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1、细菌内毒素检查法测定利巴韦林注射液摘要 目的:建立利巴韦林注射液的细菌内毒素检查方法。方法:参照中国药典1995 年版二部收载的细菌内毒素检查方法进行实验。结果:通过干扰实验证明，利巴韦林注射液对鲎试剂的凝集反应无干扰作用，用灵敏度为 0.5 EU.ml-1 的鲎试剂检查细菌内毒素的方法可行、有效。结论:可以用细菌内毒素检查法替代家兔热原法来控制三磷酸腺苷二钠注射液的质量。利巴韦林注射液(ribavirin injection)为抗病毒药。现有标准采用家兔法进行热原检查1 。本文采用细菌内毒素检查法，通过干扰实验，建立了其细菌内毒素限量检查的方法，现报道如下。1 材料鲎试剂(TAL，湛江安度斯
2、生物有限公司，批号：981113，规格：=0.5 EU.ml-1，并经复核符合规定)；细菌内毒素工作标准品(中国药品生物制品检定所，批号：9808，效价：40 EU.支)；细菌内毒检查用水(BET 水，湛江安度斯生物有限公司，批号：981211，内毒素含量0.015 EU.ml-1)；利巴韦林注射液(苏州第六制药厂，批号：990223，990224，990225，规格 1 ml100 mg，经热原测定均符合规定)。2 方法与结果2.1 细菌内毒素限值(L)的计算 标准1的热原检查(RT)方法是：将本品用氯化钠注射液稀释成含 20 mg.ml-1 的溶液，剂量按家兔体重注射 2 ml.kg-1。
3、即剂量(M)：40 mg.kg-1，人体致热阈值(K)：5.0 EU.kg-1，则 L=K/M=0.125 EU.mg-12 。2.2 最大有效稀释倍数的确定 将本品用 BET 水稀释成 20 mg.ml-1 的溶液，其中细菌内毒素限度应不得超过 0.12520=2.5 EU.ml-1，则对应于灵敏度()：0.5，0.25，0.125，0.06，0.03 EU.ml-1 的鲎试剂，选择的稀释倍数分别为5，10，20，40，80 倍。2.3 干扰试验预试验 取 1 批 RT 检查合格的供试品，用 BET 水将其配制成20 mg.ml-1 的溶液，再作 5，10，20，40，80 倍稀释。用每个稀
4、释度溶液来溶解并稀释细菌内毒素工作标准品，使内毒素的含量均为 1.0 EU.ml-1，与鲎试剂(=0.5 EU.ml-1)反应，并作阴性对照。每个稀释度做 2 管，结果本品对细菌内毒素检查未见抑制作用。2.4 干扰试验 取 3 批 RT 检查合格的供试品，用 BET 水配制成 20 mg.ml-1 的溶液，再稀释 5 倍后，分别用此溶液和 BET 水将细菌内毒素工作标准品稀释成1.0，0.5，0.25，0.125 EU.ml-1 的溶液，与鲎试剂(=0.5 EU.ml-1)进行反应。每个浓度做 4 管，结果见表 1。从表 1 的结果看，鲎试剂在 BET 水和 3 个批号供试品中的 值为 0.4
5、20.50 EU.ml-1，均在 0.52.0 范围内，符合中国药典3对细菌内毒素检查有效性的规定。表 1 利巴韦林注射液干扰试验结果内毒素浓度(EU.ml-1)灵敏度EU.ml-1样 品阴性对照 0.125 0.250.51.0BET 水-+0.50990223-+-+0.42990224-+0.50990225-+-+0.42注：灵敏度 2.5 细菌内毒素检查实验 根据 2.4 项下的结果，选用 为 0.5 EU.ml-1 的鲎试剂进行实验。取 3 批 RT 检查合格的供试品，用 BET 水配制成 20 mg.ml-1 的溶液，作 5 倍稀释后依法3检查，并增设(2)的供试品阳性管，结果见
6、表 2。从表 2 的结果看，供试品和阴性对照管均呈阴性，供试品阳性管和阳性对照管均呈阳性，实验结果成立。3 个批号供试品的细菌内毒素检查均符合规定，与家兔法结果一致。表 2 利巴韦林注射液的细菌内毒素检查结果供试品 试验管别 990223 990224 990225供试品管-供试品阳性管(2)+阴性对照管-阳性对照管(2)+3 小结 试验结果表明，本品对鲎试剂的凝集反应无干扰作用，用细菌内毒素检查法来替代家兔热原法对利巴韦林注射液进行质量控制是可行的。方法是先将样品用 BET 水配制成 20 mg.ml-1 的溶液，作 5 倍稀释后，与灵敏度为 0.5 EU.ml-1 或灵敏度更高的鲎试剂反应，结果稳定、可靠。参考文献1卫生部药典委员会编.药品标准第六册、生化药品第一分册S.1998：492夏振民.药品细菌内毒素检测限值J.药物分析杂志，1995，15(3)：543中国药典S.1995 二部.附录：76
