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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ MK 基因表达及其临床意义基因表达及其临床意义作者：李克强,陈功星,张佳炜,曹树立,胡锡浩 作者单位：浙江省宁波市第二医院肿瘤二科 杭州师范大学医学实验中心 浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所 浙江省宁波市第二医院烧伤科【摘要】 目的 利用实时定量 PCR(Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)相对定量大肠癌组织中Midkine(MK)基因的表达，探讨 MK 基因在大肠癌不同病理状态中的意义。方法 提取 34 例临床大肠癌组织及其癌旁正常组织中的总RNA，经寡聚脱氧胸腺嘧啶逆转
2、录，RT-PCR 扩增，以内标甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的 mRNA 相对定量 MK 基因的 mRNA表达，比较癌组织与其癌旁正常组织中的 MK 表达差异。结果 34例样本中癌组织较之癌旁正常组织，MK 基因表达降低(P0.05)。结论 在大肠癌病程晚期癌组织中 MK 基因的表达水平降低。【关键词】 实时定量 PCR Midkine 基因【Abstract】 Objective With Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Midkine (MK) gene expression was relativ
3、ely quantified in colorectal cancer samples. We discussed a relationship of MK expression and colorectal cancer. Methods The total KKME-专业医学搜索引擎 http:/ was extracted from 34 clinical samples of colorectal cancerous tissue and their adjacent normal tissue. The RNA was reverse transcripted into cDNA w
4、ith oligodT. And the cDNA was amplified by RT-PCR. MK relative expression was quantified to an inherence gene Glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH). At last the different was analyzed between colorectal cancerous tissue and their adjacent normal tissue. Result In the 34 samples MK mRNA of the colorecta
5、l cancerous tissue is less than that of the adjacent normal tissue (P0.05)in the other groups. Conclusion MK expresses lowly in the colorectal cancer of late stage.【Key words】 Real-time Quantitative PCR Midkine gene大肠癌在我国近几年发病率上升，5 年生存率在 60%左右，但治疗效果 30 年来无显著提高1。大肠癌发生机制相对于其它肿瘤的发生机制来说较为清楚，但仍有很多问题尚未解决，
6、特别是早期发生阶段的机制还不清楚,应用基因分析手段检测相关基因的异常变化有可能在早期诊断和预后判断上发挥作用2。Midkine(MK)基因是日本学者 Kadomatsu 等3运用差异杂交的方法，从视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤 HM-1 细胞株 cDNA 文库中筛选出的一个新基因，在多种肿瘤患者血清中高表达4，尤其是在肝癌组织中的表达，肝癌组织恶化时表达增加，肝癌组织恶性程度低时表达少5，此外，KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 基因在早期大肠癌变组织中也是表达升高的6，但晚期的表达未见报道，作者自 2006 年 5 月至 2007 年 12 月利用实时定量PCR(RT-PCR)技术，对临床大
7、肠癌样本进行分析，观察 MK 基因在大肠癌组织及其癌旁正常组织中的表达情况，进一步探讨 MK 基因表达 mRNA 水平与大肠癌病理过程的关系。1 材料和方法1.1 样本的采集 34 例大肠癌及其癌旁正常组织标本随机取自浙江大学医学院附属第二医院肿瘤外科、普通外科手术患者，其中男 17 例，女 17 例;年龄 2584 岁，平均 62.1 岁，经病理检查确定。1.2 试剂和仪器 引物设计为跨目的基因内含子、含两个外显子部分碱基的序列，并经 blastn 基因库搜索，符合引物常规设计要求，荧光素标记为 PCR 仪器所要求：MK 基因上游引物：5-GCGCGCTACAATGCTCAGT-3，下游引物
8、：5- CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT-3，探针：5-FAM CCAGGAGACCATCCGCGTCACC TRMAR-3(上海生物工程公司合成)，含甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因上、下游引物和 VIC 标记探针的 20Human GAPDH、2PCR master mix、dNTPs 购于 PE公司。Trizol、5Strand buffer、0.1M DTT、SSTR为 GIBCO 产品，OligodT 由上海生物工程公司合成。主要设备 RT-PCR 反应仪 7700 Sequence Detector ABI PRISM(PE 公司)。1.3 总 RNA 提取 分别取
9、手术后离体大肠癌组织、癌旁正KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 100mg，在液氮环境下捣碎并研磨成粉，迅速置于 1.5ml的 eppendorf 管中，加 1ml 的 Trizol 液，反复吹打约 10min，加0.2ml 氯仿，用力振荡混匀，冰浴 10min 后, 低温 12000g 离心15min，吸取上清液置另一 eppendorf 管中，加 0.5ml 异丙醇混匀，室温沉淀 10min， 12000g 离心 10min, 弃上清液,沉淀加 75%乙醇1ml 洗涤 1 次，待酒精挥发干后溶于适量 0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，-20保藏备用。1.4 逆转录 cDNA 取
10、 10l 的 RNA，加入 1l 的 50M OligodT，70变性 10min，立即置冰上 2min，离心。然后加入9l 混合试剂：4l 5Strand bufer、2l 0.1M DTT、1l dN(A,T,C,G)TP、1l RNase inhibitor、0.5l SSTR2、0.5l 1%的DEPC 水，在 42水浴 52min，然后 70水浴 15min 终止反应，加80l 水混匀置-20冰箱保存。1.5 RT-PCR 50l 反应体系中分别含有 MK 基因上、下游引物各 0.3M、探针 0.2M;2.5l 20Human GAPDH、25l 2PCR master mix、10
11、l cDNA。然后在定量 PCR 反应仪上进行检测，反应条件为：50预变性 2min;95变性 10min;95变性30s;60退火 1min，扩增 40 个循环。在指数期内采集，根据仪器使用指南及实际情况，设定参数值，得到每个 PCR 反应的 CT(Cycle Threshold)值，即模板 cDNA 经 PCR 扩增达到某一荧光强度的循环次数。1.6 统计学分析 MK 表达的 mRNA 是以同一组织中内标KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 的表达为标准，参照文献7进行数据的计算转换，得到的相对 GAPDH 校正值，一式三份用均数与标准差(xSD)表示，根据样本来源，及临床患者不同生理
12、病理特征，参照相关文献报道8分别列成 6 个大组，又在每组中再分成不同特征的小组，对癌组织和癌旁组织之间，用 SPSS(13.0 版)软件进行处理，统计学分析使用 t检验。计算公式：cDNAMK2CT MK=cDNAGAPDH2CT GAPDHcDNAMK=cDNAGAPDH2CT(CT =CT GAPDH-CT MK) cDNAMK 表示 MK 基因的 cDNA 量，cDNAGAPDH 表示GAPDH 基因的 cDNA 量，CT GAPDH(或 CT GAPDH)以及 CT MK(或 CT MK)表示 cDNA 经 PCR 扩增到指数期时一定量的理想循环数。2 结果本实验中实时定量 PCR(
13、RT-PCR)检测的基因，是电脑监控下的每个样本基因 DNA 逐步倍增变化的整个过程(图 1)，以每次PCR 循环结束后荧光的强度代表基因的产量，在图中为曲线链接的点，每种基因在一个图中显示，每条曲线代表一个样本中检测基因DNA 在整个 PCR 过程中倍增量的变化，样本中基因 DNA 含量以在图中的位置表现，样本基因 DNA 含量越少，曲线逐渐右移。在指图 1 cDNA 聚合酶链反应倍增全过程注：A、B 分别为样本中 GAPDH 基因与 MK 基因表达KKME-专业医学搜索引擎 http:/ cDNA 聚合酶链反应倍增全过程。横轴为 Cycle，即PCR 循环数，每一单位表示一次 PCR 循环
14、，纵轴为荧光强度的对数值(Rn)，即每次 PCR 循环后当时的所有荧光强度与本底的差值，每一条曲线表示一个样本中单一基因 PCR 反应的全过程，整个曲线变化与普通 PCR 变化过程相同，有三个区域，依次为基数期、指数期和平台期。表 1 大肠癌组织及其癌旁正常组织中 MK 基因表达的mRNA组别 nmRNA 水平(xSD)癌组织癌旁正常组织P 值年龄(岁) 4040.060.040.330.220.10 4164100.110.20.210.190.13 65200.120.160.210.180.07 性别 男 170.150.210.20.180.40 女 170.060.090.250.1
15、90.00 病理类型 乳头状腺瘤 50.150.260.260.170.44 管状腺癌200.130.170.240.20.02 黏液腺癌 30.050.060.180.230.48 其它类型 50.040.020.150.150.15 #混合型 10.010.07 淋巴结转移 阴性 180.120.170.210.190.06 阳性 160.10.160.240.190.02 浸润程度 黏膜下层 10.040.27 肌层 90.240.260.30.220.57 浆膜层240.060.080.190.170.00Ducks分期 A40.180.270.30.150.41 B140.10.140.180.20.11 C140.090.160.250.190.02 D20.150.210.150.21 合计 340.110.160.220.190.00注：P 值为该组癌组织与癌旁正常组织两类样本中 MK表达 mRNA 水平的 t 检验，#混合型是指病理观察中同时存在 2 种KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 种病理类型的癌组织数期内采集原始数据经内标校正，每个样本中癌组织及其癌旁组织相对定量 MK 的表达的 mRNA 水平，根据样本来源的不同
