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1、9 0 3 3 3分类号：广西医科大学G u a n g x iM e d i c a lU n i v er s i t y 硕士研究生学位论文大鼠I 型糖尿病引发脑细胞损伤及其 与学习记忆障碍的关系学科专业研究方向导师姓名研究生姓名学号人体解剖学组织胚胎学神经生物学郭灵教授崔卫剐Z 0 0 3 删1 1 8o o 六年五月密级编号大鼠I 型糖尿病引发脑细胞损伤及其与学习记忆障碍的关系【摘要】目的：探讨I 型糖尿病对成年大鼠脑神经发生、星形胶质细胞、基底前脑胆碱能神经元的影响及其与学习记忆障碍的关系。方法：建立糖尿病大鼠模型及胰岛素治疗糖尿病大鼠模型，用免疫组织化学方法计数B r d U 、
2、G F A P 、N F 、C h A T 阳性细胞数，并用M o m s 水迷宫测定大鼠的学习记忆能力。结果：糖尿病大鼠S V Z 和S G Z 的B r d U 细胞数、海马和额叶皮层的G F A P 、N F 阳性细胞数、内侧隔核和斜角带核的C h A T 阳性细胞数以及学习记忆能力明显下降( P 0 0 5 ) 。表1 大鼠水迷宫潜伏期( i j 单位：秒)注：+ 与治疗组比较，P 0 0 5 ) 。( 二) 治疗组及糖尿病组大鼠B r d U 阳性细胞的变化l 、齿状回B r d U 阳性细胞核数的变化各组B r d U 阳性细胞主要分布在齿状回的S G Z ，部分阳性细胞位于颗粒层
3、和门区( 图1 ) 。阳性细胞核有两种分布形式：( 1 ) 细胞聚集成簇，细胞核呈圆形或椭圆形；( 2 ) 细胞呈单个或两个，没有丛集性，但细胞核形态相对比较规则。所有不加一抗的对照染色脑片均呈阴性反应。表2 大鼠每次水迷宫训练游泳距离变化( i s ，单位：厘米)注：8 与治疗组比较，P 0 0 5 ) 。( 三) 治疗组及糖尿病组大鼠G F A P 阳性细胞的变化，海马和额叶皮层G F A P 阳性细胞形态似蜘蛛状，胞体和突起星黑褐色( 图3 ) 。各组大鼠G F A P 阳性细胞的形态无明显差异。对各区的G F A P 阳性细胞计数的结果见表4 。由表4 可见，糖尿病组各亚区G F A
4、P 阳性细胞数较治疗组下降了2 7 4 9 4 7 4 6 ，组间有显著性差异( P 0 0 5 ) 。表3B r d U 阳性细胞核数的变化( j S ，单位：个，切片：个视野)注：+ 与治疗组比较，P 0 0 5 ) 。( 五) 治疗组及糖尿病组大鼠C h A T 阳性细胞的变化C h A T 免疫阳性物质为黑褐色，主要位于神经元胞浆及近侧突起内，而胞核未着色( 图5 ) 。基底前脑C h A T 阳性神经元分布范围广泛，左右两侧呈对称分布。C h A T 阳性细胞成群分布于前至胼胝体交叉的起始端平面，经无名质向后延伸直达大脑脚的区域内。M S 区内C h A T 阳性神经元相对较小，位于
5、隔区中央，左右侧数量大致相等。两侧细胞群结合形成倒“v ”字形，背侧靠近中线，腹侧远离中线。靠近中线的细胞多为中等大小，染色较深。在中线外侧，小细胞较多，免疫反应较弱。中、小细胞多呈梭形、椭圆形或卵圆形，树突少，光滑，分支也少。斜角带水平支( v D B ) C h A T 神经元位于M S 腹侧，并与之延续，v D B 区域内的C h A T 阳性神经元数量最多，较M S 密集，多为中、小型的卵圆形或梭形，也有很少量的多形细胞，胞体较M S 的细胞大，其树突延伸有较长的突起且与斜带纤维方向一致。对M S 、v D B 、h D B 、N B M 的C h A T 阳性细胞数的测定结果见表6
6、，糖尿病组大鼠M S 、v D B 及h D B 的C h A T 阳性细胞数较治疗组下降了2 3 7 5 4 0 4 8 ，组间有显著性差异( P O 0 5 ) 。表5N F 阳性细胞计数的变化( 牙s ，单位：个，视野)注：+ 与治疗组比较，P 0 0 5 ) 。表7 海马切片双标细胞数的变化( j s ，单位：个切片)注：+ 与治疗组比较，P O 0 5 ：a 与糖尿病组比较，P 0 0 5 。5四、讨论( 一) 判断建立大鼠糖尿病脑病模型成功的指标本研究参照国内外普遍采用的腹腔注射链脲佐菌素的方法，特异性地破坏胰岛的B 细胞，使其产生胰岛索严重不足，导致持续性的高血糖状态，而出现糖尿
7、病，为证实动物建模成功，首先，用血糖仪测定血糖，血糖1 6 6 m m o l L N l 为建立糖尿病成功【2 邸o 】。继之，又对大鼠进行M o r r i s 水迷宫神经行为测试，发现糖尿病大鼠的逃避潜伏期，游泳距离等指标均明显比正常组增加或升高，说明所建立的糖尿病大鼠已发生学习记忆障碍。最后通过给模型大鼠进行胰岛素替代治疗，可明显提高学习记忆能力，并使这些行为指标达到正常对照组的水平，这些结果与国内外的基本一致口1 , 3 2 1 。说明本研究通过以上三个步骤来确定建立糖尿病脑病较为合理，所建立的模型成功。这不仅进一步证实了糖尿病脑病所出现的神经行为症状及胰岛素缺乏是其发病起因的观点，
8、而且为深入研究胰岛素缺乏引起的其它病理变化奠定了基础。( 二) 成年脑内神经发生在糖尿病脑病发病中的作用许多研究表明，包括人脑在内的S V Z 和S G Z 终生存在着神经干细胞，这些细胞不断增殖和分裂产生祖细胞，后者再经分裂、迁移及分化等步骤产生新的子细胞过程，称为神经发生 1 2 , 1 3 】。由S V Z 和S G Z 的祖细胞产生的新神经元分别通过远距离途径迁移到嗅球和齿状回的颗粒细胞层，再分别分化成颗粒细胞、小球周细胞，整合到局部神经环路，从而确保正常的嗅觉记忆及空间学习记忆功能1 1 4 A 5 1 。此外，还有研究表明，上述脑区神经发生不仅与学习记忆能力成正相关，而且还受到激素
9、的调控，故目前已将神经发生视为学习记忆的形态学基础，并从激素方面揭示其与学习记忆的关系。最近研究发现，切除成年大鼠松果体，消除体内神经内分泌激素一褪黑素的主要来源，可使学习记忆能力以及S V Z 、S G Z 神经干细胞的增殖率明显下降。用褪黑索治疗可使以上指标恢复到正常水平，而且上述各指标之间的升降变化趋势极为相似，故充分说明了褪黑索通过调节成年脑神经发生来影响学习记忆过程【3 引。那么，糖尿病是胰岛素绝对缺乏的一种内分泌疾病，由此引起糖尿病脑病的发病过程是否也累及到上述脑区的神经发生? 十分遗憾的是，目前尚没有解答这一问题的国内外资料，故本研究将从建模及替代治疗两个方面探讨这一问题。B r
10、 d U 是一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在神经干细胞增殖的D N A 合成期中被摄取到细胞核D N A 分子中，被摄入的B r d U 还可经有丝分裂整合到子代细胞的D N A 分子中，故B r d U 己广泛用于鉴定神经干细胞增殖及追踪其子代细胞迁移和分化过程的个重要指标【3 4 1 。N F 和G F A P 均为中间丝蛋白，他们分别在已分化成熟的神经元和星形胶质细胞特异性表达【3 5 ，3 6 1 ，因此应用免疫组化单标和双标技术识别这些标记物便可观察神经干细胞增殖、迁移及分化的状态。本研究观察到糖尿病大鼠S V Z 、S G Z 的B r d U 阳性细胞核数、G F A P 、N F
11、 和C h A T 阳性细胞数均明显下降，用胰岛素替代治疗可使上述指标恢复到正常水平，而且这些指标升降与大鼠水迷宫学习记忆能力的波动呈平行变化的趋势。说明胰岛素缺乏可导致上述部位神经发生障碍，使局部靶区中间神经元得不到新生神经元及时补充和替代，从而降低局部神经环路的更新率，最终导致学习记忆障碍，这可能是发生糖尿病脑病的一个机制，并提示神经干细胞上存在着胰岛素受体。胰岛素改善糖尿病脑病症状的机制是它通过相应的受体介导的信号系统来调控神经发生的，进而提高学习记忆能力。故深入研究胰岛素水平变化与其受体之间的内在关系将有可能揭示出其作用的分子机制。( 三) 基底前脑胆碱能系统在糖尿病脑病发病中的作用既
12、往研究证实基底前脑的M S 、v D B 、h D B 及N B M 等核团含有大量的胆碱能神经元，它们发出胆碱纤维分别投射到海马、嗅球及大脑皮质，构成了三种与学习记忆密切相关的神经环路：隔海马、h D B 。嗅球、N B M 皮质通路 2 0 l 。乙酰辅酶A 与胆碱在胆碱能神经元胞体的C h A T 的催化下合成乙酰胆碱【3 7 l ，再沿其发出的轴突经上述通路到达相应靶区，一方面影响突触后神经元的活动，另一方面影响S G Z 及嗅球的神经发生，从而确保正常的学习记忆功能。上述通路的起点、途径及终点的任何环节发生病变均可引起学习记忆障碍。另有研究表明，老年性痴呆患者M S 、v D B 、
13、h D B 及N B M 的胆1 7碱能神经元大量丢失，且与痴呆程度呈正比，补充乙酰胆碱可缓解痴呆症状；切断上述任何一条通路均可使大鼠学习记忆能力下降1 3 引；在由s T z 引起的大鼠糖尿病模型中，海马细胞发生明显的变性及坏死【3 9 】。所有这些结果均提示，靶区发生病变可引起认知功能障碍，使得国内外研究者都将目光注意到海马这一结构上，而完全忽略对起点处的胆碱能神经元胞体的研究。由于胆碱能神经环路是一个闭路的回路，而且胞体是细胞合成代谢的中心，因此可以设想，一旦靶区神经元发生病变，很有可能影响到胞体所在地的核团。按照上述思路，我们用胆碱能神经元特异性的标记物C t L 舯作为指标，观察基底
14、前脑胆碱能神经元的变化，结果显示，在糖尿病脑病状态下，大鼠M S 、v D B 、h D B 及N B M 的胆碱能阳性神经元数明显下降，用胰岛素替代治疗可使阳性细胞数恢复到正常水平，而这些变化也与大鼠在水迷宫的学习记忆能力的改变呈平行发展趋势。这些结果不仅证实了我们的所有推测，也说明胰岛素是一个保护基底前脑胆碱能系统的“促智力”激素，有关胰岛素对胆碱能神经元的作用机制，可能是通过作用于相应受体信号系统提高C h A T 表达，使C h A T 神经元数增多，C h A T 催化合成的乙酰胆碱产物输出也相应增多，这对于提高靶区的突触后成熟神经元的功能及促进神经发生，最终提高学习记忆功能均具有重
15、要的生物学意义，若胆碱能胞体受损则可引起糖尿病脑病，因此，基底前脑胆碱能神经元C t u 姐水平降低可能是导致糖尿病脑病的第二个机制。( 四) 星形胶质细胞在糖尿病脑病发病中的作用星形胶质细胞是中枢神经系统的一个重要成员，在正常情况下具有保护、营养神经元的作用。在众多研究中，有关学习记忆的海马、嗅球及大脑皮质的星形胶质细胞尤为受到关注。这些部位的星形胶质细胞可以产生多种营养因子【2 3 1 ，这些因子被支配靶区的胆碱能神经元的轴突吸收，并经轴浆逆行运输到胆碱能神经元胞体，然后作用于胆碱能神经元上的相应受体J ，对胆碱能神经元发挥靶源性营养保护作用，使胆碱能神经元得以发挥正常功能，确保学习记忆正
16、常。一旦这种靶源性作用异常不仅影响胆碱能神经元，还可影响学习记忆过程。例如通过切断穹隆海马伞来阻断隔一海马通路，海马星形胶质细胞产生的N G F 、B D N F 无法被胆碱能神经末梢吸收和运输，只能在局部积聚，使海马的N G F 水平异常升高，由此可导致M S 、h D B胆碱能神经元死亡、丧失利学习记忆障碍。脑室注射N G F 或B D N F 不仅可挽救濒死的胆碱能神经元，还可恢复学习记忆能力【加】。然而，有关糖尿病脑病的发病机制的探讨多集中在研究神经元方面，很少有报道星形胶质细胞的资料。为补充这方面的资料，我们对脑星形胶质细胞进行了定量观察，结果显示，在糖尿病脑病状态下，海马、嗅球及大脑皮质的G F A P 阳性细胞数均明显下降；用胰岛素替代治疗可使细胞数恢复到正常水平；G F A P 阳性细胞数的消失过程也与学习记忆的相似，说明胰岛素提高了以上脑区星形胶质细胞表达G F A P ，使细胞数目增多。由于G F A P表达高调，被认为是星形胶质细胞增殖及功能活跃的一个标志，故本研究的结果
