大肠杆菌感受态的制备

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1、 大肠杆菌感受态的制备大肠杆菌感受态的制备原理原理: 热激法是利用冰冷的 CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态” ，易于摄取外源 DNA。转化效率为 106 107转化子/g DNA。材料材料：Top10、pcDNA3.0, TB buffer（现用现配） 、超纯水、碎冰。LB 液体培养基 200 ml（不含 AMP） 、LB 固体培养基（含 AMP） 、LB固体培养基（不含 AMP）10ml 圆底离心管（玻璃或塑料） 、100ml 锥形瓶、2.0 ml 离心管、各型号枪头, 刻度移液管 均需灭菌处理甘油：100ml (高压灭菌)氨苄（母液 100mg/ml，终浓度为

2、100ug/ml）： 1ml 母液需氨苄100mg 过滤除菌。仪器仪器：滤器、0.22um 微孔滤膜、刻度吸量管、恒温摇床、恒温培养箱, 分光光度计、比色杯、低温离心机、制冰机、超净工作台, 移液器。 步骤步骤：1）从冻存的 E.coli .Top 10, 划线接种至 LB 固体培养基（不 含 AMP）. 37培养 O/N, 16h 左右。2) 从新活化的 E.coli .Top 10 菌平板上挑取一单菌落，接种与2ml LB 液体培养基（10ml 圆底离心管）中，37振荡培养O/N, 16h 左右。备注: E.coli . Top 10, 20%无菌甘油, 70保存。3)将该菌悬液以(400

3、UL)1:1001:50 转接于 20 ml LB 液体培养基中，37振荡扩大 培养，当培养液明显混浊后，2.53 小时后测一次 OD(600nm)，至 OD600nm0.6 时停止培养.摇菌期间, 配 TB buffer，开制冰机。TB buffer 置于冰上预冷(2030 分钟). 低温离心机预冷(2030 分钟)以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4）细菌置于 冰上,10min。5）取 12 管, 1.5 ml 细菌培养液 3000 g 4离心 5min,弃上清。6) 每管加 200 ul 预冷的 LB，轻轻混匀, 均成 2 管, 置冰上2030 分钟，3000 g 4离心 5min,弃上

4、清。 备注:5)和 6)是为浓缩细菌. 细菌置于 冰上,10min。7）每管加 1 ml 预冷的 TB buffer，轻轻混匀，置冰上 2030分钟。 8) 3000 g 4离心 5min,弃上清。重复 7)和 8)9）加入 50 ul 预冷的 TB buffer，不要重悬或轻轻重悬，置4过夜备用。提高转化效率吗？10) (可 选)添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后, 超低温冷冻贮存备用（-70） 转化转化1.50ul 感受态+1ul 质粒 2.冰浴 30min。此时打开水浴锅预热。3.42水浴 90s,置于冰 上 2 分钟。4.加 1ml LB 培养基（不用预冷、不含 Amp）,混匀

5、后转移到10ml 圆底离心管中 37震荡 1h, 4000rpm 离心 5 min,弃部分上清。5.铺板，将上述摇匀的菌液取 20ul 和 100ul 涂于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置 30min,待菌液完全吸收后倒置培养皿，37培养 16-24h。6. 挑取一单菌落，菌落 PCR 鉴定正确。接种与 2ml LB 液体(含 AMP)培养（10ml 圆底离心管）中，37振荡培养 O/N, 16h 左右。提取质粒, PCR 鉴定,酶切鉴定,测序鉴定。20%无菌甘油, 70保存。LB 液体培养基：液体培养基：蛋白胨：1.0gNacl: 3.0g酵母粉：0.5 g用 1N 的 NaOH 调节

6、 PH=7，ddH2O:100ml蓝盖瓶, 高压灭菌后使用，冷却至 55左右加入 Amp，常温备用。LB 固体培养基固体培养基:蛋白胨：1.0gNacl: 3.0g酵母粉：0.5 g琼脂糖: 1.5gddH2O:100ml高压灭菌后，冷却至 55左右加入 Amp，铺板，倒置。先在常温下放置几小时-O/N. 4备用。TB bufferHepes.Na:0.13g无水 CaCl2:0.083gKCl:0.932gMncl2.4H2o:0.544gdd H2o:50ml先将前三者用超纯水溶解，用 1N 的 Hcl 调 PH 至 6.7，不能调过，如果调过，需要重新配制。调好 PH 至 6.7 后，再

7、加入 Mncl2.4H2o溶解，最后定容至 50ml。注意事项注意事项1. 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测 OD600 来控制。DH5 菌株 OD600 为 0.5 时细胞密度是 5107/ml） ；2. 化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn 2+或 Co 2+） 、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍） ； 3.所有操作均应在无菌条件无菌条件和冰上进行冰上进行；4. 计算 rpm 和（RCF）g. G1.11910（）r（rpm）5. 所使用的器皿必须干

8、净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能 大大降低细菌的转化效率.6. TB buffer 现配, 调 PH, 过滤除菌，过滤后的溶液置于无菌容器中。7. 100ml 储存用的 LB 培养基高压后 4保存（用蓝盖瓶） 。100ml 储存用的 dd H2o高压后常温保存，用时 1.5ml 的 EP 管分装。LB 培养基配好后及时高压。8.取 LB 培养基、甘油、dd H2o等储备液时，务必在超净台内操作。9.细菌用超净台要保持干净无尘，使用前用 70%乙醇插拭或喷洒。湘仪湘仪 H1650RH1650R 台式高速冷冻离心机转子参数台式高速冷冻离心机转子参数: :型号转子名称最高转速最大相对 离心力

9、容 量备注No1角转子1650018360121.5/2.2ml 800 No2角转子1300011400105ml1800 No3角转子1200013050241.5/2.2ml2800 No4角转子1100010790361.5/2.2ml3200 No5角转子1200010920480.5ml3200G1.11910（）r（rpm）18360=1.11910（）r（16500）2 2r=6.0266324如果 G=3000，代入公式计算得：rpm=6684湘仪 TG16-W 微量台式高速离心机最高转速最高转速 16000r/min最大相对离心力最大相对离心力17800xgG=8000 rpm=10891G=9000 rpm=11552G=10000 rpm= 12177G=12000 rpm=13339TG16-WS 台式高速离心机台式高速离心机G1.11910（）r（rpm）17800=1.11910（）r160002R=6.21G=10000 rpm=11996G=8000 rpm=10730G=9000 rpm=11380