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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ QBC939 VEGF 表达的影表达的影响响作者：潘润阳 作者单位：福建医科大学附属第一医院外科, 福州 350005【摘要】 目的 探讨环氧合酶2(COX2)抑制剂塞来昔布对胆管癌细胞株 QBC939 血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。 方法 体外培养胆管癌细胞株 QBC939，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测塞来昔布与胆管癌细胞株 QBC939 VEGF 表达间的时效关系和量效关系。 结果 塞来昔布在一定剂量(2080 mol/L)和时间(1248 h)内显著抑制 QBC939 细胞 VEGF mR
2、NA 的表达和培养上清液中 VEGF 的浓度，与单独培养液对照组比较，差别有统计学意义(P0.05)。 结论 选择性 COX2 抑制剂塞来昔布可在一定时间和剂量范围抑制胆管癌细胞株 QBC939 VEGF 的表达。【关键词】 胆管癌 环氧合酶 COX2 抑制剂 VEGF 塞来昔布Effects of Cyclooxygenase2 Inhibitor Celecoxib on the Expression of VEGF in Human Cholangiocarcinoma QBC939 Cell LinesPAN Runyang， SHI Zheng， HE QingliangDepart
3、ment of General Surgery, The Affiliated First Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, ChinaKKME-专业医学搜索引擎 http:/ Objective To investigate the effects of the selective cyclooxygenase2(COX2) inhibitor, celecoxib, on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in human cholang
4、iocarcinoma QBC939 cell lines. Methods The relationship between celecoxib and the expression of VEGF in human cholangiocarcinoma QBC939 cell lines were studied by using reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR) and enzymelinked immunoadsorbent assay(ELISA). Results The expression of VEG
5、F were inhibited significantly in a timedependent(1248h) and dosedependent(2080 mol/L)manner than the control group(P0.05).Conclusion The selective COX2 inhibitor, celecoxib may play an important role on the inhibition of VEGF expression in human cholangiocarcinoma QBC939 cell lines.KEY WORDS: chola
6、ngiocarcinoma; cyclooxygenase2; cyclooxygenase2 inhibitor; vascular endothelial growth factor; celecoxib福建医科大学学报 2008 年 7 月 第 42 卷第 4 期潘润阳等：塞来昔布对胆管癌细胞株 QBC939 VEGF 表达的影响胆管癌是胆道常见恶性肿瘤，早期临床症状不典型，易向周围组织、血管和神经浸润。多项研究证实，环氧合酶2(cyclooxygenase2，COX2)不仅与炎症反应过程密切相关，而且对多种肿瘤的发生、发展和预后都起着重要的作用12，其机制目前尚未明确，可能与肿瘤细胞K
7、KME-专业医学搜索引擎 http:/ endothelial growth factor，VEGF)是目前所知最强的促进血管内皮生长的细胞因子。笔者研究选择性 COX2 抑制剂塞来昔布(Celecoxib)与胆管癌细胞株QBC939 VEGF 表达的关系，探讨 COX2 对胆管癌血管生成的作用机制，为塞来昔布在胆管癌防治的临床研究提供实验参考。1 材料与方法1.1 材料人胆管癌 QBC939 细胞株由第三军医大学西南医院董家鸿教授惠赠。0.25%胰蛋白酶、RPMI1640 培养基、小牛血清(美国Gibco 公司)，塞来昔布(合肥森瑞化工有限公司)，OneStep RTPCR 试剂盒(美国 P
8、romega 公司)，Trizol(美国 Invitrogen 公司)，引物和 DNA marker(厦门泰京生物技术有限公司)，人 VEGF ELISA试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)。1.2 方法1.2.1 细胞培养细胞用含 10%小牛血清、100 U/mL 青霉素链霉素的RPMI1640 培养基，置 37 、体积分数为 0.05 的 CO2 培养箱中培养，细胞换液时间 12 d，传代 24 d，传代前用 0.25%胰蛋白酶消化。1.2.2 一步法半定量 RTPCR1.2.2.1 总 RNA 提取KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 细胞以 5105mL1 接种于 6 孔细胞培养板，
9、待长满 80%，一组细胞加入 40 mol/L 塞来昔布分别作用0，12，24，36，48 h,另一组细胞以不同浓度塞来昔布(0，10，20，40，80 mol/L)作用 24 h。收集细胞，按 Trizol 说明书一步法提取细胞总 RNA，并进行纯度分析、定量及琼脂糖凝胶电泳观察，D260 nm/D280 nm 为 1.82.0。1.2.2.2 RTPCR VEGF 引物上游: 5ATGAACTTTCTGCTGTCTTG3下游: 5TGCATGGTGATGTTGGAC3扩增后 DNA 片段长 382 bp。GAPDH 引物上游: 5GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGA3下游: 5TG
10、TTAGTGGGTCTCGCTCCTG3扩增后 DNA 片段长 223 bp。用 OneStep RTPCR 试剂盒检测，结果用凝胶图像软件Gel pro4.0(Media Cybernetics)分析，VEGF/GAPDH 比值反映 VEGF mRNA 的相对含量。一式 3 份,重复 3 次。1.2.3 ELISA 检测细胞上清液 VEGF 浓度QBC939 细胞以 5105mL-1 接种于 24 孔细胞培养板，待长满 80%，加入塞来昔布，分组同上。吸取培养上清,用双抗体夹心ELISA 法检测 VEGF 含量,操作方法按说明书进行。一式 3 份,重复3 次。KKME-专业医学搜索引擎 ht
11、tp:/ 统计学处理测定结果数据以 xs 表示,采用 SPSS 10.0 统计软件进行分析,组间差异以单因素方差分析进行检验,P0.05 为差别具有统计学意义。2 结 果2.1 塞来昔布对胆管癌细胞株 QBC939 VEGF mRNA 表达的影响在一定浓度及时间内随着塞来昔布浓度递增或作用时间延长，QBC939 细胞 VEGF mRNA 表达递减(图 1A，2A)。对凝胶成像分析系统分析得出 VEGF 和 GAPDH 的比值进行的统计分析结果见图 1B,2B。2.2 塞来昔布对胆管癌细胞株 QBC939 分泌 VEGF 的影响塞来昔布的浓度为 20,40 及 80 mol/L 时，明显抑制VE
12、GF 的分泌(与对照组比较分别为 P0.05,P0.01,P0.01)(图 3)。40 mol/L 塞来昔布作用 12,24,36 及 48 h 后可显著降低培养上清液中VEGF 浓度(与对照组比，P0.05,P0.01,P0.01,P0.01)(图 4)。3 讨 论3.1 COX2 及 VEGF 的生物学功能研究表明，胆管癌组织存在着 COX2 及 VEGF 的表达，两者显著相关34。COX 是前列腺素合成的限速酶，已知有 2 种亚型：环氧化酶1(COX1)和环氧化酶2(COX2)。COX2 是一种诱导酶，在正常组织中低表达，一般难以检测，当细胞接受肿KKME-专业医学搜索引擎 http:/
13、 是目前所知最强的促进血管内皮生长的细胞因子，能选择性地作用于血管内皮细胞膜上的两种酪氨酸激酶受体而发挥作用。血管形成是肿瘤生长、侵袭、转移过程中的重要环节，实体肿瘤的进行性生长及转移有赖于其新生血管的形成5。VEGF常在多种肿瘤中过表达，可作为肿瘤病人无瘤生存率的观测预后指标6。VEGF 的高度表达与肿瘤的转移、复发及预后密切相关，减少肿瘤细胞的 VEGF 的表达可望延缓肿瘤的发展与扩散。3.2 塞来昔布对 QBC939 VEGF 表达的影响本实验在基因和蛋白水平探讨选择性 COX2 抑制剂塞来昔布与胆管癌细胞株 QBC939 VEGF 表达的量效和时效关系。结果显示，无论是 RTPCR 检
14、测 VEGF mRNA 的表达，还是ELISA 检测细胞上清液中 VEGF 蛋白的分泌，塞来昔布与 VEGF 之间都存在一定的剂量和时间上的依赖性关系，表现为在一定范围的实验浓度及时间内，随着塞来昔布浓度增高及作用时间延长，VEGF表达量递减，提示塞来昔布对胆管癌细胞 VEGF 的表达具有抑制作用。3.3 塞来昔布对 VEGF 表达抑制作用的机制COX2 抑制剂可降低肿瘤的发生率并预防肿瘤的形成7。其作用靶点为环氧合酶，其经 COX2 途径抑制肿瘤发生的可能机制有：减弱 bFGF、VEGF 和 PDGF 的表达抑制血管的发生;通过降低 bcl2 和 Akt 酶活性促进凋亡;抑制 DNA 的氧化
15、和突变8。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 等认为 COX2 可能产生前列腺素 E2(PGE2)，通过 EP 受体/cAMP 途径来调节肿瘤中 VEGF 基因转录表达9。Abdelrahim 等用基因敲除方法研究认为，COX2 抑制剂之所以能降低 VEGF 的表达抗血管生成，在于 VEGF 启动子结合 sp蛋白的位点，与依赖性的 Spl、Sp4 蛋白质的降解有关6。新近研究认为，COX2 抑制剂抗肿瘤作用尚存在非 COX2 依赖途径，即不通过下调 COX2 的水平，其作用机制可能与塞来昔布抑制IKK 活性、NFB 与 DNA 结合能力有关910。选择性 COX2 抑制剂塞来昔布是近年开发的新型非甾体类抗炎药，在抑制胆管癌发生、发展过程中起着一定的作用。除了已知的诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖外，本研究还提示其在抑制肿瘤微血管的生成有一定的作用,此为胆管癌的抗血管治疗提供一定的实验参考。本课题组已证实反义 RhoC 可抑制 QBC93
