《去氧鬼臼毒素抗肿瘤细胞作用机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《去氧鬼臼毒素抗肿瘤细胞作用机制研究（70页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
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2、究生签名：j 己事2导师签章：弧互一n 年占月日目录f I f | f f f I f 删洲删f f | l f f f f | | f Y 210 4 8 3 6中文摘要l英文摘要3研究论文去氧鬼臼毒素抗肿瘤细胞作用机制研究前言6刚吾”O材料与方法”7结果2 0附图2 5附表4 1讨论4 5结论5 0参考文献5l综述天然产物中活性成分与细胞凋亡的相关性进展_ ”5 4致谢5 9个人简历6 0中文摘要去氧鬼臼毒素抗肿瘤细胞作用机制研究摘要目的：本文研究去氧鬼臼毒素( D P P D 对其肿瘤细胞株( K B 细胞) 抑制的作用，并探讨作用的机制。方法：1M ，丌法和S R B 法检测D P P
3、 T 的体外抗肿瘤活性。M T T 法和S I m 法测定D P P T 体外对各肿瘤细胞( K B 、H e l a 、L O V o 、H e p G 2 、S K V 0 3 、A 5 4 9 、K 5 6 2 ) 及正常细胞( C 、M C 一3 T 3 ) 的I C 5 0 值或G 1 5 0 值。2 光学显微镜下和荧光显微镜下观察D P P T 对K B 肿瘤细胞株从形态学上结构的变化。3 琼脂糖凝胶电泳分析D P P T 对K B 细胞染色体D N A 断裂的影响。4 流式细胞术分析D P P T 对K B 细胞周期及其凋亡率的影响。 5 肝P C R 检测D P P T 在不同
4、浓度( 2 m n o 班。、4 n m o 。、8 m n 0 1 L ) 对K B细胞p 5 3 、b c l 一2 、b a x 、c a S p a s e 一3 、p 2 l 、P C N A 、c y C l i n A 、c y C l i n B l 删妣表达的影响。6 免疫细胞化学法和W e s t e m - b l o t 法检测D P P T 在不同浓度下( 2 1 1 1 1 1 0 儿、 4 m o l L 、8 nm o 儿) 对K B 细胞P C N A 蛋白表达的影响。结果：1D P P T 的体外抗肿瘤活性M T T 和S I 氇法测定结果表明，D P P
5、T 对多种肿瘤细胞均有较好的抑制作用，I C 5 0 值为6 9 2 9m n 0 1 L ；对K B ( 人口腔上皮鳞癌细胞株) 有非常显著抑制作用，I C 5 0 值为5 6 士4 O 啪。儿，S R B 法检测到K B 细胞G 1 5 0 值为4 O 1 2I 吼o l L 显著优于阳性对照药依托泊苷( V P 1 6 ) ，且具有抗多药耐药的活性。D P P T 对人正常血管内皮细胞( C ) 和人成骨细胞( M C 一3 T 3 ) 显示具有较低的毒性，具有较好的选择性。通过对K B 细胞生长曲线的观察到，D P P T 对K B 细胞具有生长抑制作用，呈剂量依赖性，表明D P P
6、T 对肿瘤细胞生长抑制作用强于阳性对照药依托泊苷( V P 1 6 ) 。2D P P T 诱导肿瘤细胞凋亡中文摘要G i e m s a 染色和H o e c h s t3 3 3 4 2 荧光染色结果显示随着给药浓度的不断增大，细胞呈现出的凋亡形态愈来愈明显，并最终变成大小不等的凋亡小体；经D N A 琼脂糖凝胶电泳后所出现的梯子状条带显示出典型“D N AL a d d e r “ 梯子图样；经流式细胞仪检测，结果显示出，凋亡细胞的比例会随着D P P T 浓度的升高及其作用时间的延长而增加，呈现一定剂量的时间依赖性。以上结果均可以说明D P P T 能够诱导K B 肿瘤细胞发生凋亡。3
7、D P P T 对肿瘤细胞( K B ) 周期的影响 细胞周期分布结果显示高浓度8 姗。儿的D P P T 作用于K B 细胞2 4 h 可将其细胞周期阻断在G 2 + M 期；免疫荧光试验结果表明高浓度8 衄儿的D P P T 可使K B 细胞的绝大部分微管结构破坏，仅在核周残留少量点状不规则荧光。4D P P T 对K B 凋亡相关基因和细胞周期基因的测定R T - P C R 结果显示不同浓度的D P P T ( 2 、4 、8 姗。儿) 作用于K B 细胞2 4 h 后，可剂量依赖性地增加p 21 、b a x 、p 5 3 、c a S p a s e 3 、及c y c l i n
8、 A 的删眦表达，同时降低b c l 2 和c y c l i l l B1m R N A 的表达，与对照组相比有显著性差异( P 9 8 ，难溶于水，淡黄色结晶，由武警后勤学院生药学与药剂学教研室陈虹教授提供，体外实验均用D M S O 所配制。依托波苷( V P 1 6 ) ，分子量5 8 8 5 6 ，为江苏恒瑞医药股份有限公司产品，国药准字号H 3 2 0 2 5 5 8 ，批号：0 9 0 9 0 7 3l ，临用前生理盐水配制。研究论文H 3 C OH 3 CHOO C H 3O C H 冀( 1 )H 3 C OO HOO C H 3( 2 )F i g 1C h e m i c
9、 a ls 咖c t u r eo fD P P Ta 1 1 dE t o p o s i d e( 1 ) C h e m i c mF 0 m m ao f D P P T ( 2 ) C h e m i c a lF o m m l ao fV P l6 2 生化试剂lI 心M 1 1 6 4 0 为天润善达公司产品，胎牛血清( F B S ) 为中国医学科学院血研所科技公司产品。 2 溴化四氮唑蓝岬) 、十二烷基磺酸钠( S D S ) 、过硫酸胺( A P S ) 、均为S i g m a 公司产品，天津润泰公司进口分装。3D T T ( 二硫苏糖醇) 购于鼎国生物技术有限责任公司
10、，批号：1 0 1 3 4 8 3 1 2 3 。4 四甲基乙二胺( 弧M E D ) 为G I B C O 公司产品，天津联星公司进口分装。5 考马斯亮兰G 2 5 0 为F L U K A 公司产品。研究论文6T r i t o nX - 1 0 0 为眦O 公司产品，天津联星公司进口分装。7 苯甲基磺酰氟( P M s F ) 为宝灵曼公司产品，天津联星公司进口分装。8 琼脂糖( A g 拍s e ) 为P r o m e g a 公司产品，批号：1 1 0 3 7 3 3 。9 啊s 为G i b e c o 公司产品，天津中奥天元进口分装，批号：7 7 8 6 1 。l O 二甲基亚
11、砜( D M S O ) 为G i b e c o 公司产品，批号：D 5 8 7 9 。1 1 三氯乙酸( T C A ) 为北京化学试剂公司产品，批号：0 8 1 0 0 9 。1 2 二胺四乙酸( E D T A ) 为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：A 1 5 1 0 1 1 0 6 。 1 3 甘氨酸( 层析纯) 为触s c o 公司产品，批号：0 1 6 7 。1 4 胰蛋白酶为S o l 小i o 公司产品，批号：T 8 1 5 0 。1 5G i e m s a 染色剂购自S e r v a 公司。 1 6 删z o n 为C W B I O ( 康为世纪) 有限公司产
12、品，批号：3 0 9 1 1 C 。 1 7 赆P C R 试剂盒为( m i 仃0 9 e n ) 有限公司产品，批号：8 2 1 0 1 1 2 6 。1 84 x 蛋白上样缓冲液为s o l a r b i o 公司产品，批号：9 0 0 9 1 1 2 81 96 删上样缓冲液为s 0 1 拍i o 公司产品，批号：H 7 0 2 8 。2 0E B ( 溴化乙啶) 为S i g m a 公司产品，天津中奥天元公司进口分装。2 1S I 迅( 硫化罗丹明) 为S i g m a 公司产品，批号：3 5 2 0 4 2 1 。2 2 聚丙烯酰胺( A c 巧l a m i d e ) 为
13、S i g m a 公司产品，批号：A 8 0 8 0 。 2 3 啊sH C l 为S o l 砒i o 公司产品，批号：T 8 2 3 0 。2 4 其他常规试剂及溶剂均由天津市科锐思精细化工有限公司、北京化工厂、北京双环化学试剂厂及北京化学试剂研究所提供。2 5H o c h e S t 3 3 3 4 2 染液：为B e y o t i m e 公司产品，批号：C 1 0 2 22 6P C R 引物：D a C t i n 由北京天一有限公辉远生物技术有限公司合成，扩增片段：5 4 0 b ps e n s e ：5 G T GG G GC G C C C CA G GC A CC
14、A 一3 a n t i s e n s e ：5 C T TC C T T A AT G TC A CG C AC G A1 _ I TC 3 p 5 3 由北京天一有限公辉远生物技术有限公司合成，扩增片段：4 3 5 b ps e n s e ：5 T C TG G GA C A G C CA A GT C TG T 一3 。a n t i s e n s e ：5 G G AG T C1 _ I C A GT G TG A TG A 一3 p 2 1 由北京天一有限公辉远生物技术有限公司合成，扩增片段：3 4 6 b ps e n s e ：5 - T G T C C G T C A G A A C C C A T G C G 3 。9研究论文a n t i s e n s e ：5 G C G A G G C A C A A G G G T A C A A G 3 b c l 一2 由北京天一有限公辉远生物技术有限公司合成，扩增片段：4 5 8 b ps e n s e ：5 。G G TG C CA C C T G T G G TC C AC C T 3 。觚t l s e n s e ：5 一C 。l 。l C A C 。I I U I G 【jC C CA G A I A GG 一3 b a x 由北京天一有限公辉远生物技术有限公司合成，扩增片段：
