《纤维蛋白沉积对老年急性肺损伤大鼠肺组织内皮细胞功能的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《纤维蛋白沉积对老年急性肺损伤大鼠肺组织内皮细胞功能的影响（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、【摘要】 目的 探讨纤维蛋白沉积对不同鼠龄大鼠肺组织血管内皮细胞功能的影响。方法 青年及老年大鼠均随机分为 4 组，对照组(NC)腹腔注射生理盐水；脂多糖组(L)腹腔注射脂 多糖；氨甲环酸组(LT)注射脂多糖加氨甲环酸；尿激酶组(LTU)注射脂多糖及氨甲环酸加尿 激酶。应用免疫组化分析纤维蛋白沉积；应用 Western blot 和 Northern blot 分别检测肺组 织血栓调节蛋白(TM)、细胞间黏附分子1(ICAM1)、纤溶酶原激活剂抑制物1(PAI1)的 表达。结果 (1) 正常青年和老年大鼠肺组织内均无纤维蛋白沉积，脂多糖刺激后纤维蛋白 沉积增多，加用氨甲环酸纤维蛋白沉积更加明显
2、(P001)，应用尿激酶后纤维蛋白沉积 明显减轻(P005)；老年大鼠 L 组、LT 组和 LTU 组均比相同干预组的青年大鼠肺组织 纤维蛋白沉积明显( P005)。(2) 青年和老年大鼠给与脂多糖刺激后，ICAM1 和PAI1 表达明显上调( P005)，TM 表达显著下降( P001)；加用氨甲环酸后 ICAM1 和 PAI1 表达上调更加明显( P001)，TM 几乎无表达；给予尿激酶处理后， ICAM1 和 PAI1 表达与 LT 组比较明显下调(P005)，TM 表达增多(P005)；老 年大鼠 L 组、LT 组和 LTU 组CAM1 和 PAI1 的表达均较青年大鼠相同干预组显著
3、增多 ( P005)，TM 表达则显著减少。(3)经纤维蛋白沉积量校正后，老年大鼠肺组织ICAM1 和 PAI1 的表达量仍显著高于青年大鼠 ( P005)。结论 增龄能够促进脂多 糖诱导的急性肺损伤大鼠肺组织纤维蛋白沉积,增强纤维蛋白的内皮细胞损伤作用。 【关键词】 纤维蛋白；肺；炎症；内皮细胞外界有害刺激和炎症介质可直接激活内源性凝血通路，导致纤维蛋白沉积1 。肺组织 内大量纤维蛋白沉积是多种原因导致的肺部炎症的重要病理特征，目前研究表明纤维蛋白 沉积不仅仅是病理损伤产物，体外实验发现纤维蛋白具有内皮细胞损伤作用2，3 ，但其 在体内的作用并不清楚。本研究应用脂多糖诱导急性肺损伤动物模型4
4、 ，用氨甲环酸和 尿激酶调控纤维蛋白沉积水平，观察纤维蛋白沉积对不同鼠龄大鼠肺组织血管内皮细胞功 能的影响。1 材料与方法11 实验动物及模型制备 选用健康雌性 3 月龄 Wistar 大鼠(青年鼠)32 只，平均体 重(22020)g (北京试验动物中心提供)；27 月龄雌性 Wistar 大鼠(老年鼠)32 只，平均体重(42020)g，(解放军总医院实验动物中心提供)。适应性喂养 1 w 后，青年鼠和老年鼠分别 随机分为正常对照组(C 组)、脂多糖组(L 组)、脂多糖+氨甲环酸组(LT 组)、脂多糖+氨甲环 酸+尿激酶组(LTU 组),每组 8 只。参照文献方法，以脂多糖(LPS，Esc
5、herichia coli serotype 055B5,Sigma,USA)14 mg/kg 腹腔注射诱导大鼠急性肺损伤模型。NC 组大鼠腹腔注射生 理盐水 30 ml；L 组大鼠单纯腹腔注射 LPS；LT 组大鼠腹腔注射 LPS 30 min 后，给与氨 甲环酸腹腔注射(湖南洞庭药业股份有限公司，批号 021002)；LTU 组大鼠腹腔注射 LPS 30 min 后腹腔注射氨甲环酸，60 min 后股静脉注射尿激酶 2 500 U/ kg(丰原药业马鞍山药厂产， 国字准字 H34021690)。所有大鼠均于 LPS 注射 4 h 后，用 10%水合氯醛(04 ml/ kg)腹腔 注射麻醉，
6、处死留取标本。所取肺组织 1/3 用 10%甲醛固定制备石蜡包埋切片，其余肺组 织立即置于液氮冷冻，随后-70冰冻保存以作 RNA、蛋白质等分析。12 主要试剂 内毒素(LPS，O55B5) 、苯甲基磺酰氟(PMSF) 、抑胰肽酶(aprotinin) 、亮肽素(leupeptin) 购自 Sigma 公司；ACTIN 多抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔 IgG、兔抗羊 IgG、羊抗大鼠 MCP1 单克隆抗体、ECL 显色系统均购自美国 Santa Cruz公司；Trizol 试剂购自美国 TEL2TEST Int 公司；考马斯亮兰 G2250 购自北京邦定泰克生 物技术公司；随机引物
7、标记试剂盒购自宝灵曼公司。13 肺组织纤维蛋白免疫组化检查 组织蜡块 2 m 切片，常规脱蜡，3%H2O2 阻 断内源性过氧化物酶 10 min。005% 胰酶 37抗原修复 10 min，血清封闭 20 min(室温)。 加入纤维蛋白抗体 4孵育过夜。次日用 PBS 漂洗后加入生物素标记的山羊抗兔抗体室温 孵育 20 min。PBS 漂洗后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温孵育 20 min。PBS 漂洗，DAB 显色，苏木素复染细胞核，脱水、透明、中性树胶封片。空白对照片不加一抗， 其余步骤同上。应用 Imagepro plus51 软件进行图像分析。免疫组化染色切片在光镜下 放大
8、400 倍，每张切片随机选取 20 个不重叠视野，测定每个视野棕黄色(DAB)着色的平均 光密度值，取 20 个视野的平均值。14 大鼠肺组织 RNA 提取及 PAI1、TM、ICAM1 的 Northern blot 分析 利用 Trizol 一步法提取大鼠肾组织总 RNA，20 g 总 RNA 经 15%甲醛变性处理的 1%琼脂糖凝 胶电泳后，转移至尼龙膜，短波紫外交联固定，预杂交液 60预杂交 3 h。杂交探针通过 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法制备，ICAM1 的引物序列为正链：5GAT GCT GAC CCT GGA GAG CA3；负链：5CAG GGA CTT CCC ATC
9、 CAC CT3。扩 增条件为 943 min，9445 s，5530 s，7290 s，共 35 个循环，最后 72，延伸 10 min，终产物长度为 409 bp。PAI1 的引物序列为正链：5CAG GCC TCC AAA GAC CGA AAT GTG3；负链：5TAG AGG GCG TTC ACC AGC ACC AG3。扩增 条件为 945min，9445 s，60545 s，7245 s，共 35 个循环，最后 72，延伸 10 min，终产物长度为 437 bp。TM 的引物序列为正链：5GGT CAG CGG CGC GGA TTT TC3；负链：5CAT GGA TTG
10、GGC CCC TGC TTA CA3。扩增条件为 945 min，9445 s，6245 s，7245 s，共 35 个循环，最后 72，延伸 10 min，终产物长度 为 414 bp。32P2dCTP 随机引物法标记探针，42杂交 24 h，常规洗膜，-70放射自显影 72 h,以 28sRNA 作为内参校正 RNA 取样量，应用 Imagepro plus51 软件进行图像分析， 以与 28sRNA 吸光度的比值来表示其相对含量。15 大鼠肺组织总蛋白质的提取及 PAI1、TM、ICAM1 的 Western blot 分析 - 70冰冻保存的肺组织加入适量缓冲液进行组织匀浆，离心，取
11、中间清亮液体即为组织中 的总蛋白质。用考马斯亮蓝法测蛋白质浓度，取 100 g 总蛋白质变性，10% SDSPAGE 胶电泳，转至醋酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭。分别加 1100 抗 Actin、PAI1、TM 和ICAM1 抗体于 4过夜，01%TBST 洗膜后，再加 11 000 HRP 标记的 IgG 于室温反 应 1 h；01%TBST 再次洗膜后 ECL 显色。所得结果以 Actin 为参照，应用 Imagepro plus51 软件进行图像分析，以与 Actin 吸光度的比值来表示其相对含量。16 统计学分析 计量资料采用 xs 表示，同一鼠龄组内各处理组间差异比较采用 单因素方差
12、分析，相同处理的两鼠龄组间比较采用 t 检验和协方差分析。以相同鼠龄的 LT 组较 L 组表达的增加量为变量，进行 t 检验。统计软件采用 Stata 40。2 结果21 青年和老年大鼠肺组织纤维蛋白沉积水平变化 肺组织纤维蛋白免疫组织化学 染色结果见图 1，定量分析结果见图 2。青年鼠和老年鼠 NC 组肺组织内均无纤维蛋白沉积；经 LPS 刺激后，青年鼠肺组织内出现少量的纤维蛋白沉积，而老年鼠肺组织内纤维蛋白沉 积重于青年鼠(193%33%、116%24%，P005)；而在 LT 组，青年鼠和老 年鼠肺组织纤维蛋白沉积均较同鼠龄的 L 组明显加重(P001)，并且老年鼠重于青年鼠(335%5
13、7%、231%46%，P005)；同鼠龄 LTU 组的纤维蛋白沉积较 LT 组 均明显减轻(P001)。纤维蛋白广泛沉积在肺血管、肺泡内和肺间质中图 1 肺组织纤维蛋白免疫组化染色(400)（略）22 青年和老年大鼠肺组织 ICAM1 蛋白质和 mRNA 表达的变化 各组大鼠 ICAM1 蛋白质和 mRNA 表达的变化和定量分析结果如图 3、图 4 显示，蛋白质和 mRNA 的变化趋势相同。青年鼠和老年鼠 NC 组肺组织有很少量的 ICAM1 表达；L 组CAM1 表达明显增强(P005)，加用氨甲环酸后，TL 组表达较 L 组明显上调 (P001)；给尿激酶后 ICAM1 表达较 TL 组显
14、著减少(P005)；老年鼠各干预组CAM1 的表达均高于相应的青年鼠(P005)。经纤维蛋白沉积量校正，老年大鼠各 干预组CAM1 的表达仍显著高于相应青年大鼠(P005)。23 青年和老年大鼠肺组织 PAI1 蛋白质和 mRNA 表达的变化 各组大鼠 PAI1 蛋白质和 mRNA 表达的变化和定量分析结果如图 5、图 6 显示，PAI1 蛋白质和 mRNA 的变化趋势与 ICAM1 相同。图 2 肺组织纤维蛋白沉积定量分析（略）图 3 各组 ICAM1 蛋白质水平表达变化（略）图 4 各组 ICAM1 基因水平表达变化（略）图 5 各组 PAI1 蛋白质水平表达变化（略）图 6 各组 PAI
15、1 基因水平表达变化（略）24 青年和老年大鼠肺组织 TM 蛋白质和 mRNA 表达的变化 各组大鼠 TM1 蛋 白质和 mRNA 表达的变化和定量分析结果如图 6、图 7 显示，蛋白质和 mRNA 的变化趋 势相同。青年鼠和老年鼠 NC 组肺组织 TM 表达丰富；L 组和 LT 组 TM 几乎无表达 (P001)；给尿激酶后 TM 表达较 TL 组显著上调(P005)；老年鼠 NC 组和 LTU 组 TM 的表达均低于相应的青年鼠(P005)。图 7 各组 TM 蛋白质水平表达变化（略）图 8 各组 TM 基因水平表达变化（略）3 讨论肺组织内大量纤维蛋白沉积是急性肺损伤的重要病理特征 1，5 。纤维蛋白除了具 有破坏血管内皮细胞结构导致血管通透性增强和强烈抑制肺泡表面活性物质活性等直接损 伤作用外6，7 ，体外实验还发现能够损伤内皮细胞促进炎症反应，但其在体内对内皮细 胞的作用尚不清楚。本研究欲从体内水平观察纤维蛋白沉积对不同鼠龄大鼠肺组织内皮细 胞功能的影响。本研究选取了 TM、ICAM1、PAI1 3 种特异性的分子标志物作为监测内皮细胞功 能的指标。TM 主要由血管内皮细胞合成，在肺组织血管内皮细胞表达最高8 。它是血 液中最主要的抗凝物质，与凝血酶结合成复合物，使凝血酶活性丧失。内皮细胞功能损伤
