀释液。配制后应立
5、即用于稀释。2.3.1.2 稀释与除菌 将检定合格加稳定剂的人表皮生长因子衍生物原液用 2.3.1.1 项稀释液稀释至所需浓度。除 菌过滤后即为半成品，保存于 28。2.3.2 半成品检定 按 3.2 项进行。2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分批规程”规定。2.4.2 分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。2.4.3 规格 应为经批准的规格。2.4.4 包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3 检定检定3.1 原液检定 3.1.1 生物学活性 依法测定（附录 H） 。3.1.2 蛋白质含量 依法测定（附录 B 第二法） 。3.1.3 比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比
6、，每 1mg 蛋白质应不低于 5.0105IU。3.1.4 纯度 3.1.4.1 电泳法 依法测定（附录 C） 。用非还原型 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为 17.5%， 加样量应不低于 10g(考马斯亮蓝 R250 染色法)或 5g(银染法)。经扫描仪扫描，纯度应不低 于 95.0%。3.1.4.2 高效液相色谱法 依法测定（附录 B） 。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 A 相(三氟乙酸-水溶 液：取 1.0ml 三氟乙酸加水至 1000ml，充分混匀)、B 相(三氟乙酸-乙腈溶液：取 1.0ml 三氟乙酸 加入色谱纯乙腈至 1000ml，充分混匀) 为流动相，在室
7、温条件下，进行梯度洗脱(070B 相)。 上样量不低于 10g，于波长 280nm 处检测，以人表皮生长因子衍生物色谱峰计算理论板数应不 低于 500。按面积归一化法计算，人表皮生长因子衍生物主峰面积应不低于总面积的 95.0%。3.1.5 分子量 依法测定（附录 C） 。用还原型 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为 17.5%，加 样量应不低于 1.0g。分子质量用重组人表皮生长因子衍生物对照品校正后应为6.2kD0.62kD。 3.1.6 外源性 DNA 残留量 每 1 支次人用剂量应不高于 10ng（附录 B） 。3.1.7 等电点 主区带应为 4.15.1, 供试品的等电点与
8、对照品的等电点图谱一致。 （附录 D） 。3.1.8 紫外光谱扫描 用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约 100g/ml500g/ml，在光路 1cm、波长 230nm360nm 下进行扫描，最大吸收峰波长应为 276nm3nm（附录 A） 。3.1.9 肽图（至少每年测定 1 次） 依法测定（附录 E） ，应与对照品图形一致。3.1.10 N-末端氨基酸序列（至少每年测定一次） 用氨基酸序列分析仪测定，其 N-末端序列应为：(Met)-Ala-Arg-Ile-Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly。 3.1.11 鉴别试验 按免疫印迹法
9、（附录 A）或免疫斑点法（附录 B）测定，应为阳性。3.1.12 残余抗生素活性 依法测定（附录 A） ，不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。3.2 半成品检定 无菌检查 依法检查（附录 A） ，应符合规定。3.3 成品检定 3.3.1 鉴别试验 按免疫印迹法（附录 A）或免疫斑点法（附录 B）测定，应为阳性。3.3.2 物理检查 3.321 外观 应为无色无臭澄明液体，不得含有肉眼可见的不溶物。 3322 装量 依法检查（附录 F） ，应符合规定。 333pH 值 应为 6.57.5（附录 A） 。 334 生物学活性 应为标示量的 70%200%（附录 H） 。 335 无菌检查 依法检查（附录 A） ，应符合规定。 4 保存、运输及有效期保存、运输及有效期于 28避光保存和运输。自生产分装之日起，按批准的有效期执行。 5 使用说明使用说明 应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。
