《两步转化获取重组腺病毒方法的建立及其在CXCR4反义RNA构建中的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《两步转化获取重组腺病毒方法的建立及其在CXCR4反义RNA构建中的应用（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2 0 0 5 年北京地区肝病感染年会论文汇编一大会发言两步转化获取重组腺病毒方法的建立及其在C X C R 4 反义R N A 构建中的应用 田秀兰李文刚于敏卜定方徐小元北京大学第一医院感染疾病科基因治疗的关键环节是选择一种高效，方便的运载系统将目的基因输送到靶细胞。腺病毒载体具有宿主范围广，分裂期和非分裂期细胞均可感染，插入外源基因容量大，相对安全和稳定等优点而被广泛应用并且得到长足发展。重组腺病毒载体的构建方法也在不断改进，其中穿梭质粒与骨架质粒的同源重组是其限速步骤，由最初的在2 9 3 包装细胞中进行到现在用细菌代替，操作过程大为简化、效率更加提高。但目前的方法重组后筛选阳性克隆困难
2、，所需仪器昂贵，因此，本研究拟寻求一种简便、易操作的同源重组方法。材料与方法1 1 材料腺病毒载体穿梭质粒p A d T r a c k C M V 、骨架质粒p A d E a s y 一1 、大肠杆菌B J 5 1 8 3E h J t 京大学肿瘤医学院分子生物学实验室提供。2 9 3 细胞由本实验室保存，胎牛血清、1 6 4 0 购自G i b c o 公司：限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒均购自p r o m e g a 公司，目的基因P c R 引物根据G e n eB a n k 中C X C R 4c D N A 序列设计，由赛百胜公司合成，引物序列为：上游
3、：c T G G A G A A c c A G c G G T T A c c ，r 游：c c A G T T T c A G c A c A T c A T G G 。12 方法( 1 ) B J 5 1 8 3 感受态细胞的制备及骨架质粒p A d E a s y 一1 的转化：复苏大肠杆菌B J 5 1 8 3 ，挑取单个克隆，用含链霉素的L B 培养基( 3 0 u l m 1 ) 培养后氯化钙法制备感受态，常规方法转化p A d E a s y 一1 ，涂布于含氨苄青霉素的L B 平皿上培养1 2 小时，挑取1 0 个单克隆。( 2 ) p A d E a s y - B J 5
4、 1 8 3 的鉴定及感受态细胞的制备：在上一步挑取的1 0 个p A d E a s y B J 5 1 8 3 中加入含有氨苄青霉素和链霉素的L B 培养基培养，提取质粒用H i n d I l l 酶切，同时设一组保存的p A d E a s y1 酶切对照，选酶切产物与对照组相比图谱未改变者，3 7 。C 摇床摇至0 D 5 5 0 约时收集细菌，用预冷的1 0 灭菌甘油洗两次，离心弃上清，加入0 1 m m o l L 的氯化钙重悬沉淀，再离心，在沉淀中加入0 1 m o l L 的氯化钙( 每5 0 m l 细菌初始培养物加入2 m 氯化钙) ，每2 0 0 u 1 分装r 用冰预
5、冷的离心管中，一8 0 保存备用。( 3 ) R T P C R 法获取目的基因并反向克隆入穿梭质粒中：取健康人外周血分离P B M C ，用T r i z o l 试剂提取细胞总R N A ，以此总R N A 为模板反转录合成c D N A 第一链，再用根据G e n eB a n k 中C X C R 4 c D N A 序列合成的特异性引物进行P C R ，合成C X C R 4 目的片段，反应条件为：9 4 。C 变性4 5 s ，6 0 。C 复性4 5 s ，7 2 。C 延伸5 0 s ，3 0 个循环，7 2 再延伸5 m i n 。P C R 产物克隆入T 载体( B l u
6、 s c r i p t ) 中测序并确定插入方向后用限制性内切酶X b aI 和H i n dI I I 双酶切( 酶切位点方向为5 X b aI 一3 7H i n dI I I ) ，腺病毒载体穿梭质粒p A d T r a c k - C M V 用同样双酶切( 酶切位点方向相反：为5 H i n dI I I - - 3 X b aI ) 。上述酶切产物分别用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，T 4 连接酶连接过夜，这样C X C R 4 目的片段可反向插入p A d T r a c k C M V ，H P p A d T r a c k a n t iC X C R 4 。( d ) 在
7、B J 5 1 8 3 细菌中同源重组：上述连接产物p A d T r a c ka n t iC X C R 4 用热休克法转化已预先转入骨架质粒p A d E a s y 一1 的感受态细胞，转化物涂布于含卡那霉素的L B 平皿中，3 7 。C 培养过夜，挑单克隆抽提质粒，即为同源重组的腺病毒载体p A d T r a c k e a s y l a n t iC X C R 4 ，进一步用琼脂糖凝胶电泳和酶切鉴定。( 5 ) 重组腺病毒载体在2 9 3 细胞中包装、扩增：先培养2 9 3 细胞至8 0 融合后用L i p o f e c t A l l N E 和p A d T r a
8、c k e a s y l - a n t iC X C R 4 共转染。3 4 天后在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达，继续培养2 9 3 细胞至舯-9 0 出现c P E ( 细胞病变、肿胀、变圆) ，反复冻融细胞3 5 次，离心收集上清液，用之再感染2 9 3 细胞大量扩1 0 32 0 0 5 年北京地区肝病感染年会论文汇编一大会发言增重组腺病毒，7 l O 天后收集细胞，P B S 重悬，反复冻融3 5 次，离心收集上清液，C s C l 密度梯度离心纯化，即为携带p A d T r a c k e a s y l a n t iC X C R 4 的重组腺病毒，于1 0 甘
9、油中一2 0 保存。( 6 ) 重组腺病毒的鉴定：以病毒上清为模板，用前述引物行P C R ，如果扩增出C X C R 4 目的片段，则为携带C X C R 4 反义R N A 的重组腺病毒。结果1 挑取1 0 个p A d E a s y B J 5 1 8 3 单克隆，用H i n d I I I 酶切后与原保存的p h d E a s y 一1 对比，有4 个克隆图谱无变化，选其中之一做感受态。2 自健康人外周血淋巴细胞提取的总A 中扩增, H J , C X C R 4 H 译起始区的c D N A 片段，将其克隆至T 载体后，经测序证实是正确的，并确定了插入方向。3 白T 载体上切下
10、目的片段，与穿梭质粒p A d T r a c k c M v 连接，经酶切和P c R 双重鉴定证实目的片段已插入p A d T r a c k C M V 中，由于T 载体上的酶切位点方向与穿梭质粒E 的酶切位点方向相反，所以目的片段在p A d T r a c k -C M V 中是反向插入的，R 口p A d T r a c k e a s y l a n t iC X C R 4 。4 用P m eI 线性化p A d T r a c k e a s y l a n t iC X C R 4 ，转化已预先转入骨架质粒的B J 5 1 8 3 菌，卡那霉素抗性筛选后提取质粒，经电泳和酶
11、切攀定，证实已成功获得了同源重组载体质粒p A d T r a c k e a s y l a n t iC X C R 4 。5 ，同源重组子经2 9 3 细胞包装后，在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白的表达，反复冻融2 9 3 细胞，收获病毒，行P C R 鉴定，扩出了C X C R 4 目的片段。讨论随着现代分子生物学的飞速发展，基因治疗越来越受到重视，各种技术也日渐成熟。近年，己广泛用于肿瘤、遗传性疾病、传染病特别是艾滋病的研究。基因治疗的关键环节是目的基因的输送问题，腺病毒载体具有宿主范围广，分裂期和非分裂期细胞均可感染，插入外源基因容量大，相对安全和稳定等诸多优点而被作为基因治疗载
12、体广泛应用【1 ，近年来，腺病毒载体在实验中不断得到改进，越来越适用于基因治疗的需要，其瞬时表达问题也有望通过免疫佐剂等措施得以解决 3 3 ，重组腺病毒载体的构建方法也逐渐趋于简单化。在腺病毒载体的构建中，骨架质粒与携带治疗性基因的穿梭质粒同源重组是其限速步骤，传统的方法都是在包装细胞( 2 9 3 细胞) 中完成，但哺乳动物细胞操作要求比较高，且筛选困难，尚需多轮纯化“。T o n g c h u a nH e 等嘲创建了在大肠杆菌B J 5 1 8 3 中同源重组的方法。该细菌同源重组效率很高，且细菌的操作远比哺乳动物细胞要简单得多，筛选阳性重组子只需根据抗性的不同用含卡那霉素的L B
13、平板就可以，使实验周期大为缩短，并且在穿梭质粒中加入绿色荧光蛋白报告基因使筛选和滴度测定更为方便。因此可以说是腺病毒载体的一次革命，但B J 5 1 8 3 虽然重组效率高，但转化效率低，需用电穿孔将两种质粒转入细菌中，电穿孔转化时对质粒的纯度要求较高，常需氯化铯纯化，制备感受态时要特别小心 7 。加之电穿孔时电压和电流强度都要很高，因此需用专门的电穿孔仪，一般实验室不易开展。本实验中，我们先将p A d E a s y 一1 用氯化钙法转入B J 5 1 8 3 中，这一步的操作非常容易。因为B J 5 1 8 3 重组效率很高，有可能改变p A d E a s y 一1 的结构，因此我们在
14、转入p A d E a s y 一1以后要挑取1 0 2 0 个单克隆，用有多个酶切位点的酶切鉴定，与从J M l 0 9 。p 提取的p A d E a s y l 比较，所挑克隆图谱全部没有改变，才可进行下一步p A d E a s y - B J 5 1 8 3 的制各” 。p A d E a s y B J 5 1 8 3 的制备也是按氯化钙法，在实验中我们发现，将细菌收获以后，先用1 0 预冷的甘油洗两次，然后再按氯化钙法操作，转化效率似乎更高一些。但如何使转化效率达到最高，可能还有更好的办法，需要在实验中不断摸索。此外，在实验中尚需注意的是，p A d E a s y B J 5
15、1 8 3 细胞的浓度要比一般氯化钙法感受1 0 42 0 0 5 年北京地区肝病感染年会论文汇编一大会发言态细胞的浓度大，因为它的转化敛率低，我们的经验是细胞数在1 0 7 时比较合适。两步转化法获取同源重组予与电穿孔法相比，虽然需要制备两次感受态，两次转化，但质粒的纯度要求较低，无需氯化铯纯化，搬酚一氯仿抽提即可。再者，这种方法因为已预先转入T p A d E a s y l ，再在含卡那霉素的平皿卜生长的克隆一般都是同源重组子。加之转化效率低，阳性克隆数目少，挑克隆特别方便。与现用的电穿孔法相比，无需特殊设备，普通实验室都能进行，且细菌的操作要求小高，使重组腺病毒的构建更加方便。参考文献
16、1 徐志利，早川尧夫基因治疗用腺病毒载体，广东药学，2 0 0 0 ，l O ( 5 ) ：卜5 。2 腺病毒载体构建原理与方法的研究进展，中华实验与临床病毒学杂志，2 0 0 1 ，1 5 ( 4 ) ：3 9 9 4 0 1 。3 Y u t a k aM M a n a h uI 。H i r o s h i0 ，e ta 1 B l o c k a d eo fTc e l lC O S t i m u l a t o r yS i g n a l sn s i n ga d e n o v i r u sv e c t o r sp r e v e n t sb o t ht h ei n d u c t i o na n dt h ep r o g r e s s i o no fE x p e r i m e n t a lA u t o i m m u n eM y o c a r d i t i s J M o l e c
