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1、腐隶酱擎院硕士学位论文广东湛江- - 00 六年五月学位论文独创性声明本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得广东医学院或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。作者签名：罗守日期：2 0 0 6 5 8学位论文知识产权声明本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果，知识产权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交导师，离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为广东医学院。学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以
2、采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。注：保密的学位论文在解密后适用本声明。作者签名：导师签名：日期：2 0 0 6 5 8日期：2 0 0 6 5 8e N O S 第7 外显子8 9 4 G - , - T 及第四内含子基因多态性与脑梗死关系的初探中文摘要I 目的I探讨内皮型一氧化氮合酶( e n d o t h e l i a lN O S ，e N O S ) 第7 外显子8 9 4 G - - - ，T 及第四内含子基因多态性在中国粤西地区汉族人群中的分布规律，并研究两组基因多态性与
3、脑梗死( C e r e b r a li n f a r c t i o n ，C 1 ) 的关系及两种基因的连锁关系，以期从基因水平探讨缺血性脑卒中的发病机制，为缺血性脑卒中的临床防治提供科学依据。I 方法1本研究采用病例一对照研究，选择中国粤西地区汉族人群1 3 0 例健康体检者( 对照组) 和1 4 8 例经C T 或M R I 证实的脑梗死患者( C T 组) 为对象，用聚合酶链反应限制性酶切片段长度多态性分析方法( P C R R F L P ) 和核苷酸序列测定技术相结合的分子流行病学研究方法检测内皮型一氧化氮合酶第7 外显予8 9 4 G - - - - T 及第四内含子基因多
4、态性，分析两组基因在正常人群及脑梗死患者中的频率分布特点，探讨两组基因多态位点与缺血性脑卒中的关系。I 结果】缺血性脑卒中组e N O S 基因外显子7 处第8 9 4 位T 等位基因频率为1 0 5 ，对照组为5 8 ，两组比较差异有显著性意义( 尸 00 5 ) ，高血压、胆固醇、甘油三酯两组间差异有统汁学意义( P 00 5 ( z 2 = D 2 n p q u v ，n 为群体数，P 、q 、u 、v 分别为两位点四个基因的频率，自由度d f - 4 ) ，结果表明两位点没有连锁不平衡关系。表37 例东粤西地区汉族健康成人基因两个多态性位点的连锁分析4 讨论c I 的发生与环境、遗传
5、等多方面因素相关，目前，对环境因素已经有了很深的认识，但是遗传易感性的分子基础还有许多不清楚，遗传学基础研究显示出多态性遗传因素的影响可能单独起作用或通过易感或调节己知的危险因素，高血压、高血脂及不良的生活习惯作为其发生的危险因素备受瞩目。缺血性脑卒中是危害人类健康的一类重要疾病，其发病的病理基础是动脉粥样硬化。研究表明e N O S 基因多态性与动脉粥样硬化密切相关q2 1 。N O 是目前公认的一种信息传递分子，在脑缺血损伤中具有神经保护和神经毒性双重作用“2 。，这主要取决于N O 产生的来源。一些实验研究表明，N O 可以阻止动脉粥样硬化的关键步骤，而且N O 分泌减少促进了动脉粥样硬
6、化的发展。事实上，N O 除了强有力的血管舒张作用，还抑制血小板的黏附和聚集【4 3 I ，影响黏附分子和趋化因子的表达【4 4 l ，防止炎症细胞浸润H s - 5 6 1 ，抑制平滑肌细胞迁移和增殖【4 7 4 8 1 。由于N O 性质活跃，不易准确测定，因而其合成酶_ N O S 成为近年缺血性脑血管疾病研究的热点。N O S 分为三种亚型，分别为n N O S ，e N O S ，i N O S 。不同亚型的N O S 在脑缺血损伤中的作用不同，n N O S 与i N O S 产生的N O与神经损伤有关，e N O S 产生的N O 贝J J 有神经保护作用，e N O S 和脑卒
7、中关系更为密切，编码e N O S 的基因的多态性决定了e N O S 的结构和功能【2 ”。目前关于e N O S 基因多态性与缺血性脑卒中的研究较少，并且多集中在单基因与C l f l “ J 关系。e N O S 基因多态性与缺血性脑卒中的研究结果不尽相同。本研究用P C R R F I 。P 和核苷酸序列测定等技术，对1 4 8 例缺血性脑卒中患者和1 3 0 例健康人e N O S 第7 外显子8 9 4 G - + T 及第四内含子基因多态性进行研究。初步分析了2 个位点基因频率在粤西地区汉族人群中的分布：2 个基因与缺血性脑卒中的关系，基因之问的连锁关系。4 1 第四内含子基因多
8、态性与c I 关系4I 1 第四内含子2 7b p V N T R 基因多态性的分布：自从W a n g 等1 3 0 l 报道了e N O S 基因第4 号内含子2 7 个碱基的重复多态性与血浆N O 密切相关之后，e N O S 第4 号内含子处2 7 个碱基重复序列的研究备受瞩目。e N O S 第4 号内含子存在2 7b p 插入缺失( a b ) 多态性，依据2 7b p重复次数不同有两种等位基因，重复4 次为a 等位基因，重复5 次为b 等位基因。不同种族和地域e N O S 基因2 7b p V N T R 多态性分型所占的比例不同。L i等例检测健康非洲裔美国人6 0 例，a
9、a 、a b 和b b 型分别为1 4 5 、2 7 5 和5 8 ：a 等位基因频率为2 8 3 。Y a h a s h i 等f 4 w 9 8 年对日本人该基因多态证与缺血性脑卒中的关系作了报道，1 2 7 例卒中患者( 其中1 8 例为血栓栓塞，5 8 例为腔隙性C I ，5 l 例为无症状腔隙性C I ) 与9 1 例对照者等位基凶频率比为0 8 6 2 0 8 6 8 ，缺血性卒中亚组中等位基因b 的频率比为0 8 8 9 0 8 6 2 08 5 3 。S h o j i 等I l 叫研究了1 9 3 名日本正常人e N O S 基因v N T R 多态性，发现a 等位基因在日
10、本人群中的分布频率为1 0 1 。国内路萍等1 5 0 J 检测在门诊体检的北京健康汉族人3 1 6 例，a a 、a b 和b b型分别为0 6 、1 6 8 和8 1 6 ，a 等位基因频率为0 9 。朴翔宇等f 5 1 检测大连市9 0 名健康成年人，a a 、a b 和b b 型分别为4 7 6 ，9 5 2 ，8 57 ，a 等位基因频率为9 4 。葛汝丽等1 5 2 1 研究了青岛地区健康汉族人1 1 4 例，a a 、a b 和b b 型分别为O 8 7 ，12 2 8 ，8 6 8 4 ，a 等位基因频率为7 。本研究分析了1 3 0 例中国粤西地区健康汉族人，发现其b 等位基
11、因频率为9 3 4 ，a 等位基因频率为6 6 ，基因型a a 、b b 、a b 的频率分别为0 8 ，1 2 3 和8 6 9 ，a 等位基因频率略低于北京地区汉族人大连地区成人及E t 本人，但较非洲裔美国人明显偏低，但与青岛地区健康汉族人的数据基本相近。4 1 2 第四内含子2 7b p V N T R 基因多态性与缺血性脑卒中：N O 是一种内皮细胞衍生舒张因子( E D R F ) ，具有显著而广泛，的血管扩张作用。而且基础水平的N O 释放减少，将会加速血管动脉硬化的进程。较多的研究均表明N O 参与了c I 的发生发展，而催化N O 生物合成的关键酶为e N O S ，而e N
12、 O S基因多态性与血浆N O 代谢水平相关。1 9 9 8 年T s u k a d a 等”川提出，e N O S 4 a 等位基因携带者，其血浆N 0 4 t ；谢产物比非a 等位基因携带者的N O 代谢水平下降2 0 。此后，e N O S 4 a b 基因多态性与缺血性脑卒中的相关性成为研究的焦点。到目前为止，e N O S 基因多态性与缺血性脑卒中的相关性分歧仍较大。Y a h a s h i 等f 4 0 1 9 8 年对日本人该基因多态性与缺血性脑卒中的关系作了报道，1 2 7 例卒中患者，认为在日本人中该基因多态性并不是缺皿性脑血管病的遗传危险冈素。2 0 0 1 年H o
13、u 3 5 1 等对8 8 0 例中国人的研究显示，e N O S 等位基因a 在缺血性卒中与对照组中的频率差异显著( 17 ：7 ，8 ；O R ：24 4 ；P 00 5 ) ，说明在中国粤西地区汉族人群中，第7 外显子8 9 4 G - - * 1 1 基因位点及第四内含子2 7b p V N T R 可能单独作用或和其他位点协同作用对c I 的发病产生影响。我们的研究结果提示：虽然e N O S 基因多态性在C I 的发病机制中的作用尚不_ 卜分清楚，但N O 在内皮细胞上的作用己十分清楚，内皮性N O 对内皮细胞有保护作用，若血管内皮性N O 系统活性下降可导致e N O S 基因产
14、物量下降，而引起心脑血管疾病。综合以上，我们的研究显示e N O S 第7 外显子8 9 4 G 一1 及第四内含子与缺皿性脑卒中的发病有关，而且两个基因位点之间并没有连锁不平衡的关系，提示e N O S 第7 外显子8 9 4 G - - + T 及第四内含子可能单独作用或和其他位点m 同作用对缺血性脑卒中的发病产生影响，是c I 遗传危险因素，至少是在中国粤西地区人群中。但C I 的发生与环境、遗传等多方面因素相关，非单一因素所决定的疾病，所以e N O S 篇7 外显予8 9 4 G T 及第四内含子与缺血性脑卒中的相关性研究，还有待进一步扩大研究对象的范围，并建立更为严格的筛选标准，以
15、避免分组，分层不同所造成的影响，加强多基因的连锁相关性的研究。5 小结5 1e N O S 第7 外显子8 9 4 G T 及第四内含子基因型频率和等位基因频率分布在不同的国家，种族及地域都存在差异。5 24 a 基因纯合子携带者发生C I 的风险是4 b 4 a 或者4 b 纯合子携带者的1 8 倍，等位基因a 可能是C I 发病的危险因素。5 3T 等位基因纯合子携带者发生C I 的风险是G T 或者G G 纯合子携带者的1 7 5 7 倍，第7 外显子8 9 4 G - - - + T 基因多态性可能是C I 的遗传易感基因。5 4e N O S 第7 外显子8 9 4 G T 基因位点
16、及第四内含子基因之间不存在连锁不平衡关系。参考文献【1 饶明俐王文志，黄如训，等主编中国脑血管病防治指南北京：卫生部办公厅2 0 0 5 ：1 【2 】E l b a zA ，A m a r e n c oE G e n e t i cs u s c e p t i b i l i t ya n di s c h e m i c s t o k e J 】C u r r o p i nN e u r 0 1 19 9 9 ，12 ：4 7 5 5 【3 P a b l o s m e n d e zA ，R i c h a r dM C o l l e e nN ，e ta 1 A s s o c i a t i o no f A p o Ep o l y m o r p h i s mw i t hp l a s m al i p i dl e v
