《PCNA、Bcl2与MVD在结直肠癌中的表达与意义的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCNA、Bcl2与MVD在结直肠癌中的表达与意义的研究（61页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、泸州医学院硕士学位论文PCNA、Bcl-2与MVD在结直肠癌中的表达与意义的研究姓名：刘玉林申请学位级别：硕士专业：中西医结合基础（解剖学）指导教师：萧洪文20060501P C N A 、B c l 2 与M V D 在结直肠癌中的表达与意义的研究摘要目的：结直肠癌( 大肠癌，c o l o r e c t a lc a r c i n o m a ，C R C ) 是常见的危害人类健康的消化道恶性肿瘤之一，自1 9 7 5 年以来，其发病率一直保持较强劲的上升势头，且近年来年轻化趋势明显。虽然，流行病学调查表明，高脂肪食物和纤维不足是发病的主要诱因之一，但同其他肿瘤一样，结直肠癌的确切发病
2、机制尚不十分明确。现代分子生物学研究表明，肿瘤的发生不仅是细胞增殖过度和分化异常性疾病，而且也是细胞凋亡减少性疾病。增殖细胞核抗原( p r o l i f e r a t i o nc e l ln u c l e a ra n t i g e n ，P C N A ) 只在增殖细胞中合成，其合成与表达和细胞增殖周期相关，是细胞增殖状态的一种标记。B细胞淋巴瘤白血病2 基因( B c e l ll y m p h o m a 1 e u k e m i a 2 ，B c l 2 ) 是一种公认的细胞凋亡拮抗基因，能阻止细胞的凋亡，增加细胞的累积率，与许多肿瘤的发生、发展有关。新生血管可为肿瘤
3、提供营养物质，也是肿瘤播散转移的前提，同时刺激肿瘤生长。因此新生血管形成是肿瘤发生、发展的关键环节之一。以往的研究提示P C N A 、B c l 2 和微血管密度( M i c r o v e s s e lD e n s i t y , M V D ) = - - 者与大肠癌的发生、发展可能存在较为密切的关系，但仍存在争论，特别是尚未见联合研究的报道，不清楚它们三者之间的具体相互关系及在大肠癌的生物学行为中扮演的角色。本试验拟用组织芯片技术组织微列阵( t i s s u ec h i p s t i s s u em i c r o a r r a y s ，T M A s ) 和免疫组
4、织化学( I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , I H C ) 的方法研究P C N A 、B c l 2 和M V D 在不同分化程度结直肠癌中的表达情况；探讨其在结直肠癌临床及结直肠癌发生、发展中的作用；探讨P C N A 、B c l 2 和M V D 三者间的相互关系；并进一步探讨组织芯片技术应用的可行性。方法：选取收集病例资料保存完整、首次发病，术前未接受任何放射治疗、化学治疗、中药治疗及免疫治疗等辅助治疗的结直肠组织手术切除标本，共8 0 例，其中，男性4 1 例，女性3 9例；年龄在2 4 8 5 岁之间，小于4 0 岁1 0 例，4
5、 0 岁至6 0 岁2 9 例，6 0 岁及以上4 1 例，中位数年龄6 1 5 岁，平均年龄5 9 3 岁；本资料中按照分化程度分：正常对照组1 0 例，不典型增生组i 0 例，高分化腺癌组2 0 例，中分化腺癌组2 0 例，低分化腺癌组2 0 例：D u k e S 分期：A 期7 例，B 期3 7例，C 期1 4 例，D 期2 例；有淋巴结转移1 6 例，无淋巴结转移4 4 例。应用组织芯片技术构建两个6 7 孔的组织芯片蜡块，组织芯直径1 5 r a m 。组织芯片切片行H E 染色与常规切片相比较，考察其可观察程度。采用免疫组织化学E n V i s o n 法、链霉卵白素一生物素过
6、氧化酶连接法( s t r e p t a v i d i n b i o t i n p e r o x i d a s ec o n j u g a t e dm e t h o d ，S P 法) 检测结直肠组织中P C N A 、B e l 2 和M V D 的表达水平( 本课题选用特异性血管内皮标志物C D 3 4 作为结直肠癌微血管内皮的标志物，进行M V D 的检测) ，进而采用S p e a r m a n S 等级相关分析法分析它们三者之间的相关性，并分析它们三者与结直肠癌的临床病理特征间的关系。全部数据采用S P S S l l 5 统计软件协助处理。结果：1 ) 组织芯片
7、蜡块中的组织芯排列整齐，无碎裂，无移位，切片后检查见无组织芯脱失，少量的组织芯发生皱缩和部分脱失，4 例总 芯片8 0 例占5 。髓染色光镜观察可见组织学类型仍具代表性，与普通切片相比较可观察程度一致。2 、C D 3 4 M V D 在不同结直肠组织中的表达规律是，结直肠癌组织中的表达最高，但各分化程度之间的差别不是太明显( 尤其是在高分化与中分化组之间，无明显的统计学差异，P 0 0 5 ) ，不典型增生组织中逐渐降低，正常结直肠组织中表达最低，总的组间差异有显著性( P = 0 0 0 0 O 0 5 ) ，不典型增生组织中逐渐降低，正常结直肠组织中表达最低，总的组间差异有显著性( A
8、= 0 0 0 0 0 0 5 ) 。6 ) C D 3 4 M V D 与P C N A 的表达呈正相关，r s = 0 6 2 3 俨= 0 0 0 0 O 0 5 ) ；另，P C N A与B c l 2 的表达呈负相关，r s 一0 2 3 3 ( e = o 0 3 8 0 0 5 ) ，i tw a sl o w e ri nt h ea t y p i c a lh y p e r p l a s i cg r o u pg r a d u a l l y ，w h i l ei tw a sl o w e s ti nt h en o r m a lg r o u p ，t h
9、 e r ew a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n g5g r o u p s ( P = 0 0 0 0 0 0 5 ) I tw a sl o w e ri nt h ea t y p i c a lh y p e r p l a s i cg r o u pg r a d u a l l y , w h i l ei tw a sl o w e s ti nt h en o r m a lg r o u p A n dt h e r ew a ss t a t i s t i c
10、a ls i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n g5g r o u p s ( P _ 0 0 0 0 0 0 5 ) 6 ) T h ep o s i t i v e l ys i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o nw a sf o u n do u tb e t w e e nt h ee x p r e s s i o n so fC D 3 4 - M V Da n dP C N A , r s = 0 6 2 3 ( P = O 0 0 0 o 0 5 ) T h ee x p r e s
11、 s i o no fP C N Aw a sn e g a t i v e l yc o r r e l a t e d 诮mB c l - 2 ，b u tt h er sw a so n l y - 0 2 3 3 ( P = 0 0 3 8 1 6 4 8 h j 取出后自来水流水冲洗，双蒸水冲洗，烤箱烘干；3 1 载玻片放入9 5 酒精中浸泡过夜，双蒸水冲洗，烤箱烘干：4 ) A P E S 处理：将载玻片放入A P E S 丙酮溶液中，停留2 0 3 0 秒，取出稍停片刻，再入双蒸水涮去未结合的A P E S ，晾干防尘防污染保存备用。2 1 2 相关溶液的配制1 1A P E S
12、 溶液：将1 0 m l A P E S 溶于5 0 0 m l 纯丙酮中，制成1 ：5 0 的A P E S丙酮溶液。2 10 0 1 M P B S ：N a H 2 P 0 4 2 H 2 03 1 2 9 加双蒸水至1 0 0 0 m l“ - 0 2 MA 液：N a z H P 0 4 1 2 H 2 07 1 6 9 加双蒸水至1 0 0 0 m l 一0 2 MB 液；1 9 m lA 液+ 8 1 m lB 液一O ，2 MP B 液( p H7 4 )将0 2 M P B 液用N S 稀释2 0 倍即可得一O 0 1 M P B S 。3 ) 0 1 胰蛋白酶溶液：氯化钙1
13、 0 0 r a g 加入1 0 0 m l0 0 1 MP B S 中，摇匀后加入胰蛋白酶1 0 0m g 。乞幺组织芯片的制作2 2 1 组织处理在组织离体后尽快进行固定，固定液为4 的中性甲醛，固定时间为2 4 小时。组织取材厚3 m m ，漂洗后分别用7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 酒精梯度脱水、二甲苯透明、5 2 - 5 4 4 C 及5 6 5 8 石蜡浸蜡、5 6 - 5 8 石蜡包埋，制成目标石蜡块。作4 5 “m 组织切片，并进行常规H E 染色。2 2 2 制作方法( 见图1 ，2 )1 ) 组织芯片的设计：拟制作4 2 ( 6 X7 ) 孔组织芯片，包括：正常肠
14、黏膜、不典型增生、腺癌( 包括高分化、中分化、低分化腺癌) 。2 ) 标记供体蜡块：由2 名有经验的病理医师对目标蜡快即供体蜡块( d o n o rb l o c k ) 组织的H E 切片作形态学观察，核对有关正常组织及有关疾病组织的病理诊断，分别在目标 I E 染色组织切片和石蜡组织块上相应位置进行标记，并在保温盒内进行软化( 其温度低于石蜡的熔点) 。3 ) 制备受体蜡块：制各空白毛坯蜡块采用石蜡和蜂蜡混合( 8 ：2 ) ，经过反复的加热冷却，其熔点约为6 0 。C 。使用4 2 孔的模子是2 - 2 2 2 O 8 c m ，组织芯直径1 5 r a m ，间隔1 0 m r 6
15、，打孔针直径是1 5 m m ，包埋框是2 7 X 2 3 1 5 c m ，用4 2 孔模子与阵列针制作空白毛坯蜡块，冷却后处理蜡块的毛边，这样制作的空白毛坯蜡块即为受体蜡块( r e c i p i e n t b l o c k ) 。4 ) 制作组织芯片蜡块：借助玻片上的标记找准供体蜡块的相应位置，利用打孔管刀钻取靶点组织( 直径1 S m m ) 采集组织芯并转移至受体蜡块相应的孔位上，保留一个孔作为标记，并详细记录每一组织芯的编号和临床资料，如此反复即可将数十个组织芯安插在受体蜡块中。然后把每个组织芯压平在同一平面上，在二次包埋仪上行二次包埋制成组织芯片蜡块，后该组织芯片蜡块转移到
16、载玻片上自然冷却，即制成所需的阵列蜡块，最后放入4 冰箱备用。5 ) 对组织芯片蜡块切片：取出备用的蜡块，快速夹在切片机上调整角度，尽量使全部组织芯在同一平砸，切片用一次性刀片，后开始小心进行修片直至最大面，用2 0 “ C 冰袋冰T M A 蜡块2 3 x n i n ，对备用的组织阵列蜡块作3 u m 连续切片，连续切片1 5 2 5 张左右，必须保证每长切片上都有完整的组织芯，切好的蜡片根据研究的需要进行常规贴片( 作H E 染色用) 或裱片于1 0 A P E S 处理的载玻片上( 作免疫组织化学染色用) ，裱片温度4 0 。C ，5 6 。C 烤片4 小时，移至3 7 过夜，室温保存备用。4 翌彩叶笮习丽磊织翻岛蠢语描织仨兰影，淄亍包埋益霉卜o ? 习驾2 疆辫组织芯片蜡块切片图1 恒泰H T - 1 组织芯片制备系统F i g lF 1
