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1、安徽医科大学博士学位论文巨噬细胞增强表达诱骗受体IL-13R2及其在血吸虫病免疫病理 调节中作用姓名：王维申请学位级别：博士专业：流行病与卫生统计学指导教师：蒋作君;沈继龙安徽医科大学博士学位论文 3巨噬细胞增强表达诱骗受体巨噬细胞增强表达诱骗受体IL-13R2及其在血吸虫病 免疫病理调节中作用 及其在血吸虫病 免疫病理调节中作用 博士研究生 王 维 博士生导师 蒋作君 教授 沈继龙 教授 安徽医科大学流行病与卫生统计学 安徽医科大学病原生物学，合肥 230032 中文摘要 IL-13(Interleukin-13)及其受体IL-13R2(IL-13 receptor alpha2)是近年血吸
2、虫病、哮喘等纤维化疾病研究“热点”分子。IL-13主要由活化Th2细胞产生，它有两种亲合力和功能截然不同的受体IL-13R1和IL-13R2，低亲和力IL-13R1可结合IL-4R形成异源二聚体、活化IL-13信号通路而发挥生物学效应。相反，IL-13R2虽能强力结合IL-13，并且是其细胞内吞所需亚单位，但无信号级连效应，又被称为“诱骗受体（decoy receptor）”。IL-13R2或重组sIL-13R2-Fc融合蛋白(soluble IL-13R2-Fc fusion protein)具有高亲和力拮抗IL-13活性作用，对于某些高表达IL-13受体的肿瘤细胞，利用IL-13运载毒性蛋
3、白IL-13-PE38QQR或高亲和力拮抗剂sIL-13R2的受体定点靶向作用，实现对肿瘤细胞特异性“杀死”，目前IL-13R2肿瘤基因治疗已进入临床前期实验。 IL-13是纤维化细胞外基质重要调节剂，它可直接刺激成纤维细胞产生胶原、导致纤维化，而不影响炎性肉芽肿的形成。目前各种慢性炎性纤维化疾病仍无特效治疗药物，有关IL-13功能和活性及其调节机制的研究将为纤维化疾病干预提供新思路。 鼠血吸虫病作为Th2免疫偏移疾病研究模型， IL-13是血吸虫病纤维化最重要介质，曼氏血吸虫病患者及感染动物血清IL-13R2水平升高，IL-13R2基因敲除鼠（ IL-13R2-deficient mice,
4、 IL-13R2-/-） 呈 程 度 加 重 的 纤 维 化 ， 给 予 注 射安徽医科大学博士学位论文 4sIL-13R2-Fc后可明显改善纤维化程度，表明纤维化程度加重与IL-13活性增高有关。IL-13R2具有下调曼氏血吸虫肉芽肿炎性反应、延长感染鼠寿命等保护性作用。 鉴于曼氏血吸虫与日本血吸虫病理机理不尽相同， 有关日本血吸虫病IL-13R2的研究尚未见报道。更重要的是，Th2细胞因子通过细胞膜上受体实现信号传递，血吸虫感染的机体IL-13应答细胞及其生物学效应尚未阐明。本课题首先以鼠动物模型研究日本血吸虫病感染过程IL-13R2表达水平；进一步建立日本血吸虫感染BALB/C鼠巨噬细胞
5、失活模型，通过研究巨噬细胞失活后IL-13R2表达变化及肝脏病理改变，探讨肉芽肿IL-13R2阳性表达细胞及其免疫病理调节作用。我们的研究内容主要包括二部分： 1. 日本血吸虫感染诱导小鼠诱骗受体日本血吸虫感染诱导小鼠诱骗受体IL-13R2表达水平升高表达水平升高 采用经腹部皮肤人工感染活尾蚴方法，建立 BALB/C 鼠日本血吸虫病模型，ELISA 法检测血清可溶性 IL-13R2 蛋白动态水平；以 IL-13R2 核苷酸序列（小鼠 Accession number NM008356）cDNA 为模板设计、合成引物，RT-PCR 法扩增肝组织 IL-13R2 基因，获取目的片段；Western
6、 blotting 检测同期肝组织蛋白表达情况。结果表明：感染鼠血清 IL-13R2 可溶性蛋白水平明显升高，感染后 6 周达高峰，其后略有下降；PCR 法从感染鼠肝脏扩增出胞外区 IL-13R2 mRNA 800bp片段；Western blotting 检测结果显示，肝脏出现特异性 IL-13R2 蛋白条带，相对分子量位于 35-49KD 之间。因此，日本血吸虫感染诱导机体 IL-13R2 基因转录和蛋白表达增强。 2. 肉芽肿巨噬细胞特异性增强表达肉芽肿巨噬细胞特异性增强表达 IL-13R2 及其免疫病理调节作用及其免疫病理调节作用 1) 体外实验 检测巨噬细胞 IL-13R2 表达水平
7、 分离、培养腹腔巨噬细胞，Real time PCR 法分析感染鼠巨噬细胞 IL-13R2 mRNA 水平变化（与正常对照组比较）；免疫荧光双标法检测 IL-13R2 与 CD68共表达情况。结果表明：感染鼠巨噬细胞 IL-13R2、collagen 基因水平分别是正常鼠 6 倍、2.5 倍，差异具有显著性(P 0.05)。 NS-血吸虫病鼠 IL-13R2、 collagen 基因水平分别是 NS-正常对照鼠 9 倍、 2.5 倍； Gd-血吸虫病鼠分别是 NS-正常对照鼠 5 倍、1.5 倍，图 11。因此，血吸虫感染诱导机体 IL-13R2、collagen 基因表达增强，当巨噬细胞失活
8、或清除后，IL-13R2、collagen mRNA 基因的表达受到抑制。 图 11. 血吸虫病巨噬细胞失活鼠肝组织 IL-13R2、collagen 基因水平差异 Figure11. RT-qPCR analysis of whole liver samples for IL-13R2 and collagen mRNA in macrophage-inactivated S. japonicum-infected mice and control mice 安徽医科大学博士学位论文 37（2）三重荧光染色检测）三重荧光染色检测 IL-13R2 蛋白蛋白 肝组织切片三重 (DAPI、FITC
9、 和 Cy3)免疫荧光染色，荧光镜观察感染-NS组（图 12A-D）：肉芽肿中央为虫卵，周围由大量圆形、新月形细胞核，弥散均匀荧光兰色形成椭圆形病灶，与正常组织分界清楚，图 12A。病灶内可见红色“咖啡豆样” ， 散在分布， 为特异性 IL-13R2 免疫阳性细胞， 图 12B； 此外， 可见 ED1免疫阳性细胞散在分布的绿色“咖啡豆样” ，图 12C。软件分析 IL-13R2 与 ED1呈一致性分布， 显示IL-13R2蛋白与ED1在肉芽肿巨噬细胞一致性共表达 （白色） ，图 12D。 荧光镜观察感染-Gd 组切片（图 12E-H） ，虫卵肉芽肿内圆形、新月形兰色细胞核排列较紧密，与相邻正常
10、组织形成明显的交界，图 12E。病灶内红色免疫阳性信号及绿色免疫阳性信号均未见，图 12F 和 G。单个虫卵肉芽肿内 ED1 阳性细胞（绿色）和 IL-13R2 阳性细胞（红色）几乎同时消失，图 12H。证明血吸虫感染鼠巨噬细胞失活抑制 IL-13R2 表达，因此 IL-13R2 具有肉芽肿巨噬细胞表达特异性。 图 12. GdCl3 处理血吸虫病及生理盐水处理血吸虫病鼠肝肉芽肿三重荧光染色400. A- CGdCl3 处理血吸虫病鼠 E-H生理盐水处理血吸虫病鼠 A、EDAPI 染色(蓝) B、F羊抗 IL-13R2 免疫反应阳性细胞(红) C、G鼠抗 CD68 免疫反应阳性细胞(绿) D、
11、H前三者叠加后相应图像 Figure12. Tristain immunofluorescence of whole liver samples in S. japonicum-infected macrophage-inactivated.mice and control mice. Magnification400. 安徽医科大学博士学位论文 38A-D: whole liver samples in S. japonicum-infected control mice; E-H: whole liver samples in S. japonicum-infected macrophag
12、e-inactivated.mice. A、E: Blue indicates nuclears B、F: Red denotes intracellular IL-13R2 C、G: Green identifies macrophages D、H: Colocalization made staining appear white 3.2.2.3 巨噬细胞失活抑制肉芽肿炎性病理反应巨噬细胞失活抑制肉芽肿炎性病理反应 为探讨 IL-13R2+巨噬细胞的免疫病理调节作用， 最后我们对巨噬细胞失活鼠肝组织进行肉芽肿及纤维化病理学研究。 正常-NS 组和正常-Gd 组 H21:181-182. 2
13、. 陈育智, 马煜等 2000 年全国 31 省市 40 万 014 岁儿童哮喘患病情况调查及与 1990 年同类调查对比研究 医学研究杂志.2006;35:44-45. 3. Scrivener S, Yemaneberhan H, Zebenigus M, Tilahun D, Girma S, Ali S, et al. Independent effect s of intestinal parasite infection and domestic allergen exposure on risk of wheeze in Ethiopia: a nested case-contr
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