《剔毒护肝方及其拆方对大鼠骨髓干细胞增殖分化的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《剔毒护肝方及其拆方对大鼠骨髓干细胞增殖分化的影响（37页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、湖北中医学院硕士学位论文剔毒护肝方及其拆方对大鼠骨髓干 细胞增殖分化的影响俨究生姓名指导教师蛀名、职球学斟、专业名称研究方向聂广土任帅张红梅副主仨技师中西E 辐音临床中百目精音治疗肝病中文摘要目的：骨髓干细胞是当前成体干细胞研究的热点，关于其多向分化潜能的研究更是层出不穷，在一定条件诱导作用下，可分化为多功能细胞，形成各种类型组织和器官，已有研究证实骨髓干细胞可向神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞等转化。体内外研究已证明骨髓干在肝细胞生长因予( H G F )和肝内微环境下可分化为肝实质细胞。但利用中草药诱导骨髓干细胞向肝系分化的尚少有研究。剔毒护肝方主要由黄芪、莪术、叶下珠经一定比
2、例配置而成，是导师聂广教授经长期临床实践和动物体内外实验总结出的经验方。本研究采用剔毒护肝方及其拆方含药血清对大鼠骨髓干细胞进行诱导培养，观察其对骨髓干细胞增殖作用和向肝系分化的影响。方法：w i s t a r 大鼠4 0 只，雄性，s P F 级，体重2 2 0 2 0 9 ，随机分为7 组：剔毒护肝方组、黄芪组、莪术组、叶下珠组、生理盐水对照组、肝再生血清组、骨髓干细胞分离组，全部正常饮食。将剔毒护肝方组( 1 9 m 1 ) 及叶下珠( O 4 9 m 1 ) 、莪术( 0 3 9 m 1 ) 、黄芪( O 3 9 ，m 1 ) 组、生理盐水对照组，每日分别以l O m l k g体重
3、灌喂大鼠。灌胃前在水浴箱内加热药物，每天2 次，连续3 天，于第4 天1 次给予金日剂量，1h 后，2 戊巴比妥钠麻醉后下腔静脉无菌取血，离心得到药物血清，同组大鼠药物血清混匀，经5 6 ，3 0 m i n 灭活，2 0 保存备用。取W i s t a r 大鼠1 0 只，腹腔2 戊巴比妥麻醉，固定于手术台面，常规消毒腹部，铺手术洞巾，于腹中线剪开约3 c m ，暴露大部分肝脏，手术切除肝左中右叶约占全肝的7 5 ，术后灌服1 0 葡萄糖水给予支持治疗。于肝大部分切除术后2 4小时，从大鼠下腔静脉采血，制备血清，2 0 冷藏备用。w i s t a r 大鼠体重约2 6 0 9 ，颈椎脱臼处
4、死，置于7 5 酒精消毒1 0 m i n 。于无菌条件下取出两侧股骨，剪断两端骨骺，用L D M E M 培养液反复冲洗骨髓腔，细胞悬液1 5 0 0 r p m m i n 离心5 m i n 去除脂肪层。重悬细胞用比重为1 0 7 7 9 m l 的p e r c o l l 分离液分离，取中间界面层，用L - D M E M 培养液洗涤2 次。苔盼蓝计数，将细胞以1 1 0 6 m l 密度接种于培养瓶，于3 7 ，5 c 0 2 培养。4 8 h 换液除去未贴壁细胞，每3 d 换液1次，待细胞长到基本8 0 融合，以1 ：2 传代。将生长第2 代细胞以5 1 0 5 m l密度接种于
5、9 6 孔板，每孔1 0 0u1 ；第2 天吸弃培养液，以含各组含药血清或肝再生血清1 0 的培养液作用于骨髓干细胞4 8 h 后，每孔加入5 m g m lM T T 试剂2 0 扯l ，继续培养4 h ，小心吸弃培养液，再加入二甲基亚砜1 5 0 “1 ，放震荡器震荡1 5 m i n ，使沉淀充分溶解。用酶标仪( 九4 5 0 n m ) 测每孔O D 值，实验重复2次。通过噻唑氮蓝( M T T ) 比色法检测含药血清处理4 8 h 对骨髓干细胞的增殖率。M T T 比色法的基本原理是活细胞能代谢M T T 形成蓝色不溶解的甲瓒( F o r m a z a n ) ，甲瓒形成量与活细
6、胞数及功能状态呈正相关性。计算公式：细胞增殖率= ( 用药组O D 值对照组0 D 值) 对照组O D 值1 0 0 。采用免疫组化法检测骨髓干细胞肝系标志( A F P 、白蛋白) 表达情况，取诱导培养的第7 天和1 4 天的细胞，胰酶消化后细胞悬液滴于硅化玻片，6 h 后4 多聚甲醛固定，3 H 2 0 2 去离子水浸泡1 5m i n 以封闭内源性过氧化物酶，加一抗4 过夜，依次滴加二抗和D A B 显色，最后常规脱水透明，中性树胶封片。分别敢诱导培养后第7 天的细胞并将细胞裂解和第1 4 天培养上清，采用放射免疫定量分别检测细胞裂解物和细胞上清中A F P 、白蛋白分泌量，具体按试剂盒
7、说明书操作。R T P C R ：引物设计。白蛋白，正义：57 蛆A C A C C C A G A A A G C A C C T C3 ，反义：5 C A C G A A T T G T G C G A A T G T c A C3 ，4 3 6b p ；A F P ，正义：57A A c A G c A G A G T G C T G C A A A C37 ，反义：57A G G T T T C G T C C c T c A G A A A G36 8 6b p ；G A P D H ，正义：5 A T o G G G A A G G T G A A G G T C G G A G
8、T C A3 ，反义：5 T T A C T C C T T G G A G G C C A T G T G G G C C3 ，1 0 0 0b p 。T r i z o n 试剂提取细胞总R N A ，扩增条件：5 0 3 0 m i n ，9 4 2 m i n ，9 5 2 m i n ，( 9 4 5 0 s e c ，5 6 5 0 s e c ，7 2 1 m i n ，3 5 c y c l e s ) ，7 2 1 0 m i n 。将扩增产物l 琼脂糖凝胶电泳成像。最后从肝系功能方面检测诱导细胞合成糖原情况。细胞铺片同免疫组化，c a r n o v固定液固定，0 5 高碘
9、酸反应1 5 秒，无色品红闭光反应3 0 m i n ，偏亚硫酸钠反应1 5 秒，苏木素复染，常规脱水透明，中性树胶封片。结果：经各组血清培养4 8 h 后，剔毒护肝方组、黄芪组和肝再生血清组显示对大鼠骨髓干细胞有增殖作用，增殖率分别1 0 4 、1 4 _ 3 和2 6 ，5 。莪术和叶下珠组显示对其抑制。免疫组化结果示剔毒护肝方组、黄芪组、肝再生血清组，A F P 和白蛋白表达情况强于其它组，肝再生血清组明显强于剔毒护肝方组和黄芪组，该两组表达无明显差异。放免定量结果示A F P 定量剔毒护肝方明显高于其它组，白蛋白定量示各组无明显差异。R P c R 未有阳性结果出现。糖原检测示剔毒护肝
10、方组、黄芪组、肝再生血清组可见糖原阳性表达。2结论：剔毒护肝方组、黄芪组含药血清对骨髓干细胞有增殖作用，通过肝系细胞，表型和功能两方面检测示，该两组可诱导骨髓干细胞横向分化为肝实质细胞。剔毒护肝方发挥主要作用的可能是黄芪，但剔毒护肝方的作用强于黄芪组，说明组成剔毒护肝方的三位药不是简单的叠加，方中莪术和叶下珠也发挥了一定的作用，其具体促进分化的机制还有待进一步研究。主题词：骨髓干细胞剔毒护肝方及其拆方含药血清增殖分化A F P 、白蛋白、糖原A b s t r a c tO b je c t i V e ：B o n em a r r o ws t e mc e l l s ( B M s c
11、 s ) i st h eh o ts p o “nt h en e l do fs t e mc e l l s T h es t u d ya b o u ti t sm u l t i d i r e c t i o n a ld i f 五。r e n t i a t i o ni se m e r g i n gi ne n d I e s s l y I ns o m ei n d u c e dc o n d i t i o nB M S C sc a nb ed i f 诧r e n t e di n t om u l t i f u n c t i o n a lc e l
12、l s ，a n ds h a p ev a r i o u sk i n d so ft i s s u e sa n do r g a n s S o m ee x p e r i m e n t sh a V et e s f i f i e dt h a tB M S C sn l a yb ei n d u c e dl i k en e u r o n a l ，m y o g e n i c ，v a s c u l a re n d o t h e l i a la n dl i V e rc e U s I nv i v oo rv i t r oe x p e r i m
13、e n t sh a v ea p p o v e dt h a tB M S C sc a nb ed i f & n e r t i a t e di n t oh e p a t i cp a r e n e h y m a lc e n sb yh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r ( H G F )a n dt h eo r g a n - s p e c i 丘ce n v i f o n m e n t B u tu s i n gt h eC h i n e s eh e r b a lm e d i c i n et od i f
14、 f e n e r t i a t eb o n em a r r o ws t e mc e l l si n t ol i V e rc e l l si sr a r e T i d uH u g a nr e c i p ei sc o m p o s e do fa s t r g a l u s ，z e d o r ya n dp h y l l a n t h u sw i t hs o m ep r o p o r t i o n T i d uH u g a nr e c i p ei sm ya d V i s t o 卜N i ep r o f e s s o r s
15、e m p i r i c a lr e c i p e ，w h os u m m a r i z ei tt h r o u 曲h i sl o n g - t e r me x p e r e n t a la n dc l i n i c a ls t u d y E x p l o r ew h e t h e rb o n em a r r o ws t e mc e l l s ( M S C s )f r o mr a tc a nb ei n d u c e dt od i f f 色r e n t i a t ei n t oh e p a t o c y t e sb y
16、T i d uH u g a nr e c i p ea n ds e p a r a t e dr e c i p e s ( a s t r a g a l u s ，z e d o a r ya n dp h y l l a n t h u s )M e t h o d ：4 0W i s t a rm a l er a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o7g r o u p s ：T i d uH u g a nr e c i p e 、a s t r a g a l u sg r o u p 、z e d o a r yg r o u p 、p h y l l a n t h u sg r o u p 、S o d i u mC h l o r i d eo fn o r m a lc o n t r o lg r o u p 、h e p a t e c t o m i
