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1、中山大学博士学位论文Toll样受体4在牙髓组织和成牙本质细胞中的表达和意义姓名：蒋宏伟申请学位级别：博士专业：口腔临床医学指导教师：凌均棨20060401T o l l 样受体4 在牙髓组织和成牙本质细胞中的表达和意义中山大学博士学位论文T o l l 样受体4 在牙髓组织和成牙本质细胞中的表达和意义专业：博士生：口腔临床医学蒋宏伟指导教师：凌均柴教授中文摘要整齐排列在牙髓牙本质复合体最外层的成牙本质细胞是牙髓内首先接触外来病原微生物刺激的细胞，近年来的研究发现成牙本质细胞除了具有形成牙本质有机基质的能力外，还能释放细胞因子、趋化因子和抗菌肽等，从而参与了牙髓牙本质复合体的天然及获得性免疫防御
2、反应，利于清除入侵病原体。然而，成牙本质细胞确切的防御机制、它们如何识别和捕获外来抗原这些问题尚不清楚。T o l l样受体是新近发现的最重要的病原相关分子模式识别受体，能识别包括细菌、支原体、病毒等各种外源性配体或坏死细胞、纤维连接素等内源性配体并迅速告知宿主发挥重要的顸警作用。T L R s 在机体天然免疫和获得性免疫之间架起一座桥梁，协调天然免疫和获得性免疫以共同抵抗病原微生物或病变坏死组织等。现今已发现1 0 个人类T o l l 样受体家族成员，它们分别对不同的病原体相关分子模式进行识别。T L R 4 是研究最早，功能最为明确的T L R s 家族成员，它能够与脂多糖( 1 i p
3、 o p o l y s a c c h a r i d e L P S ) 和热休克蛋白等内、外源性配体结合。牙髓、根尖周病是以( 3 - 感染为主的混合感染，L P S 是革兰阴性菌最主要的毒力因子。那么成牙本质细胞和牙髓组织是否通过表达T L R 4 等T L R s 进行免疫防御的? T L R 4信号通路是否影响牙髓损伤修复? 我们用四个部分对此进行了研究。第一章T o l l 样受体4 在人正常牙髓组织和成牙本质细胞中的表达T o l l 样受体4 在牙髓组织和成牙本质细胞中的表达和意义中山大学博士学位论文目的：研究人正常牙髓组织和成牙本质细胞中T L R 4 表达与分布特点，探讨
4、T L R 4在牙髓组织天然免疫防御中的可能作用。方法：从新鲜拔除的人健康第三磨牙获取牙髓组织和成牙本质细胞，扫描电镜观察牙髓摘除后髓腔壁成牙本质细胞形态和附着情况；R T P C R 检测人牙髓组织以及成牙本质细胞中T L R 4 m R N A 的表达情况；采用免疫组织化学技术和免疫印迹方法检测T L R 4 蛋白的表达与定位。结果：扫描电镜观察牙髓摘除后成牙本质细胞大部存留在髓室壁上，细胞形态良好；R T P C R 结果发现正常牙髓组织、成牙本质细胞均可表达T L R 4 m R N A ，产物大小为2 7 8 b p ；免疫印迹法检测正常牙髓、成牙本质细胞在8 9 k D a 附近出
5、现蛋白条带；免疫组化显示正常牙髓组织中的成牙本质细胞、血管内皮细胞T L R 4 免疫反应阳性。正常牙髓中牙髓成纤维细胞不表达T L R 4 。结论成牙本质细胞通过表达T L R 4 参与牙髓牙本质复合体的先天免疫反应，T L R 4 在牙髓抵御外来病原微生物入侵的宿主免疫防御中起重要作用。第二章T o l l 样受体4 在人炎症牙髓组织和大鼠牙髓损伤修复模型中的表达目的：研究T L R 4 在人炎症牙髓组织以及大鼠牙髓损伤修复模型中的分布及表达情况，了解T L R 4 与牙髓炎症发生以及炎症损伤修复的关系。方法：收集人炎症牙髓组织标本，采用免疫组织化学技术对T L R 4 的表达进行定位，同
6、时利用免疫印迹杂交的方法对蛋白表达水平进行半定量分析。利用髓腔单纯开放法建立大鼠牙髓损伤修复模型，通过组织病理学检查观察牙髓炎症发生与转归的整个过程，利用免疫组化技术定位T L R 4 阳性细胞。结果：w e s t e r nb l o t t i n g 结果显示人炎症牙髓组织T L R 4 的相对表达量是正常牙髓组织的两倍左右，经s t u d e n tt 检验，两者有显著性差异( p 1 8 ，表明纯度合格。用O D 2 6 0 测定值和片段长度数据换算出浓度( c o p y t L ) ，再做梯度稀释，制各成阳性定量标准品梯度。荧光定量阴性质控标准品采用灭菌双蒸水。F Q P C
7、 R 测定：阳性定量标准品及样本均按以下反应体系进行：5 S Y B RG r e e n1b u f f e r1 0 t l上游引物F ( 2 5l aM )1u L下游引物R ( 2 5uM )1u Ld N T P s ( 1 0 m M ) ( S i g m a 公司) l p LT a q 酶( 1 U u 1 )2 “Lc D N A5 p Ld d H 2 03 0 p L总体积5 0 9 L反应条件为：9 3 2 分钟，然后9 3 1 分钟，退火1 分钟，7 2 。C1 分钟，共3 5 个循环，最后是7 2 7 分钟延伸。荧光定量P C R 采用P E7 0 0 0 全自动
8、荧光定量P C R 仪( 美国P e r k i nE l m e r 公司) 。反应结束后，由电脑自动分析并计算结果。结果按B = 拷贝数p , Lc D N A 进行分析考虑到各个样本总R N A 浓度的差异，最终计算结果按下列公式换算：A ( 拷贝数p g 总R N A ) = B ( 拷贝数肛Lc D N A ) O D 2 6 0 0 2各样本结果用内参照1 3 a c t i n 进行校正，实验重复2 次后进行统计学分析。4 1 5W e s t e r nb l o t t i n g 检测T L R 4 表达收集L P S 刺激与未加任何刺激的细胞标本，用冰浴的P B S 溶液
9、洗涤2 遍后，加入细胞裂解缓冲液混匀，用超速匀浆机匀浆，置于4 离心机1 2 0 0 0 9 离心后，取上清液。冻存于一8 00 C 。其余步骤同前。结果用i m a g ep r o5 0 软件进行分析，重复测量5 次的结果进行统计学处理。7 0T o l l 样受体4 在珂：髓组织和成爿本质细胞中的表达和意义中山大学博士学位论文4 1 6 统计学分析实验数据均以平均数士标准差fx s 1 表示，采用S P S S l l0 软件分析。多组间比较采用单因素方差分析( o n e - w a y A N O V A ) ，若有显著性差异，多个实验组与一个对照组比较采用D u n n e t t
10、f 检验( D u n n e t t ，t e s t ) ，组问两两比较采用B o n f e r r o n ir 检验( B o n f e r r o n irt e s t ) ，以P 。：加入盘蒋稀释灌稀释a 9 兔抗A 雌4 多克隆抗俸筛释度为I 蝴) ，4 拣箱内掰育过夜， 吸击j 辫，o0 1m o l Lm s 缓磅液冲冼5r 玎i n 玛灞 女畹清稀释渡糟释的F I i E 标记革抗鬼二抗丽释度为la o ) ，3 7 蟒育6 0 1 I l 扣，P B S 缓冲菠冲撬5r n 讷 3 蒸毽承迅速7 孛洗3 敬，湖m ，见缓冲甘潞封片。髂 健对照用m s 4 t 替抗蒜
11、余步骤固上。l5 观察表达和定量检测Z e i s s 5 1 0L 蹦激先共聚焦显舷镜检测“ I L R 4的荧光定量表谜。绿色荧光通港拄撂观察烈发波长为4 8 8r i m 。在5 3 0m 渡长观察；每强蠕片随机选取5 个视野观察并由摇摇软件测定荧光强度，其均值作为每张切片的平均荧光强度，将每个样率的5 张切片的荧光强度均值作为该样本“ I L R 4 表这强器斡定量指标。轹本同时以Z e i s s A x i c v j a ，) 2n 】a g i n g 多功能垒自动显微镜进行观察。I6 统计学分析采用辨S S l oo 软件进行统计学处理t 所有资羁 均采用均数螈准差( ；劫表
12、示。组阐比较采用两 独立群率间的越验。P o0 1 为显著性差异。2 结果21 正常和炎症牙髓组织礼R 4 韵荧光表达正常纽未见或偶皿阳瞧细照( 圈1 、2 ) 。H E 染色显示为正常牙嚣组织，无凌蛙细胞或偶强炎性细胞( 图3 ) 。经F 1 7 U 染色。“ I L R 4 阳性襄这的部位应为绿色荧光。在炎症组，1 0 侵际本均可发现，】 L R 4 的表达大量增加，可见整个病交牙髓组练鹿染色阳性细胞致量不均一，染色阳性程度再一致，多处发射绿 包荧竞的细胞成西聚集 4 、5 ) 。H E 染色证实为邻近癍灶有大羹炎症缎胞，如单棱亘噬鲴脆、小嚣 E 缅胞或血管终皮细胞与戚纾维细魏蒙集鲍投漓
13、医圈6 ) 。墨2 正常牙髓侥删禳察，T a R 4 衷遗为醇性。( 瑚)0 9 9 5 - 2 0 0 5 ) 2 e l i 7 妇mr 。 嚼镕。p # j B l 。i s c c 9h lA l l n 尊R s e r 神0 4慝3 正常乎髓H E ；她，元炎症纽路爱潜。( N O O )正常缓平均荧光表选强度F D 为2 韪8 0 25 7 ，炎症组为2 5 81 2 + 2 45 t ，餐，检验，P Q0 1 ，两者有掇显著豹统计掌差异。3 讨论 I L R 4 是第一个被鉴定的A 类T o l l 样受体，广 瑟襄这在单棱细胞、巨噬钿麓和中性粒胡胞莓( I ) 1 4 阳性纲
14、臆，及内发细胞和上皮细胞等c D l 4睛性组咆上”1 。目前认为，L P S 炎症信号主要通过 I L R 4 泰向细臆癌传导，激活的N F 氍B 移位入棱， 痿劫免疫反应基因转导。血管内皮绍胞和牙周膜成纤维细胞是牙周炎症反应的重要绸骢成分，有研 究证实，在L P S 刺激下，它们能上调q L R 4 盼表达”1 。W a n g 等的研究表明，牙龈睁啉盟簏菌的 L P 3 信号，可以通过结含衰达予牙龈戚纤维细胞胞 膜上的“ I L R 4 而向胞内凿导参与野厨慢性巍瘢和 骨吸收过程” 。c 3 H 娜e 小鼠是一种自发的L p s 挽性突变小鼠，其R 4 有一个单蛋白突交使受镩功能完叠改变
15、，导致对L P S 的低反应性。有 学着比较了C 3 H 用e J 与野生型C 3 H H e O u J 小鼠牙髓炎及裰尖周炎模型中骨屡教拓、脓肿形成及炎症因子产生的差异，结果发现：C 3 H H e J X 小鼠的骨屡破坏明显磕鞋，L ，1 lL 1 8 ，L 。1 2 等炎症因子的表达显著增加。不仅如此，阻R 4 还能调节破骨细照分化、巨柱细脆凋亡等”j 。 车宴验1 0 例人健康牙髓组织中均不表达 L R 4 ，面1 0 倒爱性牙髓标本中“ I L R 4 强霹陛表谜，这可能是感染牙髓组织豹G + 营，如牙龈口 啭单胞菌、牙髓卟啭单巍越、酱氏菌等鲍L P s 促进大量姑日涸魏、巨噬细胞
16、、中性粒细胞活化、积聚，并上调 这些靶细胞胞鹰上 L R 4 的衰这薪致。牙髓细脆激对牙髓细胞的直接毒性及其诱导靶细胞群放斡太罴炎性园子，如“ L N F 一L 一1 、L 6 、L 8 、L一1 0 等”。均导致牙髓、根尖周炎症的发生与发展，且L P g 时牙髓缨胞碱性磷酸酶活性有抑制佧用不剥予牙髓细胞向成牙本质细胞的分化。既然“ R , R 4 控制饕L P s 炎症信号进入细熊内的运路，那么：牙髓细肫是否同牙龈成纤维细胞和牙周藻戚纤 维细照样表达砌。并通过 L R 4 对L P S 发生 应蔷7 应用扰 I L R 4 抗体或减少靶细臆 L R 4 豹表遮，是否能硪较L P S 对牙髓、尖周组织的病理损害、促避牙髓自身的修复? 这将是我们下一步的研 究方向。镦光共聚焦最镦镜技术应用在受棒的研究中 近年才得到重税。本研究中R 4 被标记上异硫氰荧光雾( F 】豫) ，F r I c 授激光共聚焦显徽镜上的激光管激发詹发射
