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1、中南大学博士学位论文LIAF光谱早期诊断大肠癌的分子生物学机制及初步临床研究姓名：彭健申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：张阳德20040501摘要激光诱导自体荧光( L a s e ri n d u c e da u t o f l u o r e s c e n c e ，L I A F ) 光谱是近年发展起来的肿瘤诊断新方法，与其它传统诊断方法相比， 具有灵敏、快速、简便、无创及无毒副作用等优点。 目前，该诊断技术在肺癌诊断中，国内外已有较广泛的基础和临 床研究，而消化道癌特别是大肠癌的自体荧光光谱较复杂，国内外研 究较少，且目前的研究大多处于实验阶段，各自定的诊断标准也有较 大差异
2、，作为临床诊断技术尚不够成熟，还有待于实验研究积累数据寻求规律，以制定实用可靠的诊断标准。本研究在国家“九五”科技攻关项目( 编号：9 6 9 0 1 0 7 0 4 ) 及 国家“十五”科技攻关项目( 编号：2 0 0 1 B A 7 0 6 B 一1 5 ) 的资助下，采 用基础理论与临床实验研究相结合的方式，深入研究激光诱导自体荧 光光谱技术用于大肠癌早期诊断的理论与实际问题，探讨大肠癌激光 诱导自体荧光光谱规律及其分子生物学基础，并在此基础上进行了初 步临床研究，为早期诊断从而早期治愈大肠癌提供理论基础。一、激光诱导自体荧光光谱区分大肠癌组织与正常大肠组织 目的：探讨应用激光诱导自体荧
3、光( L I A F ) 光谱方法诊断大肠癌的可 行性，并确立判断依据。方法：收集3 2 例大肠癌手术切除的离体标 本及相对应的正常大肠组织。采用N d ：Y A G 三倍频调Q 激光器( 波长 3 8 0 n m ) 和光学多道分析仪( O M A ) ，观察大肠癌标本的激光诱导自体 荧光光谱，根据大肠癌组织和正常大肠组织的激光诱导自体荧光光谱特征规律，寻找能够区分两者的光谱差异，得出判断依据，并与病理切片检查结果比较。结果：l 、大肠癌组织和正常大肠组织的L I A F 光谱形状相似，均为双峰结构，大肠癌组织L I A F 光谱强度及主、次 峰强度明显低于正常大肠组织( P O 0 5 )
4、 ；大肠组织各层 L I A F 光谱形状相似，强度不同，正常大肠组织粘膜下层自体荧光光 谱强度最强，肌层次之，粘膜层及癌组织最弱；双光路激光扫描共聚焦显微镜观察结果：正常大肠组织粘膜下层荧光( 1 0 6 7 8 ) 最强，肌层 荧光( 8 5 1 4 ) 次之，而粘膜层( 4 6 7 5 ) 与癌组织( 4 4 1 2 ) 的荧光最弱；显微自体荧光图像显示：正常大肠组织各层均以绿色荧光为主， 粘膜层、粘膜下层和肌层的绿红荧光相对强度之比分别为3 5 8 ：1 、 5 9 6 ：l 和3 1 2 ：1 ，大肠癌组织的红色荧光强度明显增加，绿红荧光 相对强度之比为1 2 6 ：1 ，与正常大肠
5、组织各层比较均有显著性差异 ( P 0 0 5 ) ，I V 型胶原表达下调明显( P 0 0 5 A u t o f l u o r e s c e n c ee m i t t e df r o mn o r m a lc o l o r e c t a lt i s s u ea p p e a r e da sag r e e ni m a g ea n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yr a t i o so fg r e e nt or e df r o mm u c o s a ，s u b m u c o s a ，a
6、 n dm u s c u l a rl a y e rw e r er e s p e c t i v e l y3 5 8 1 5 9 6 1a n d3 1 2 1 w h i l et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yr a t i oo fg r e e nt or e di nc o l o r e c t a lc a n c e rw a s1 2 6 1w i t l lm o r er e df l u o r e s c e n c ef P 增生性息肉 腺瘤组织，两在6 8 0 n m 处荧光强度博士学位论文前言大d
7、 , l l 页序则相反。而K a p a d i a 等用氮分子激光器为光源发现正常结 肠在3 9 0 n t o 处有一主峰，在4 6 0 n t o 处有一次峰；而肿瘤组织只有一 个4 7 0 n t o 处的主峰，正常组织与异常组织间在强度上没有明显差别。 M a r c h e s i n i 等的结果又有所不同，他们发现肿瘤组织的光谱在5 0 0 n m 处峰值最高，在6 3 0 h m 和6 7 0 h m 处还有二个次峰，而正常结肠最高 峰在4 8 0 4 8 5 n m ，没有次峰出现，正常组织的荧光强度要大于癌组织。H u a n g 等分别用4 4 2 n m 和4 4
8、8 n n 激光器作激发源，发现结肠正 常组织的荧光强度高于癌组织大约5 “倍，正常结肠组织和癌组织 的自体荧光光谱都有二个峰，主峰在5 l O n m ，次峰在6 2 0 n t o ，自体荧光光谱差别主要表现在强度上，认为强度阈值可以作为区分结肠癌的主要参数。国内的翟力平等用氮分子激光器( 3 3 7 n m ) 作为激发光源分 析了大肠肿瘤标本的自体荧光光谱，结果显示恶性肿瘤主、次峰及峰 谷强度明显低于对照组。分析以上类似的光谱法研究发现：各研究得出的结论具有较大的 差别，且大多处于实验阶段，各自定的诊断标准也有较大差异，作为 临床诊断技术尚不够成熟，还有待于从更多角度上进行较大规模的实
9、 验与理论研究，以积累数据寻求规律，制定实用可靠的诊断标准。 本研究在国家“九五”科技攻关项目大肠早癌自体荧光内镜 诊断系统研究( 编号i9 6 。9 0 1 0 7 0 4 ) 和国家“十五”科技攻关项目 智能电子肠镜和内镜图像处理系统( 编号：2 0 0 1 B A 7 0 6 B 1 5 ) 的 资助下，率先采用基础理论与临床实验研究相结合的方式，深入研究 激光诱导自体荧光光谱技术用于大肠癌早期诊断的理论与实际问题， 探讨大肠癌激光诱导自体荧光光谱规律及其分子生物学基础，并在此基础上进行了初步临床研究，为早期诊断从而早期治愈大肠癌提供理 论基础。以下分为四个部分进行研究：1 、激光诱导自
10、体荧光光谱区分大肠癌组织与正常大肠组织 2 、大肠癌组织激光诱导自体荧光光谱规律及自体荧光产生机制3 、大肠癌组织与正常大肠组织激光诱导自体荧光光谱差异的分子生 物学基础4 、在体大肠癌组织激光诱导自体荧光光谱特征及其与离体标本的比 较研究博士学位论文第一章第一章激光诱导自体荧光光谱区分大肠癌组织与正常大肠组织大肠癌是世界上高发恶性肿瘤之一，欧美国家大肠癌的发病率排在恶性肿瘤的第二位，在我国大肠癌占全部恶性肿瘤的5 - 7 ，居第4 6 位I l “J 。由于多种原因，目前到医院就诊的患者中，2 3 为中晚期癌，治疗后5 年平均存活率低于4 0 ，而早期大肠癌根治手术后5 年存活率可达9 0
11、以上，且大肠癌的确切发病机制目前还不清楚，尚不能针对病因加以治疗。因此，提高大肠癌的早期诊断率对提高大肠癌患者存活率、改善患者预后具有极其重要意义，也是目前大肠癌防治研究的重点 “”。目前，用于大肠癌诊断的主要手段中，肠镜仍是一种主要的早期诊断方法，但现有肠镜靠肉眼在白光照射下观察，只能发现形态或颜色发生明显改变的病灶，如突起的肿块、凹陷的溃疡，且能被察觉的腺瘤祥息肉的直视判别准确性也仅为7 5 ，而对于微小的、扁平病变或粘膜下瘸变，根本无法查出，常导致漏诊。此外，现有方法利用组织的形态和颜色特性进行诊断，对怀疑对象需取样活检加以证实。活检具有较高的准确率，但活检取样时主观随意性较大，往往因随
12、机定位不准而误诊，对微小病变和较深层病变更容易漏检。而且，活检需花费较长时间，不能在体实时做出诊断，易延误治疗并且存在一定风险。因此，人们一直在致力于寻找一种能正确指导或替代活检的方便易行且灵敏度和准确率较高的诊断方法。激光诱导自体荧光( L a s e ri n d u c e da u t o f l u o r e s c e n c e ，L I A F ) 光谱是近年发展起来的肿瘤诊断新方法，与其它传统诊断方法相比，具有灵敏、快速、简便、无创及无毒副作用等优点。目前，该诊断技术在肺癌诊断中，国内外已有较广泛的基础和临床研究 8 一】，而消化道癌特别是大肠癌的自体荧光光谱较复杂，国内外
13、研究较少。我们在前期的研究工作中已经报道了正常大肠组织与大肠癌组织的激光诱导自体荧光光谱，并发现了它们的光谱特钳1 2 叫4 1 。本研究在正常大肠组织与大肠癌组织光谱差异的基础上，寻找区分两者的判断依据，为L A F 光谱诊断大肠癌的临床研究打下基础。4堕主堂垡丝窒坌兰1 1 材料与方法1 1 1 激光诱导自体荧光检测系统1 1 1 1 主要结构激光光源、传导光纤、光耦合器、多色仪、光学多道分析系统( O M A ) 、计算机等。如图1 所示：图l激光诱导自体荧光检测系统结构不葸图1 ) 激光器N d ：Y A G 三倍频多波段调O 激光器，由卫生部肝胆肠外科研究中心与中国科学院安徽光学精密
14、机械研究所联合研究生产。技术参数为：倍频后输出的激发波长为3 4 0 4 3 0 n m 连续可调。输出能量2 m J ，功率密度 2 0 0 m W c m 2 ，光脉冲宽度7 n s ，工作频率1 - 5 I - I Z 可调。激光器电源不仅可提供0 1 2 K V 连续不变的直流稳定电压，同时还提供电光调Q 所需的4 2 K V 的直流高压。本实验采用3 8 0 r i m 激发波长及5 H Z 工作频率。2 ) 石英光纤由卫生部肝胆肠外科研究中心和天津大学精密仪器与光电子工程学院联合研究生产，为一根总长4 m 的天线型二分叉光纤束，由直径为2 0 0 u m 的7 根熔石英光纤组成。结
15、构如图2 、图3 所示。光纤的数值孔径( N u m e r i c a la p e r t u r e N A )值为0 2 2 。其中A 端为单根光纤，用于接收激光输入，B 端为荧光输出端，并排列成一直线，通过光纤耦合器与多色仪相连，以将其端面成像在入射狭缝上，探测端C 为同轴式排列，中心为单根激发光纤，周边为6 根荧光收集光纤。堡主兰垡笙苎一竖图2 光纤传感器结构图。激光激发光纤荧光接收光纤3 ) 多色仪由天滓光学仪器厂自W D S 3 型单色仪改造而成，内部采用一块3 0 0 线的闪耀光栅作为色散元件。其闪耀波长为4 3 7 n m ，在波长3 5 6 n m - - 6 4 4 n
16、 m 范围内的一级衍射效率为6 7 8 2 。此光栅能很好地适合紫外及可见光范围内的自体荧光光谱检测。4 ) 像增强C C D ( I C C D )购自美国p r i n c e t o nI n s t r u m e n t s 公司，型号I R Y1 0 2 4 S R ，工作温度一2 5 。C ，应用微流量氮气除噪声和循环水降温，可见光波段量子效率为1 1 一一1 7 ，动态范围1 6 3 8 4 ：1 ，暗电流( 2 5 C 时) 牟i n c l u d e # i n c l u d e 拌i n c l u d e 母i n c l u d e v o i dm a i n 0i n tk 4 1 ，T 4 1 1 ；i n t 巧，b - - 0 ；f l o a tp l = 6 ；p 2 = 2 ，p 3 = 3 ；f l o a tw , x 4 1 1 1 4
