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1、 基金项目：湖南省科技厅重大研究项目高档湘益茯砖茶优化生物发酵技术研究（2009NK2004），湖南省高校产学研合作示范基地产业化项目富金花散茶技术研究及产业化（11CY003)湖南省高校产学研合作示范基地产业化项目金花膏技术研究及产业化（11CY004） 作者简介：胡治远（1987-），男，硕士研究生，研究方向：食品安全与控制 通讯作者：1 赵运林 Tel:13317375666; : 收稿日期：0000-00-00; 接受日期: 0000-00-00不同品种茯砖茶中优势微生物的分离鉴定胡治远1，赵运林2*，刘石泉2，彭晓赟2，李燕子2，龙立平2(1.湖南农业大学食品科技学院，湖南省，长沙市
2、，410128；2.湖南城市学院化学与环境工程学院，湖南省，益阳市，413000；3.湖南农业大学生物科学与技术学院，湖南长沙，410128）摘摘 要：要：从湖南地区采集的 18 个不同品种茯砖茶样品，采用稀释平板法分离得到 18 株优势菌，观察其平板形态特征与生长特征，以及在电镜下有性与无性生殖结构等特点，初步确定其中 15株优势菌为散囊菌属：8 株冠突散囊菌（Eurotium cristatum）、3 株谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）、2 株肋状散囊菌（Eurotium costiforme）、1 株阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和 1
3、株蜡叶散囊菌（Eurotium herbariorum）；还有 3 株非散囊菌属优势菌为黑曲霉（Aspergillus niger）。实验结果表明茯砖茶中优势微生物存在较大差异。关键词关键词：茯砖茶；优势微生物；平板形态；电镜特征；鉴定分类Isolation and identification of dominant microorganisms from different kinds of Hunan Fuzhuan teaHU Zhi-yuan1，ZHAO Yun-lin2,*，LIU Shi-quan2，PENG Xiao-yun2，LONG Li-ping2 (1. College
4、 of Chemistry and Environment Engineering, Hunan City University, Hunan Yiyang, 413000, China; 2. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;3.College of Bioscience and Biotechnology，Changsha 410128，China)Abstract：Using the flat diluted sample separ
5、ation method, 18 dominant microbe were separated from the 18 different kinds of Hunan brick tea. Based on the morphological and growth characteristics in flat culture medium, sexual and asexual reproductive structure features in electron microscope, the separated 15 dominant strains were identified
6、as Eurotium (8 Eurotium cristatum strains, 3 Eurotium chevalieri strains, 2 Eurotium costiforme strains, 1 Eurotium amstelodami strain, 1 Eurotium herbariorum strain), other isolated3 dominant strains were ascertained to be Aspergillus niger. Results showed that there was obvious difference in domin
7、ant microbe were separated from Hunan brick tea.Key words：brick tea; dominant microbe; flat shape; electron microscope features; identification classification. 1 引言茯砖茶约在 1860 年前后问世1，茯茶早期称“湖茶” ；又因其功效类似于土茯苓， “茯茶”之名便来源于此，又因原料送到径阳筑制，故还被称为“径阳砖” 。茯砖茶主销中国西北边疆少数民族地区，耐贮藏，便于长途运输。数百年来，茯砖茶以其独特的、不可替代的作用和功效，与奶、肉并
8、列，成为西北各族人民的生活必需品2。微生物在茯砖茶的品质形成中，起着不可代替的作用3，历来学者对茯砖茶中微生物的种名、生长特性及生物学特征均进行过一定的研究4-10，但对于不同品种茯砖茶中占主导作用微生物的研究并不够全面，各种优势微生物与茶叶品质的关系研究也少见于报道。目前我国茯砖茶产业尚缺乏规范，不少劣质产品充斥着市场，消费者缺乏对产品发花实质的认识，部分消费者甚至误将发霉的砖茶当做“发花”良好，尤其是近期研究发现不同品种茯砖茶中“金花”颜色，颗粒大小存在着一定的差异11。因此，对不同品种茯砖茶中微生物进行系统性的研究，促进黑茶市场统一标准的建立已迫在眉睫。本研究选取湖南地区较具代表性的茯砖
9、茶作为样品，分离纯化其中优势菌，基于微生物经典鉴定法12-13对它们进行分类鉴定，以期为研究微生物与茶叶品质形成的规律提供理论基础。2 材料与方法 2.1 实验材料实验材料2.1.1 茯砖样本来源从湖南黑茶市场购得较具代表性的茯砖茶 18 种（来自 11 个茯砖茶生产厂家） ，于阴凉避光处保存（表 1） 。表 1 供试用茶样及来源Table1 The tea samples and their sources2.1.2 培养基样品编号样品名称样品生产厂家样品规格A1湘益五十周年纪念茯茶湖南益阳茶厂有限公司1000gA2湘益牌荷香茯砖湖南益阳茶厂有限公司800gA3金湘益茯砖湖南益阳茶厂有限公司
10、450gB1临湘茶厂茯砖茶湖南临湘茶厂500gC1久扬黑茶湖南久扬茶叶有限公司400gC2乐茯速饮金花散茶湖南久扬茶业有限公司50gD1白沙溪茯茶湖南白沙溪茶厂338gD2白沙溪礼品茯砖湖南白沙溪茶厂2000gD3安化茯砖湖南白沙溪茶厂300gD4白沙溪天茯湖南白沙溪茶厂400gE1永泰福手工茯砖湖南永泰福砖茶厂350gE21979 年产永泰福老茯茶湖南永泰福砖茶厂200gF1利源隆茯砖湖南利源隆茶厂600gG1黑茶园生活茯砖湖南省安化茶厂700gH1一品醇香茶湖南益阳黑茶研究所280gI1晋丰厚金花千两茶湖南省安化晋丰厚茶行420gJ1永巨贡砖湖南永巨茶叶有限公司400gK1湘叶牌特制茯砖茶
11、益阳华茗茶厂500g基础培养基：根据对文献的查阅可知茯砖茶内部环境适合霉菌生长，选择 PDA 培养基，察氏培养基作为优势菌分离用培养基。鉴定培养基，参考 Raper14专著以及 Samson15-16等有关文献进行培养基选择：察氏培养基，20蔗糖察氏培养基（含蔗糖 20，在文中简称为 C20） 。 2.2 实验方法实验方法2.2.1 茶叶样品的稀释平板培养将各个茶叶样品用粉碎机粉碎，称取粉碎后的样品 25g，放置在含 225ml 无菌生理水与玻璃珠的 500ml 三角瓶内，盖上封口膜，在振荡仪上 200r/min 振摇 30min，使其中微生物充分分散，制成 10-1倍样品稀释液。在超净工作台
12、上依次梯度稀释至 10-6，取 1mL10-310-6稀释度的稀释液涂布于察氏平板上并用涂布器涂布均匀，每个稀释度各设置五个重复，放置在恒温箱内 28倒置培养。从培养的第三天起观察平板上的菌落，并用微生物计数法计算其在茶叶中的含量17（cfu/g 干样） ，将数量最多的微生物确认为该茶样中的优势微生物。2.2.2 优势菌的分离纯化与保存选择生长状况合适的平板，用接种针挑取优势菌菌落，于察氏培养基上进行划线分离，这样反复 34 次后获得纯培养的菌株，转接斜面管，将其编号后置 4冰箱内保存。2.2.3 优势菌的形态学观察取 4保存的金花菌株在常温下复苏 24h 后，转接于察氏平板与 C20 平板上
13、，置于恒温培养箱内 28静置培养，每天观察菌落的生长情况并作好记录。2.2.6 优势菌的扫描电镜观察挑取察氏平板上生长到适宜大小的菌落制成标本并固定，常规法制片后，在扫描电子显微镜（由日立电子株式会社生产，型号 JSM-6380LV）下观察其菌丝、闭囊壳、子囊、子囊孢子、分生孢子头等的形态并拍照。3 结果与分析依据各个菌株在平板上的形态特征（图 1） ，电镜下分生孢子头（图 2） 、分生孢子以及子囊孢子（图 3） 、闭囊壳等结构特征的不同将 20 株优势微生物分为 6 类（优势菌的编号均采用来源茶叶样品的小写编号代替）：c1、c3、j1 为近似菌株，在察氏平板上生长速度非常快，7d 时菌落直径
14、为 5570mm，质地丝绒状，菌落正面为黑褐色，反面呈黄色，产生大量分生孢子。其电镜下特征为：无闭囊壳结构，分生孢子头为球形，直径 250400um，分生孢子梗发生于基质，外壁光滑；分生孢子球形，直径 35um，壁粗糙，具不规则的纵向条纹。a1、a2、a3、c2、d3、e1、f1、g1 为近似菌株，7d 时菌落直径在 2228mm 之间，大部分为圆形或椭圆形，也有不规则的存在，菌落中央厚度略高于边缘，结构较致密，边缘呈橄榄黄色，往中央颜色逐渐加深，中央部分颜色为橄榄褐色，生长时间较长的部位有少许黑褐色香油状渗出液，菌落周围的培养基亦被色素染成茶褐色，以闭囊壳为主，菌落边缘可见少量灰绿色分生孢子
15、头。菌落反面为深黄至棕色。其电镜下特征为：闭囊壳为球形或近球形，直径 100180um；子囊为球形，1014um；子囊孢子呈双凸镜形，有两个明显的纵向鸡冠状突起，孢子体大小为 56um45um，凸面比较粗糙，具尖疣；分生孢子头呈疏松放射形，孢子梗生自基质，直径为 59um，壁光滑；顶囊近球形或烧瓶形，直径1225um；瓶梗 6.510um2.53.4um，着生于顶囊上半部；分生孢子为椭圆形，45um34um，孢子壁粗糙，具小刺。a4、i1 为近似菌株，其菌落生长速度较快，7d 时直径达 3542mm，颜色为米黄色，随培养时间增长颜色略有加深，大量浅黄色菌丝呈辐射状由中央向四周分布，分生孢子头为
16、灰绿色，在分布上以菌落周围多于中央，在菌丝中可观察到大量蜡黄色闭囊壳，基本不产生渗出液，菌落反面为黄色。其电镜下特征为：闭囊壳为球形或近球形，直径100140um；子囊为球形或近球形，直径 1417um；子囊孢子呈双凸镜形，5.56.5um4.85.5um，有两个明显的“赤道”冠，宽约 0.6um，凸面有不规则网结的肋状突起；分生孢子头生于菌丝，孢梗茎直径为 812um，壁光滑，顶囊球形或近球形，直径2030um；分生孢子为椭圆形，大小 3.55um34.5um，孢子壁具小刺。b1 菌落生长速度较快，7d 时直径为 3640mm，菌落厚度较薄，具不规则皱纹；闭囊壳呈亮黄色，分布以中央为主，分生孢子较多，暗灰绿色，有少量渗出液，菌落反面为黄色，亦可见不规则皱纹。其电镜下特征为：闭囊壳为近球形，直径 80160um；子囊孢子呈双凸镜形，4.65.5um3.5
