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1、湖北中医学院硕士学位论文保肝解毒胶囊对肝损伤大鼠模型细胞凋亡Bcl-2、Fas基因表达 影响姓名：刘丹卓申请学位级别：硕士专业：中医内科学指导教师：罗欣拉20060330郑重声明Ys 9 7 5 6本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论文没有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为，本人愿意承担由此而产生的法律责任和法律后果，特此郑重声明。学位论文作者( 签名) ：安汐寻= 乒矽年；月；o 日湖北中医学院硕十论文中文摘要目的：本文通过认真挖掘博大精深的中医学理论宝贵精神财富，并对历代医家有关肝损伤的认识进行了历程探源，意在充分揭示肝损伤的中医学发病关键是脾胃亏虚，毒邪乘
2、虚入侵所致，临床辨治肝损伤当以补脾胃为主，尚需参以解毒，并佐以清肝为治疗大法。保肝解毒胶囊作为典型这一治法的代表方，临床运用有效，进一步观察本方对大鼠肝损伤模型的保护作用，探讨其可能的作用机制，以期迸一步弄清本方防治肝损伤作用机理，意在为临床应用提供一定的实验学依据。方法：实验用健康w is t e r 大鼠( 平均体重15 0 一2 8 0 9 ) 作为研究探讨对象，卡介苗加脂多糖( B c “L P s ) 、卡马西平( c B z ) 、牛血清白蛋白( B s A ) 致肝损伤动物模型，再用保肝解毒胶囊( 分大、中、小剂量组，分别标以治疗组卜3 ) 与甘利欣分别灌胃，并设空白组与模型组，
3、然后生化法检测血清肝功能A L T 、A s T ，原位末端标记检测凋亡细胞阳性百分率，免疫组织化学染色检测细胞凋亡B c 卜2 、F a s 基因表达水平，最后进行对比观察指标。结果：1 、通过对肝损伤治疗前后肝功能( A L T 、A s T ) 检测指标进行观察，模型组与空白组相比较，模型组无论肝功A L T 或是A s T 均明显高于空白组肝功能A L T 、A s T 值，经统计学处理具有显著性差异( p O 0 5 。与模型姐比较p O 0 5 。治疗组与对照蛆比较。_ p O 0 5 。从表1 中可以看出，模型组大鼠血清A L T 、A s T 均明显高于空白组，具有极显著性差异
4、( p o 0 5 ) ，而保肝解毒胶囊中剂量组与对照组比较，其血清A L T 、A s T 降低程度与对照组相比，存在显著性差异( p O 0 5 。与模型粗比较p O 0 5 。治疗组与对照组比较p O 0 5 。从表2 可以看出，模型组与空白组比较细胞凋亡指数显著增高，统计学处理见显著性差异( p o 0 5 ) 。2 3 保肝解毒胶囊对卡介苗+ 脂多糖( B c G + L P s ) 诱导免疫性肝损伤动物模型细胞凋亡B c l 一2 、n s 基因表达影响结果见表3表3 保肝解毒胶囊对B C G + L P S 诱导免疫性肝损伤动物模型细胞凋亡B c l 一2 F a s 基因表达影
5、响比较泣D 0 0 5 。与模型姐比较p 0 0 5 。治疗组与对照组比较p O 0 5 。湖北中医学院硕十论文从表3 可以看出，模型组大鼠肝损伤细胞凋亡( B c l 一2 、F as ) 蛋白阳性表达百分率，与空白组细胞凋亡( B c l 2 、F a s ) 蛋白阳性表达百分率比较明显差异( p 0 0 5 。与模型组比较p O 0 5 。治疗组与对照组比较p O 0 5 。从表4 可以看出，模型组的大鼠血清A L T 、A s T 明显高于正常组血清A L T 、A s T 值，统计学显示有极显著性差异( p O 0 5 。与模型姐比较p O 0 5 。治疗扭与对照组比较p O 0 5
6、 。从表5 可以看出，模型组与空白组比较细胞凋亡指数见显著性差异( p O 0 5 ) ，这说明中剂量组尤能抑制肝损伤细胞凋亡。2 6 保肝解毒胶囊对卡马西平( c B z ) 所致大鼠肝损伤动物模型细胞凋亡B c 卜2 、F a s 基因表达的影响结果见表6表6 保肝解毒胶囊对卡马西平( C B Z ) 所致大鼠肝损伤模型细胞凋亡B c I _ 2 ，F a s基因表达影响比较注：与空白组比较p O 0 5 。与模型组比较p O 0 5 。治疗纽与对照组比较p 0 0 5 。从表6 中可以看出，模型组大鼠肝细胞凋亡基因B c l 一2 、F a s 与空白组比较差异明显( p 0 0 5 。
7、与模型粗比较p 0 0 5 。治疗粗与对照组比较p O 0 5 。从表7 中可以看出，模型组的大鼠血清A L T 、A s T 明显高于正常组，有极显著差异( p o 0 5 ) 。中剂量组与对照组比较有显著性差异( p O 0 5 。与模型组比较p O 0 5 。治疗粗与对照组比较。p 0 0 5 。从表8 可以看出，保肝解毒胶囊大、中、小剂量组均能抑制牛血清白蛋白( B s A )诱导肝损伤动物模型细胞凋亡，其中尤以中剂量组作用最为显著，与对照组比较有显著性差异( p O 0 5 。与模型组比较p O 0 5 。治疗组与对照组比较P 0 0 5 。1 7湖北中医学院颂士论文从表9 可以看出
8、，模型组大鼠肝损伤细胞凋亡( B c l 2 、F as ) 蛋白阳性表达百分率，与空白组细胞凋亡( B c 卜2 、F as ) 蛋白阳性表达百分率比较明显差异( p O 0 5 ) ；这说明中剂量组治疗肝损伤疗效与甘利欣胶囊治疗肝损伤的疗效基本相同，具有很好的临床可取性。湖北中医学院倾士论文讨论l 、瓣鬟穆套秘耩藿静遥箨奄毒擎徐建立实验性肝损伤动物模型，是筛选保肝药所必需的，对于研究肝摘的发病机制和药物的作用原理非常重要。四氯化碳【c c L 。) 致肝损伤大鼠模型，对于中毒蛙黪镁害奏一定戆特异往，对予确定病嚣、裁疑瑟着有一定蟪蘩动。毙嫫墨电较常用，能准确反映肝细胞的功能、代谢及形态学变化
9、，黧复性好、经济。但c c k 蒸气和液体由呼吸道、皮肤吸收，可对人体也有一定的簿性“。用D 一氨基半乳耱D G a l N ) 铡备妁犬鼠嚣损傍模型其肝脏鳃织病理学改变和生拯就学妁变化均与人类病毒性肝炎极为楣像，对实验人员也安垒无毒”。隧鲍，D 一& l N 致肝损伤横溅是目前公认的比较好的研究病毒性肝炎的发病机制及有效的治疗药物的实验动物模型。不过出c c b 和D G a l N 等化学药物引起的经典肝损伤动物模型麓震中毒整箭垮甄菠踌，与淮藤上多麸舞麦蕊免疫病理袁禳犬莲臻，龟不逶穗予有护肝作用的免疫调节剂或影响免疫系统的护肝药的赫效评价。翳| 氨酚( a c c i a m i n o
10、p h c a ，A p ) 性肝损伤动物模型不及c c L 4 和D G a l N 肝损伤模型常用”1 。缺盘露灌注蛙器损谚模墨惩予瞧凑翳罄手术方法戆实验磅究。毒关疆耱瞧嚣擐伤葫物横型，不少学澎已作了努力，不少实验表明，急性酒精性肝损伤模型鳃织化学染色摄示脂滴显著增加，血清甘油三脂( T G ) 明显升高等，而妞清转氨酶和肝组织结摘改交帮不臻显“1 。多年来避模中还遇到的爨难是大鼠厌滔，不能控制其摄入量，褥且动耪对溪的辩受惶羞势较大。综上所述，实验性静损伤模壅建立方法较多，由于人体肝脏功能复杂和损肝因素的多样性，肝细胞损伤是多种因索如毒物 c C L 4 D G a l N ，A P 、I
11、 c ) 的中间产物与大分物质共价结合、缺氧、脂质过氧化、舞憨蠹钙稳态失诿和蠹毒素援互俸J l 戆骜栗，露饕单一豹馋蠲。任鸯一静爽验模型都不能全面、准确地反应特定肝损伤的本质满足所有科研需要，制模的可重复性、可j 甄测性、可比性、低的费效比是制模成功的关键。理想的动物模趔还应具备与人类疾痰特援耱议；癌变露一定发震过程，露臻显分期；影成率褰，筏亡率低，造横方法简便舅行。由鉴于此，通过 l 二较各模型之优缺点，加之一些动物模型我们课题组曾经设计过，并进行了大量研究，为避免科研的重复性，我们选择了卡夯譬如脂多糖( B c G + L P s ) 、卡玛莲平( e B z ) 、牛血清白蛋白B s A
12、 ) 致肝损伤三释番镪模登， ；之巅扶不同角度避一步弄清保嚣麓毒胶囊跨护肝损锈侉孺祝灌。目前，肝损伤的遗模方法颇多，甚至有些模型不易控制，或者说造成肝损伤过重，转氨酶居高不下，一般药物无法对抗，从而对药物疗效及药理的探讨造成一定嚣黢。虽然近A 年寒謇疼癸有关嚣强魏模耄麴磅宠聚褥了较夫进展，豫器援伤动物模型还需进一步完善，肝损伤机制比较黧杂，尚待深入研究。再说肝损伤的动物模型能模拟某些肝炎，但动物和人毕竟有所不同，对动物模型有效的药物作湖北中医学院硕上论史用于人体效果如何，鬻进一步研究。并且动物模型只能摸仿肝损伤，不能爱制中医酶证，无法俸鬟孛送特色。鑫诧，严格寒 荛，我僚搿建立麴翳擐穆模蕉，并雾
13、与人体寅际通过中医病因所致肝损伤，能够达到完全符合，甚至有时相藏甚远，不过我认为通过建立实验性肝损伤动物模型，应用可控的动物模型可正确分析荽誊静发疯祝裁，严格戆塑织痍醺、垒愆帮生瑷甓察蚜霹正磺裁蘩药麓疗效。不同的动物模型应选掭合适的测定指标。随着实骚动物科学的不断发展，将建立更符合临床发病机理、熙经济、重鬣率高的模型，从而研究肝痫的发生机制，筛选保好药物，以及对探索保霪于捧月规理，还是具有十分重要的瑰嶷意义的。2 、麴脆凋亡在辩损穗串褥谗髑细胞凋亡是机体的一种基本生理机制，并贯穿机体整个出命活动过程，细胞的生成与衰老有严格的调节机制，凋亡是细胞的主动性死亡，是机体清除感染，交薯及袋老纽戆羲终拷
14、鸯舞生理犊卷戆主要调节方式之一。魏戆瓷亡是区鼷子箨死的另一种细胞死亡方式。有关凋亡调控机理的认识还很不完善，必须深入到对凋亡起壤要作用的熬因中去研究，涉及凋亡调节和执行的基因产物对疾病诊断和分入治疗是竣具漤力戆研究方彝，宅钔茨许多疾病蕊治愈或缓辩褥荻囊蕊蒂望。B c 卜2 是调节细脆凋亡途径中的一个重要调节基因。B c l 一2 豢困家族根据它们对细胞凋亡作用结果的不同，可将B c l 2 家族成员分为两类，一类能促进细胞凋亡，如B a x 、B a k 等；另一类能挣利细胞瀵亡，如B c l 一2 、B c 卜x L 等。它们共同构成一令菲紫蔑杂的穗互俸用瓣络，在懿魏潺亡中超壤装酶谣控细麓满
15、亡俸蕉。8 c l 一2通过起一种氧化剂的作用或通过抑制氧自由基的产生而抑制细胞凋亡；B c l 一2 又可通过改变胞内细胞嚣的c a2 + 内流而抑制凋亡；B c l 2 还可改变P ，和c D c 2 绷胞周襄，诿节蚤鑫戆核溅装转运委箨裁猬亡”1 。飘s 主要分毒予活诧蘸T 鲡稔袭薤，细胞毒性T 细胞损伤肝细胞的机制主要是细胞毒性T 细胞的抗原特异的T 细胞受体和c n 。分子与靶细胞( 肝细胞) 袋面的抗原结合，激活细胞内信号，产生穿孔素孝颖毂黪，通过残憨俸用进入靶缬憨，鬻醇促遗飘s 毒珏s L 酶绩台，两者共麓激活蛋白永解酶类如胱门鬣自酶( c & s p a s e ) ，破坏线糨体
16、外膜“。F a s 因属于T N F 家族，F a 8 基因与A P O 一1 系同一物质，与T N F 和N G F 受体的序列具有同源性，天然表达或转装表达F a s 妁细逮和经抗妇s 抗体交联的细胞激活，F a s 岩动凋亡信号，杀死受感染兹莸豫提莹细施，鼠露走向蠲亡。在蓁垄类墼湃滚串，器细憨凋亡实际上； 超了炎症和坏死，肝脏中的嗜中性白细胞炎症完全依赖于细胞凋亡的这一始发事件，有些凋亡的肝细胞，最初表面看似静悄消地，但却引发活动旺盛的嗜中缝鑫懿戆瀑发，这黪爆发会导致大量氧诧嚣予鬻雾蛋壹承舞薄黪器敷，扶蘑杀死成百上千的无辜的磐观者，因此阻止细胞凋亡可能是一个新的控制炎症的治疗途径。练上所述，细胞的增殖、分化和衰老细胞死亡之间的平衡，是综合性多因湖北中医学院硕上论史素作用的调控过程，一旦这种平衡稳态受某种触发因子所攻击而
