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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 和和 Ca2+表达的影响表达的影响作者：孟祥雁 包晓群 罗媛媛 高长斌 作者单位：吉林大学中日联谊医院心内科，吉林 长春 130033【摘要】目的 探讨磷酸肌酸(PCr)对缺血再灌注(I/R)损伤心肌线粒体的影响。方法 采用大鼠左冠状动脉前降支结扎法建立大鼠 I/R 模型。60 只雄性大鼠随机分为缺血再灌注(I/R)损伤组、假手术组、PCr 组，假手术组只剖胸不结扎冠状动脉，余两组制作 I/R 模型，PCr 组结扎前 45 min 经股静脉注射 PCr 4 mg/kg，假手术组和I/R 组分别静脉注射相应体积的生理盐水，在缺血 45 min 及 2 h
2、 时测定 I/R 区心肌丙二醛(MDA)、超氧化物歧化物(SOD)及总 Ca2+浓度。结果 与假手术组比较 I/R 损伤组 MDA、总钙显著增高(P0.05)，SOD 显著降低(P0.01);与 I/R 损伤组比较，PCr 组 MDA 含量及总钙水平显著降低(P0.05)，SOD 显著增高(P0.01)。结论 PCr 对心肌I/R 损伤有保护作用。【关键词】 磷酸肌酸;缺血再灌注损伤;线粒体心肌缺血时磷酸肌酸(PCr)是一种最主要最直接的功能物质，而内源性 PCr 极其有限的，所以提供外源性 PCr 参与细胞能量的供应可解决心肌保护的根本问题能源。国外学者对于外源性 PCr 能否补充恢复耗尽的
3、能量储备，作了大量研究，并证明PCr 是一种极易被心肌细胞使用的能量形式1 。通过 PCr 的标记KKME-专业医学搜索引擎 http:/ PCr 可以增加细胞内PCr 的总体水平，而且当心肌缺血时，这种穿透力增强。本实验观察了 PCr 对体外大鼠心肌线粒体中丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活力和 Ca2+浓度的影响，并探讨其作用机制。1 材料与方法1.1 材料成年雄性 Wistar 鼠 60 只，体重 300400 g，由吉林大学医学实验室提供，合格证号：吉动质 20051024。MDA、SOD、ATP酶检测试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供。台式高速离心机MC 沪 0000
4、193(上海手术器械厂)，LMZ-Z 二道描记式记录仪(成都仪器厂)，微型动物呼吸机(吉林大学第二医院中心实验室提供)。PCr由海口奇力制药有限公司提供，批号 20050503。1.2 模型制作及分组60 只大鼠随机分为假手术组(Sham)，缺血再灌注(I/R)损伤组，PCr 组，每组 20 只。Wistar 大鼠称重后术前禁食 12 h，2.5%戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉后固定于手术台上，手术部位备皮、消毒，并连接心电图肢体导联。于 3、4 气管软骨环间行气管切开插管，接动物呼吸机(潮气量约 20 ml/kg，呼吸频率 60次/min)。沿左侧胸骨旁斜切口，依次切开
5、皮肤、浅筋膜及深筋膜，钝性分离胸大肌和前锯肌，直至暴露出肋骨及肋间肌，于左胸 3、4肋间开胸(钝性分离肋间肌)，用开胸器撑开肋间，暴露心脏，剪开心包，挤出心脏。以无损伤缝合线(70)在左心耳根部和肺动脉圆KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 1 mm 处穿过左冠状动脉前降支，而后迅速将心脏放回胸腔，并将缝线扎紧。此时观察心电图变化，若肉眼观察结扎区变为紫色，同时 QRS 波增高、增宽及不同肢体导联出现 ST 段弓背上抬 0.2 mV 以上，持续 30 min 则为结扎成功。结扎 45 min 后松解结扎线使之再灌 4 h，即为心肌 I/R 模型。假手术组只在左冠状动脉前降支下穿线，不结扎，
6、余步骤同上2 。建立大鼠 I/R 模型后，PCr 组在结扎前 45 min 经股静脉注射 PCr 4 mg/kg，假手术组和I/R 组则静脉注射相应体积生理盐水。1.3 心肌线粒体的分离提取摘取大鼠左心室结扎线以下游离的心室壁心肌 0.2 g，用冰生理盐水洗净，倒入玻璃匀浆管中，加入 9 倍于心脏重量的冰冷匀浆介质，将玻璃匀浆管插入盛有冰水混合物的容器中匀浆，将制备好的匀浆移入 2 ml 离心管，用低温低速离心机以 2 000 r/min 离心10 min，4离心 15 min，弃上清沉淀物即为线粒体，将分离的线粒体用 20 倍的冰冷匀浆介质制备成混悬液，04储存待测。1.4 大鼠心肌线粒体
7、SOD 及 MDA 含量的测定取各组线粒体混悬液，采用硫代巴比妥酸法3 ，按照MDA 测定试剂盒说明书的步骤进行，SOD 检测采用黄嘌呤氧化酶法。1.5 大鼠心肌细胞线粒体 Na+K+ATP、Ca2+Mg2+ATP酶活性测定取各自线粒体混悬液，按文献方法4配制反应介质，总KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 酶反应介质(mmol/L)：咪唑 100，CaCl2 2.5，KCl 0.1，MgCl2 0.1，ATP 2，Na 4，线粒体膜蛋白 60 g，Mg2+ATP 酶反应介质为上述介质， CaCl2 2 加 4 mmol/L ED7A，总反应体积 0.4 ml，37反应 10 min，用冷
8、 10%三氯醋酸终止反应，离心后吸取上清液测定无机磷含量、Ca2+Mg2+ATP 酶活性含量，具体测定按照 ATP 测定试剂盒说明书步骤进行。1.6 统计学处理所有数据用 xs 表示，采用 SPSS13.0 软件进行单因素方差分析检验。2 结果2.1 PCr 对心肌 I/R 损伤大鼠线粒体 MDA、SOD、 Ca2+的影响与假手术组比较，I/R 损伤组大鼠血清 MDA、Ca2+含量明显增加(P0.05)，SOD 活性明显降低(P0.01)。与 I/R 损伤组比较PCr 组能明显降低大鼠血清 MDA 含量、Ca2+含量(P0.05)，SOD 活性明显提高，见表 1。表 1 各组大鼠心肌线粒体中M
9、DA、SOD、Ca2+的变化(略)2.2 PCr 对 I/R 损伤大鼠线粒体Na+K+ATP、Ca2+Mg2+ATP 活力的影响与假手术组比较，I/R 损伤组大鼠血清Na+K+ATP、Ca2+Mg2+ATP 活性明显降低(P0.01)，与 I/R 损伤组相比 PCr 组血清 Na+K+ATP、Ca2+Mg2+ATP 的活性明显KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 2。表 2 PCr 对大鼠心肌细胞线粒体 ATP 酶活力的影响(略)3 讨 论PCr 是参与细胞能量代谢重要的物质之一，也是细胞重要的能量供应源 ATP 的补充，而 ATP 是任何细胞代谢过程中最重要的能量源5 。线粒体在心脏的主
10、要功能是合成 ATP 并维持 Ca2+平衡，这两个过程有赖于线粒体膜内的电子转运所产生的 H+化学梯度，在有氧的生理条件下，线粒体内的 Ca2+浓度增加，刺激三羧酸循环和辅酶 INADH的氧化还原产生 ATP6 。而在心肌缺血缺氧条件下，有氧氧化受抑制，ATP 产生不足，Na+K+ATP 酶活性受抑制，细胞内 Na+增多，无氧酵解增强，乳酸堆积，造成 H+蓄积，细胞内酸中毒，Na+H+交换被激活，也使细胞内 Na+浓度增多，进而激活 Na+Ca2+泵，造成 Ca2+超载，线粒体内 Ca2+聚集可引起膜通透性改变，导致线粒体肿胀，造成不可逆损伤。当再灌注时，大量氧供虽能使线粒体呼吸链功能有所恢复
11、，但也可引起大量氧自由基产生和细胞内 Ca2+聚集，钙超载可激活磷脂酶，进一步加重膜损伤。本实验观察到心肌 I/R 损伤后，I/R 组线粒体的 Ca2+水平显著高于假手术组，而 PCr 组的 Ca2+水平显著低于 I/R 组，说明心肌 I/R 损伤可导致线粒体内钙聚集，PCr 可减轻线粒体内 Ca2+聚集，其作用机制可能是影响 L 型钙离子通道(IcaL)。因为缺血、酸中毒、缺氧可以明显抑制 IcaL 通道，缺血以及酸中毒可以降低肌浆网 Ca2+泵，Na+K+ATP 酶功能，通过 Na+/H+交换、Na+/Ca+KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Ca2+超载，从而抑制 IcaL 通道，
12、酸中毒可以降低通道的电导以及开放数量和开放时间，IcaL 通道 aIC 亚基的半胱氨酸残基对缺氧十分敏感，低氧分压可直接对通道产生抑制。PCr 可明显增加缺血时受抑制的 IcaL 通道。PCr 的作用机制可能不单纯是ATP 合成的底物，它主要是通过保护和维持腺嘌呤核苷酸池，保护线粒体，促进 ADP 的再磷酸化，加快 ATP 的合成再转化，从而减轻细胞内钙超载、酸中毒，解除其对 IcaL 的抑制，PCr 通过 IcaL 的电流，促进了兴奋收缩耦联4 。此外，PCr 还可以通过影响细胞代谢，减慢糖酵解的速度，降低 H+的产生，保护线粒体的氧化功能，抑制 Ca2+引起的线粒体肿胀7 。心肌 I/R
13、损伤可以产生大量的氧自由基，氧自由基的生成及由它引起的细胞膜脂质过氧化是心肌 I/R 损伤的重要机制之一。SOD 是体内重要的氧自由基清除剂，MDA 则为脂质过氧化代谢产物，心肌 I/R 损伤时其含量增加，PCr 能保护 SOD 的活性，减少膜脂质过氧化，使 MDA 含量降低。有研究显示：PCr 可通过提高氧自由基清除酶活力，抑制氧自由基对细胞膜脂质过氧化反应，稳定膜结构，减少细胞内酶的漏出，发挥对心肌缺血的保护作用6 。这可能是 PCr 保护心肌 I/R 损伤的机制之一。机体通过产生氧自由基引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物如 MDA 等，氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧
14、化引起细胞损伤，而且还能通过脂质过氧化物的分解产物引起细胞损伤的程度，SOD 能清除超氧离子的自由基，保护细胞免受损伤，SOD 的活力高低间接KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 损伤后线粒体MDA 含量较假手术组显著增加，而抗氧化损伤和清除自由基能力下降，用 PCr 不仅能减轻 I/R 心肌线粒体的脂质过氧化损伤，而且能通过提高线粒体内 SOD 的活性，增强其清除自由基的能力。【参考文献】1 Ruda M，Sarnarenko M，Afonskaya N，et al.Reduction of ventricular arrhuthmias by phosphorcreatine in p
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