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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 作者单位：徐州医学院内科学与诊断学教研室,江苏徐州 221004【摘要】 目的 探讨更为简单、有效的新生大鼠心肌细胞分离、培养方法。方法 取出生 24 h 内大鼠左心室，剪碎，0.125%胰蛋白酶、0.08%胶原酶 分离，离心收集心肌细胞，差速贴壁法和化学试剂抑制非心肌细胞生长，纯化后培养于 DMEM 培养基。免疫荧光鉴定纯度，0.4%台盼蓝染色检查心肌细胞成活率。结果 心肌细胞纯度为 95%，平均成活率 96%，并出现同簇细胞的同步跳动。结论 本研究应用改良的新生大鼠心肌细胞培养方法，心肌细胞存活率高，纯度高，且操作简便，重复性好，是一种较为理想的心
2、肌细胞原代培养方法，可满足实验要求。【关键词】 心肌细胞 原代培养 胶原酶An improved method for primary culture of neonate rat myocardial cellZHANG Lin1, LI Dongye2, WANG Zhirong3, XIA Yong3, ZHU Hong3, PAN Defeng2, ZHANG Zhuoqi2, YANG Yu3(1. Department of Internal Medicine and Diagnostics, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 2210
3、04, China;2. Institute of Angiocardiopathy, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002; 3. Department of Cardiology,KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002)Abstract: Objective To find an easy way to separate and culture the myocardial cells of rat neonate.
4、 Methods The left ventricular myocardium was removed from neonate rats within 24 hours after birth. The myocardial cells were separated by digestion with 0.125% trypsin and 0.08% collagenase I and collected by centrifugation. The myocardial cells were then cultured in DMEM and harvested by the time
5、of adherence. The myocardial cells cultured were observed under light microscope, identified with cTnI and stained with 0.4% trypan blue to count the living cells. Results 95 percent of the cultured cells were myocardial cells and 96 percent of them were alive. All the myocardial cells were beating
6、synchronously. Conclusion This is an effective way to obtain myocardial cells for scientific experimentation.Key words: myocardial cell;primary culture;collagenase体外培养的心肌细胞具有自发节律性和收缩性特征，能够保持其在体内原有的许多结构和功能，同时排除了神经、体液等因素的干扰，可以从细胞、分子水平阐明一些基本理论，在心肌细胞生长发育、生理、代谢、病理等研究中具有重要作用。因此，心肌细胞原代培养技术已广泛应用于心血管疾病机理及心血管
7、药物和心脏组织工程学的研究。自 1960 年 Harary 等1首次对 Wister 乳鼠的心肌细胞进行培养并成功地维持其自发性节律搏动长达 40 天以来，KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Simpson 等2的培养方法并作了改进，摸索出一种简单并且稳定、可靠的心肌细胞培养方法。1 材料与方法1.1 实验动物和试剂 新生 24 h 内的 SD 大鼠 1015 只，DMEM 培养基(Gibco 公司)，新生牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(Gibco 公司)，型胶原酶(Gibco 公司)，Brdu(Sigma 公司)，磷酸盐缓冲溶液(PBS)(Sigma 公司)，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(
8、BrdU)(Sigma公司)，0.4%台盼蓝(Sigma 公司)，心肌肌钙蛋白 I(cTnI)抗体(Santa Cruz 公司)，FITC 标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物公司)，明胶(Sigma 公司)。1.2 实验仪器 超净工作台、CO2 培养箱、倒置相差显微镜、荧光倒置显微镜、离心机、HH-42 快速恒温数显水箱等。所有手术器械均高压灭菌。玻璃器皿用强酸浸泡过夜，流水冲洗 20 遍，去离子水冲洗 3 遍，双蒸水冲洗 3 遍，烤干后高压灭菌备用。1.3 心肌细胞的制备和培养 新生 24 h 内的 SD 大鼠 1015只，碘伏浸泡 5 min，固定四肢，75%的乙醇消毒皮肤，无菌眼科剪沿正中线
9、入剪，再次用 75%的乙醇消毒后沿胸骨正中入剪，注意避免剪破消化道以预防污染。无菌剪取心脏，仔细剥离心房及大血管组织，迅速置于预冷的不含 Ca2+、Mg2+的 PBS 中，反复冲洗 3 遍，洗去残留的血细胞，将其剪成 0.5 mm0.5 mm0.5 mm 大小的组KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 5 倍体积的 0.125%的胰蛋白酶和 0.08%的胶原酶，37水浴，吸管吹打，消化 5 min 后弃上清。重复消化3 次，收集每次消化后的上清液，加适量(与上清液等体积)含 10%新生牛血清的 DMEM 培养基，终止消化酶的作用。细胞悬液经 200 目孔径不锈钢网滤除未消化组织，上清液离心
10、10 min(850 r/min)，弃上清液，用含 15%的新生牛血清、100 万 U 青霉素、100 万 U 链霉素、pH=7.15 的 DMEM 培养基吹散沉淀细胞，接种于培养瓶中，CO2 培养箱(37，5% CO2，95%空气)中静置培养 85 min，将培养液转移(差速贴壁)至明胶处理过的 24 孔培养板，CO2 培养箱中继续培养，隔天换培养液，前 3 天加入 0.1 mmol/L BrdU 抑制成纤维细胞生长。取培养 72 h 的单层细胞进行实验。1.4 心肌细胞质量评价1.4.1 心肌细胞形态学观察 光镜观察，常规倒置显微镜观察细胞形态。在倒置显微镜下观察培养液色泽变化;观察心肌细
11、胞生长状态、形态变化;同时观察心肌细胞搏动的频率、节律、强度及范围，以判断心肌细胞培养是否成功和细胞生长是否良好。1.4.2 台盼蓝拒染法计算细胞活力 心肌细胞用 0.125%胰蛋白酶消化，充分吹打，制成单细胞悬液，稀释成 2108 个/L，取 9滴细胞悬液移入小试管中，加等量 0.4%台盼蓝溶液，混匀后用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞数。镜下观察，死细胞染成蓝色，而活细胞拒染。细胞存活率=活细胞数/总细胞( 活细胞+死细胞 )数100%KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 心肌细胞纯度鉴定 心肌肌钙蛋白(cTn)免疫荧光鉴定计算心肌细胞比例：心肌细胞培养 4 天后弃培养液，4%多聚甲
12、醛固定 1020 min，滴加 cTn多克隆抗体(兔多克隆抗体 150)，4 48 h;FITC 标记二抗(羊抗兔 1100)避光孵育 2 h;液体石蜡封孔，荧光倒置相差显微镜观察、拍照。取 6 个视野拍照，计数荧光阳性细胞数作为心肌细胞数(n1)，镜下计数细胞总数目为(N1)。按公式计算：心肌细胞比例=n1/N1100%。2 结 果2.1 倒置相差显微镜形态学观察 心肌组织消化后所有细胞均为圆形，培养 12 h 后可见梭形细胞，细胞逐渐增大，少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动;24 h 可见多角形细胞，并始见较多细胞搏动;48 h 细胞形态为多角形或梭形，细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形
13、成细胞簇或细胞单层，铺满瓶底，有聚集生长趋势，形成所谓功能性合体细胞。72 h 可见 96%以上细胞自律搏动，搏动频率、节律、强度稳定，频率 70130 次/min;大部分细胞相互连接，呈现同步搏动，同一批细胞的搏动频率一致(图 1)。用含血清培养液培养 2 周后细胞搏动逐渐减弱，体积逐渐减小，1 个月后逐渐死亡;而用无血清培养液较含血清培养液培养的细胞搏动弱、体积小，存活时间短。2.2 心肌细胞活力测定结果 台盼蓝染色示活细胞数96%。2.3 心肌细胞纯度鉴定结果 心肌肌钙蛋白免疫荧光检测心肌细胞为梭形或多角形，纯度95%(图 2)。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 2 cTn鉴定心
14、肌细胞纯度 (免疫荧光，200)3 讨 论心肌细胞增殖能力低，大多数的实验来源于心肌细胞原代培养，原代培养成功与否直接关系到实验的进程，提高心肌细胞的存活率和纯度是心肌细胞培养成功的关键。我们对传统心肌细胞培养方法的进行了改良，总结如下。3.1 新生大鼠鼠龄的选择 以往的观念认为新生大鼠在出生后 3 天内心肌细胞都有增殖能力，可用于心肌细胞培养，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖的能力。 但大鼠出生后时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。笔者通过大量实验观察认为最好选择出生 24 h 内新生大鼠，其心肌细胞培养效果最佳。3.2 避免污染注意事项 手术操作过程严格
15、无菌操作，动作迅速，尽量缩短心肌缺血缺氧时间。开胸前不要用碘酒消毒乳鼠皮肤，因碘酒易造成污染，宜用 75%乙醇消毒;开胸时应尽量只剪开胸廓，不要打开腹腔4;培养皿、血清、培养液、手术器械等要严格消毒;培养过程中每一步操作都应严格遵循实验原则和无菌要求;心肌细胞的观察、照相时间不可过长，次数不可太多，以每天不超过 2 次，每次不超过 5 min 为宜，否则能增加污染机率。3.3 新生大鼠心肌细胞的分离 传统新生大鼠心肌细胞的分离方法有组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞生长而较少采用。消化法中较常用的消化酶有 3 种：KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 主要用于消化细胞间质中的胶原纤维，以释放心肌细胞，对细胞损伤小，但难以消化完全6;透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用4。在新生大鼠心肌组织中以胶原为主，故我们选用胶原酶4，现配现用。本研究选用胰蛋白酶浓度为 0.125%，胶原酶浓度为 0.08%，并进行分次消化以减轻胶原酶或胰蛋白酶对单细胞的破坏作用。消化温度在 3537左右，温度过高会增加
