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1、浙江大学硕士学位论文人骨髓间充质干细胞在大鼠脑内移植的研究姓名：樊建玲申请学位级别：硕士专业：内科学（血液病）指导教师：黄河20060501浙江大学硕十学位论文第一部分人骨髓间充质干细胞脑内移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤的实验研究浙江大学医学院2 0 0 4 级硕士研究生前言内科学( 血液病)樊建玲黄河教授既往认为成体干细胞或组织来源的干细胞只能向所在组织的特定细胞分化，然而现研究发现，至少有部分成体干细胞能向其它谱系细胞分化，即所谓“转分化”，其中包括骨髓来源的一种成体干细胞骨髓间充质干细胞( M s C s ) ，又称骨髓基质细胞( B M s c s ) I 。捌。研究发现，M s c s
2、 在体外不同诱导剂作用下能分化为骨骼肌细胞( 3 1 、心肌细胞【“、肝细胞【钉、星形胶质细胞【6 1 和神经元m 1 。尤其M s c s 跨胚层向神经系统分化引起广泛兴趣。目前，许多学者将自体或同种异綦因M S c s 通过局部注射、腹腔注射或静脉输注方式移植至各种神经变性疾病模型大鼠体内，包括帕金森氏病【9 、脑梗塞【1 。1 列脑外伤 1 4 。6 1 、脊髓损伤18 1 等。研究发现移植后自体或同种异体M s c s 均能在中枢系统中长期存活，归巢至损伤部位，部分细胞表达星形胶质细胞标记蛋白：如G F A P ，和神经元标记蛋白：如微管相关蛋白( M A P 2 ) ，神经元核蛋白(
3、 N e u N ) 等，脑源性神经营养冈子( B D N F ) 、神经生长因子( N G F ) 等分泌上调，疾病相关的神经功能缺陷显著改善阻1 6 】。因此，M s c s 在神经系统中有着广+ 泛的应用前景。但国内、外关于M s c s 治疗缺氧缺I f I 性脑损伤( H I B D ) 研究报道不多。缺氧缺血( H I ) 诱导的脑损伤是一种弥漫性、进行性的神经元坏死和神经元程序性死亡。H I 几小时后脑内即可出现一批神经元死亡，而且这种损伤能持续几浙江大学硕士学位论文周甚至几个月，这种持续神经元丢失可能导致长期甚至永久性神经功能缺陷。因此，H I B D 是一类具有代表性的严重、
4、弥漫性神经元变性疾病。目前对缺氧缺血性脑损伤缺乏有效的治疗手段。许多围内外研究表明，将神经干细胞体外培养后，局部注射到H I B D 大鼠脑内，能有效修复缺氧缺血导致的神经功能缺损【2 0 1 2 “。但N s c s 取材有限，受伦理道德的限制，体外不易培养、扩增：易分化而失去增殖能力。与N s c s 相比，M s c s 具有取材方便，可取自自体骨髓，在体外培养下易扩增，不改变生物学特性；低免疫原性，能解决配型难的问题；不受伦理道德的限制等优点。啮齿类动物来源M s c s 在神经损伤疾病中的神经保护效应己被广泛证实M “，但人骨髓间充质干细胞( h M s C s ) 在体内的生物学行
5、为及是否具有神经保护效应较少报道，而实验的最终目的是将h M s c s 用于临床，因此，之前必需对h M s c s 在体内的生物学特性深入研究。免疫排斥是干细胞用于异体替代治疗的一个重要问题，M s c s 具有独特的免疫学特性：不表达H L A l I 类分子，不表达F A s 配体和共刺激分子如B 7 1 、B 7 2 、c D 4 0 L ，为天然无免疫原性，但关于异种移植研究报道较少。本研究组一直从事h M s c s 的研究，在h M s c s 体外的牛- 物学特性，免疫学特性及端粒凋控等方面已有深入研究。为探讨未用免疫抑制剂下，h M S C s 能否在免疫功能健全的异种动物
6、体内长期存活、迁移、分化及能否治疗H I B D 大鼠，本实验以幼年大鼠H I B D 为模型，将h M S c s 定位注射到大鼠脑内，研究多向分化潜能h M s c s 在幼年大鼠弥漫性脑损伤微环境下能否存活、表达神经元或星形胶质细胞表型及促进缺氧缺血导致的脑损伤的修复。浙江大学硕士学位论支材料与方法一、实验材料、仪器、试剂和实验动物1 、主要实验仪器、材料l l 细胞培养箱( H e r a e u s ) ，超净台( F o m as c i e n t m cI n c ) ，倒置显微镜( O L Y M P u s 公司) ，光学显微镜( O L Y M P u s 公司) ，低温
7、离心机( H e r a e u s仪器公司) ，超速台式离心机( H e r a e u s 公司) ，一7 0 冰箱( ( F o m as c i e n t i f i ch 地) ，T - 2 5 c m 2 细胞培育瓶( 0 r a n g e ) ，细胞培育六孔板( F a n d o n ) 。1 2 混合气体( 8 0 2 、9 2 N 2 ) ：杭州电化集团气体有限公司；立体定向仪：江湾I 型c ，第二军医大学；微量进样器5 u l ( Y Y 0 0 8 8 9 2 ) ：宁波市镇海三爱仪器厂：Y 迷宫：张家港市生物医学仪器厂；石蜡包埋机：L e c i a ，美国；石蜡
8、切片机：L e c i a ，美国。2 、细胞健康人骨髓细胞取材于骨髓捐献志愿者的正常供者。3 、主要试剂和药品3 ，1 低糖D M E M 培养基：美国G i b c o 公司，4 保存。3 2 胎牛血清，O 2 5 胰蛋白酶1 m m o l E D T A ，抗生素：美国G j b c o 公司，一2 0 保存。3 3F i c o l l P a q u e 分离液：上海试剂二厂产品，避光4 保存。3 4 多聚甲醛粉剂：天津市化学试剂研究所。3 55 一溴脱氧尿嘧啶核苷( B r d u ) ：美国s i g m a 公司。3 6 鼠抗B r d u 单克隆抗体：福州迈新生物试剂有限公
9、司；鼠抗人G F A P 、N F 单克隆抗体：北京中山生物技术有限公司；鼠抗人N e s t i n 单克隆抗体：英国曲c 蛐公司。3 7E n v i s i o n 检测系统：美国D A K O 公司；二氨基联苯胺( D A B ) ：美国S i g m a公司。4 、溶液的配制4 1 低糖D M E M ( L ，G D M E M ) 培养液：取一包低糖D M E M 培养基粉剂1 魄溶于9 5 0 m l 去离子水，加3 ，他N a H c 0 3 粉剂，充分搅拌混匀后用浓盐酸调P H 值至7 2 ，去离子水定容至1 0 0 0 m l 。孔径为O 2 2 u m 的滤膜过滤除浙江
10、人学硕士学位论文菌，4 保存。临用前加入胎牛血清至终浓度为l O ，加入抗生素至终浓度为1 。4 2 胎牛血清( F B s ) ：5 6 水浴3 0 m i n 灭活血清中的补体成份，室温冷却后分装，2 0 保存。4 3 磷酸缓冲液( P B s ) ：称取N a c l8 0 0 9 ，K c lO 2 9 ，N a 2 H P 0 41 4 4 9 ，K H 2 P 0 4O 2 4 9 ，溶于8 0 0 m l 双蒸水中，搅拌溶解，用浓盐酸调P H 值至7 4 ，双蒸水定容至1 0 0 0 m 1 。高压灭菌后4 保存。4 54 多聚甲醛固定液：称取4 9 多聚甲醛粉剂，置于三角烧瓶中
11、，加入5 0 8 0 m 1P B s 液，加热至6 0 左右，持续搅拌使粉末完全溶解，滴加少许l NN a o H 使溶液清亮，最后补足P B s 液至l O O m l ，充分混匀，滤纸过滤后4 保存。4 6D A B H 2 0 2 显色液( 临用前半小时内配制) ：l m g D A B 粉剂加2 m l T B s ，充分混匀，再加2 u l 浓度为3 0 的H 2 0 2 ，充分混匀，配制完毕后避光存放。4 7B r d u 配制：1 0 0 m gB r d u 粉剂溶解于1 0 0 m l 蒸馏水中配制成浓度为1 m m l 的储存液，孔径为o 2 2 u m 的滤膜过滤除菌，
12、2 0 保存。4 82 NH c L ：1 6 5 6 m l 浓H c L 与8 3 4 4 m 1 蒸馏水混合，4 保存。4 9O 1 M 硼酸缓冲液：称取6 1 8 9 硼酸粉剂，加蒸馏水至8 0 0 m 1 ，用磁力搅拌器充分混匀后，用N a O H 调节P H 值至8 5 ，最后补足蒸馏水至1 0 0 0 m 1 ，4 保存。4 1 00 0 1 M 枸橼酸钠修复液( P H ：6 O ) ：配制A 液：2 1 9 枸橼酸加水至l o om l ；B 液：1 4 7 9 枸橼酸钠加水至5 0 0 m 1 ；取A 液9 0 m l 和B 液4 1 0 m l加4 5 0 0 m 1 蒸
13、馏水( 用A 液调D H 至6 O O 1 ) 。5 、实验动物w i s t a r 大鼠：浙江中医学院动物实验中心提供。二、实验方法浙江大学硕士学位论文( 一) 技术路线原代h M S C s 培养P 3 5h M S C s6 0 融合时掺入示踪剂5 一溴脱氧尿苷( B r d U ) 7 2小时后收取细胞取约1o 1 0 6 个细胞制备细胞团块，石蜡包埋，连续切片行免疫细化：1 检测B f d u 掺入瘟2 检验移植前h M s c s 育无表达N F 和( ；F A P其余细胞调整浓度为5 1 0 4u l ，1 h 内移植移植前3 d 制备W i s t a r 大鼠H 旧D 模型
14、，随机分4 组：h M S C s 移植组，移植对照组，模型绀与假手术纠造模后1 d 进行模型鉴定3 d 后h M S C s 移植组：细胞移植移植对照组：等量P B s 注射；模型组与假手术组不移植移植后4 w ，4 组大鼠处死前行Y 迷宫行为学试验，检测海马损伤情况各组大鼠在各时间点灌杀取脑，常规固定、f i 蜡包埋、连续切片，备用( 二) 技术方法l 、h M s c s 的分离培养和B r d u 标记h M s c s 取材于骨髓捐赠的l E 常供者，无菌条件下采集健康志愿者骨髓1 0 m l ，肝素抗凝，与P B s 液1 ：1 混匀、在距液面l c m 处轻轻滴加至等体积密度为1
15、 0 7 7 m 1 的F i c o l l P a q u e 分离液上，250 0 r m i n 离心2 0 m i n ，收集单个核细胞层，用P B S液洗涤两次，1 0 0 0 “m _ m 离心1 0 m i n 。弃上清，细胞重悬于含1 0 ( v v ) 胎牛血清、1 ( v v ) 抗生索的低糖D M E M 培养液中并计数，按2 o X1 0 6 m l 密度接种T - 2 5 c m 2 塑料培养瓶，置3 7 、5 c 0 2 、饱和湿度的c 0 2 孵箱培养。7 2 h 后更换培养液，弃非贴壁细胞，以后3 4 d 换液1 次。每天在光学显微镜下删察细胞贴壁情况和细胞形
16、态。原代培养贴壁细胞约8 0 9 0 融合后，吸尽培养基，用无血清P B s 液洗涤2 次，加入3 7 预温的0 2 5 胰蛋白酶1 m m o lE D T Al m l 消化，约1 2 m i n 后细胞收缩、间隙增大，加入含1 0 ( v v ) 胎牛血清的低糖D M E M浙汀大学硕士学位论文培养液l m l 混匀以中和胰蛋白酶的活性。用吸管轻轻吹打细胞，直至贴壁细胞悬浮，吸取细胞，离心洗涤1 次，再用1 0 ( v v ) 胎牛血清的低糖D M E M 培养基悬浮细胞，按1 ：3 比例传代培养，并标记为P l 细胞。传代培养过程中每3 4天换液1 次，细胞达9 0 融合后，重复以上操作进行传代，并标记为P 2 ，余以此类推。取3 5 代h M s c s 约6 0 融合时加B r d u 至终浓度为1 0 u M 【2 2 l ，继续培养7 2 h后，胰酶
