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1、浙江大学硕士学位论文内嗅皮质在急性应激反应中的作用研究姓名：李婷申请学位级别：硕士专业：精神病与精神卫生学指导教师：朱婉儿20060501巅鞑太学璇圭磷巍生学位谂宠A e 罩 薹建魏蕊，A 譬e 袋H嚣器譬走8 纛B 矗0 CG R秘融掇8拄壤，m m蝴热韩8英文缭略添戳酞凇。c 0 蚝i 淞p 撼e 瓤爨黼n e塞扮翻粥i so f v 群瓿掘等鹄】捌n ec e n # 撒e 敞c 。f 赫蹦融- 蝌妊s 轴gb 雕糖锹瓣裁遥哇e 牲稿；孺商霉托缸蔼料蛙# 甚蕊疰眷挂娃趣扣越蜒臻畦辫蹦荽嚣e 埘掰u c o f t k o 埘g 耙o 雌e 西d 糌戡l l t 。r玛l p I d 墩鑫
2、妇蛾咧船i 掘F y 喇f 锻x 畦i 掰撒搴藤踟嚣a yg 趣瓣戚珏蟪# 趣拈疽n l I 女em i l l 淄测糕l i l i i 穰挝姆浙扭犬学硕士研究生学位论文M RP B SP V N攀mS E肛gu lH 糟r n i n e r a l o c o n i c o i df e c e p t o r曲o s p b a t I b u 蕊娥翻j n e魏冀站也越凇i e 爹a 精￥壤建疽e u l 科攮 西e H sr o u n d 8p e f m J m u 船甜珈嘲a r de 啪rm I c r O g I a mm i c r o l i 诧rB l l e f
3、 O 撼e e r2浙江大学硕士研究生学位论文内嗅皮质在急性应激反应中的作用研究浙江炎擎涯擎赛精耱病奄耪舜黧生学硕士研党生渗婷导师朱婉儿【摘要】目酶；探讨内嚷皮质在慧性应激爱应中的律带。材拳萼和方法；1 实验韵物：雄性W i s t a r 大鼠，体重2 8 0 士2 0 9 ，每只大鼠单笼喂养。2 实验试剂：( 1 )药品鹅羔氨酸、台酷蓝；( 2 ) 兔抗疑多赢隆c F o s 捩体；( 3 ) A B c 试斋l 盒和D A B 底物试剂盒。3 实验方法：所有动物在饲养7 天后随机分为4 纵：正常对照缀( e ) 、束缚应澈组( 1 ) 、生理盐东注骞| 双侧内溪皮藏+ 寐缚应激缝( 嚣e
4、 )和鹅羔氨酸损毁双侧内嗅皮质+ 束缚应激嘏( E s ) 。用鹅羔氨酸损毁E s 组大鼠双弱帮囊皮菝，2 爝戳蠢，辩l 缀、E c 组、E s 组燕立怠性隶缛痘激模型 、套仁体、捐馨强帮嚷躅皮霞# ( 2 ) 蠢籀逡爨投溺程瘫铡鹜援襄 l l f 郝梭强：( 3 ) 额辞麴黢跨辅部分，氛摇醒颧瘦菝、藏颡时悫铡。边缘系缆又存囊驻藏之称，葵主要凌能楚簿令访援存显食、瓣餐、静族延续生殖行为) 、蠹驻瀵韵帮壤缝镧节等鸯关，冈露还每迎忆活动蠢荚。霆2 边缘系统续擒模式蚕瓣注：A 哪帮a 融密仁棱；转勰砖釉廊豫融萋褒 l 誊躲：飘歉峨辍le o 瓶x ：蓦萋颠# 辛皮震：M 鳓鞋铆b o d y ：乳头
5、体：熟撼甜c o 曛c x 蹊皮凌；| 蔓i p p 。饿n p 黼：海骂；强a a 掰粥：丘貔；孙m j x ：寄淹。逸缘系统参每寝激爱黩中琢，A 鞠豹调节穗经麦大罴磅究掰涯窭，铡翔，蒯激鸯仨棱魏激潘瓣A 辘，露鸯仨稼巍溺袋孛央拔群熬攒镌辘减多癍激g | 莛秘A 殴瓣鞠，或疫蔟蕊豹分泌。损伤藏额时蠹穰皮质缝增麴京缚瘦激蜃A e 髓 积瘦震粥酌分泌敬及p v N 。年o s m 脒A 鲍袭达，说鞠瓣颧睁内髑皮矮瞧参与对 精A 喜囊匏调节“1 。撵为遗缘系绞蘸要缀或帮努麴海强，在藏滋过程中，参与熬台感翔馕蕊、勰膳环壤铸惫的意义、调整行灸爱瘦与瓣经蠹分泌夏疫。海弩是簸辫掇，A 毒鸯璃齄酌海汪大学硬
6、圭研究垒学证论文高位调节中枢。它不仅参与静息状态下H P A 轴昼夜节律的调节，而且还参与应激时磁醵辖酶受凝镄调节“”。嗣属于边缘系统的内嗅皮质，在人类棚当发达，位于人脑的腹内侧，构成海马旁阐前部的大部，相当于B r o d “l a l l n 第2 8 氍。其头端始于颓极后，头端内侧与杏仁梭相邻，尾端结束予外侧膝状体头端乎蕊，内侧紧连海马的前下托、旁下托，外侧以侧副沟为界与嚷周皮质相接。内嗅疫质秘海马之鲻存在丰富静纤维投射和功能联系，在动物实黢中表明：，视觉、听觉和感觉信号缀顶枕颞交界、边缘系统和前额叶三处的联合皮质加工之后，转递| 4 近海马皮质姆嗅周皮斌，再到癌嗅皮质、齿状回、海马、海
7、马下耗，最后樽回到内嗅皮质，内嗅皮质褥将信息阐传至新皮质的联合区( 图3 ) 。在遮一通踞中，内啖皮囊有赞调节输入和输出的双向作用“，被认为是海马翱大脑新皮质联系的“桥梁”部位“”。图3 海马和内嗅皮质之间的纤维联系丈量研究袭明海马猩应激时对H P A 轴越着非常麓要的调节作用，德有关内喷皮质畿应激反应中的作用相对研究较少。u e l l a r a 等报道损毁大鼠双侧内嗅皮崩可l i 改变杏仁核内由足底电击或心理应激S 起的多鬯胺神经递质的分泌o 。s u n a n d a 等研究发现，损毁双侧内嗅皮质可以抑制由慢性束缚应激引起的海马神经元损伤。4 。法说明内囔皮质参应激反应瓣调节。浙江大
8、学硕士研究生学位论义朱婉儿等以往的研究发现，损毁大鼠双侧内嗅皮质，能抑制由束缚应激诱导的血浆A c T H 含量的上升。“，但损毁大鼠双侧内嗅皮质对由束缚应激诱导的下丘脑P v Nc F 0 s 表达的影响并不明确。本实验通过观察损毁大鼠双侧内嗅皮质对由束缚应激诱导的下丘脑P v Nc F o s 表达的影响以及应激后血浆A c T H 含量的动态变化，进一步探讨内嗅皮质在束缚应激反应的作用及其机制。浙江太学硕士研究敷学位论文一、实骏动物耱瓣器方法2 8 只雄性w i s t a r 大鼠，清沽级，鼠龄3 个月左右，体重2 8 0 2 0 9 ，购于中国程攀浣上海实验魂秘巾心。每只夫惑单笼喂养
9、，囊然先碴鲻期，控裂囊涅( 2 52 ) 。适应期间所有动物自由饮食和饮水，每天接受3 m i n 抚摸。二、药赫及试捐试裁公司鹅羔氨酸( i b o t e n i ca c i d )s i g m a美国台酪簸( 哿p S n b l )s i g m a美国兔抗鼠多克隆c F o s 抗体s a n c ac r u z美国A B c 试翔盒v l 美匡D A B 底物试剂畿v e c t o r美国4 正常山羊血漓s i 鳓a美国其蟪一般药箍及试剂；己醚，翳素生理鼓水，E D 强，戊避比妥钠，多聚甲醛，P B s ，蔗糖，双氧水，甲醇，n i t o n x 一1 0 0 。仪器公司
10、鼠脑崴体定位仪N 撕s l I i g e日本 离心枫Ken出。美蓉8 0 低温冰箱H a i e r中国冰冻切片机L e i c a 公司德国显微镜O l 蹦p u s日本三、实验程序渐江大学硕士研究生学位论盘l 、动耪分组藤有蘑物在镯葬7 最后隧楗分为4 缀：燕常对照组( e ) 、索缚艨激组( ) 、生瑶盐疼注瓣蕊餐l 蠹嗅皮质+ 束缚应激缀 秘辩羔氨教按毁双铡肉漠疫震求缚瘟激缝( E s ) 。繇组7 只。2 、建立内嚷皮质损伤模藏对E c 、E s 组大鼠，屠戊巴托妥钠( 5 0 m 醇g ) 腹腔注射麻醉赢，将其圈定在鼠脑立体定位仪( N a r i s l l i g e ，日本
11、) 上，充分暴麟颅骨餍，参照大鼠脑图谱。分捌在双侧内嚷皮质处( 戳前褒为零点，A P = 一6 0 4 m m ，M 6 5 0 m m ，D v= 一7 0 0 m m ) 注射O 2 台盼蓝生理盐水( E c ) 或鹅羔氨酸( 1 5 u g MO 2 台盼蓝嫩璞盐承，E S ) 。不锈锅注辩针被西藏建立体宠健靛上，其矫口矗径为2 8 H m ，一端对向注射部位，粥一端通过一根长为3 0 c m 的礁橡胶胶管连接着一个1 o u l酶注射器。针、导管和注射器内充满着淀瓣液，在确定注射遽畅后调节立体定位仪让注射针进入脑组织。注射薰为瓴l u l ，速度为O 1 u l m i n ，淀射完毕
12、艏留针5 m i n 。手米嚣的大鼠嚣鞭笼恢整 4 天蓐迸行束缚应激遗模。熬4 夫飘藏强谱( 箭头掰暴搀内蠛瘦痿辩夔)浙挝犬学顿士研究生学位论文3 、颈静赫接管对备组大鬣于应激造模莪一：怒壤行颈静默捶簿，擞寒攒采巍翅。在乙醚癍辫下将大敞用帮式法国建，鬃露密铡琰静脉，餐置经颈游躲表心麝捶警。穗橡获播管凌宽瀵野豢生避盐拳( 1 0 u 矗n 1 ) ，进入静赋内2 5 c m ，以保证其一端进入在心痔，努一端抒结瓣 l l 露越建手头颈饕郭。缝会拯器，将捶警基豹大鼹蔽露原笼照掌喂养。4 、建立急住束缚成激横鼙在实验的当天上午8 时，揽所有大鼠髓其原笼搬列实验宣。对l 、E C 、E s组大鼠，采用
13、绳子捆绑丈鼠四肢，使其俯卧固定在术扳上，应激l 小时后松绑放回原笼。为缩小生理两期对激素分泌的影响，全部实验帮控锖在l 氇O 1 3 ：之内完成。对C 组大鼠只是把大鼠搬到实验室里放置，不使奠遭受威激，也不让冀着至其京大鬣遭皮激的场帮。S 、血浆标本采取予密验开媲l ，j 、封瓣投套静躲缮管是誉遽畅。农安猃裁靼嘉8 、开始嚣l s m 赫、3 0 蛾n 、6 0 m 澈、9 0 m h 鞠1 2 0 妇n 对分别从静脉插管中采取阻撵l m l ，妓入E D T A抗凝试蓉，以3 钢嚣转速裹心2 0 搬i n 。取上演血浆球冷藏予一2 0 冰戆，鑫用放射免疫方法测定血浆A c T I 浓度( 标
14、本遴检) 。在采血l m l 后即刻，厦注入l 翻翳豢生理盐水，鼓避受其循环彀容量毂敞少。6 、心薹窿滚滚其体操作步骤如下：各缀丈羁l I 【疰寒次采血后腿援巴比爱钠深麻醉4歼胸暴鼯心脏浙江大学硕士研究生学位论文用眼科剪剪开心尖将灌流针头经左心室插入主动脉快速灌注3 7 生理盐水1 5 0 I I l l4 固定液( 4 多聚甲醛，O 1 M P B s 配制，P H 7 4 ) 2 0 0 2 5 0 r n l 灌流持续3 0 1 1 1 i n 以上( 先快速冲灌l I l l i ，后调慢速度) ，直致躯体、四肢僵硬断头，剥离鼠脑修块4 固定液( 4 多聚甲醛，O 1 M P B s
15、配制，P H 7 4 ) 固定2 4 h放入3 0 蔗糖溶液( 0 1 M P B s 配制) ，4 保存，直致脑块下沉到瓶底经脱水后的脑块，用干冰快速冷冻后放入一8 0 低温冰箱保存。染色前使用冰冻切片机连续冠状切片，片厚4 0 u m ，片距1 2 0 u m ( 隔三取一) ，收集于0 0 1 M P B S 中。浙江大学硕士研究生学位论文7 、组织学和免疫组织化学方法切片分为2 组。分别进行常规的N i s s l 染色和c - F o s 的免疫组织化学染色。N 1 s s l 染色用于确认内嗅皮质神经核团损毁的正确性和有效性，剔除损毁不成功例。7 1 N i s s l 染色将切片
16、放入2 班的N i s s l 染液l3 7 温箱放置6 小时I取出切片用蒸馏水冲洗I用体积比为0 7 的乙醇迅速洗去浮色I加入N i s s l 分色液中I直至背底无色，细胞呈紫蓝色7 2c F 0 s 的免疫组化染色过程采用自由漂浮法，具体步骤如下( 其中P B s 代替一抗作阴性对照) ：脑切片用O 3 双氧水甲醇孵育3 0 r n i nP B S ( 0 0 1 MP H 7 4 ) 漂沈，5 I I l i n 3 次J0 3 T r i t o n x 一1 0 0 ，_ P B S 孵育2 0 nl激匹大学硪士醑究生学位凳文P B s ( 0 O l M P H 7 4 ) 漂- 执，5 n l i n 3 次；4 正常山羊血L 清( P B s 稀释) 封闭；室温孵育1 0 觚n；倒去血清滴加1 ：1 0 0 0 稀释的一抗( c
