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1、L e w i sY 抗原通过P 1 3 K A k t 及E R K M A P K 信号通路调控卵巢癌细胞增殖相关蛋自表达的机制研究L e w i sYA n t i g e nR e g u l a t et h eE x p r e s s i o no fP r o l i f e r a t i o nR e l a t e dP r o t e i nT h r o u g hP 1 3K A k ta n dE R K M A P KS i g n a lP a t h w a y导二级学科：塑左登堂论文课题起止时间：至Q Q 墨生墨旦二2Q ! ! 生2 月论文完成时间：至Q
2、 ! ! 生! ! 旦中国医科大学( 辽宁)20 12 年4 月一、=，一”v音nV-毒hf_，谁。碍：，净中国医科大学研究生学位论文独创性声明僦Y 2 黝0 9 1 3 1 4 肋锣本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：查l 查筮日期：小，年多中国医科大学研究生
3、学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：目录一、摘要中文论著摘要l英文论著摘要4二、英文缩略语8三、论文前言9 9日U 舌论文一、L e w i sY 抗原与胰岛素样生长因子受
4、体1 在卵巢上皮性肿瘤中的表达及相关性研究前言1 一1日U 吾l材料与方法1 1实验结果1 9讨论2 8结论3 0论文二、L e w i sY 通过P 1 3 K A k t 和E R K M A P K 信号通路调节卵巢癌细胞增殖相关因子的表达前言3 一1日U 百1材料与方法3 2实验结果3 6讨论3 9结论4 1论文三、L e 丽sY 抗原通过调控p 2 7 表达水平促进人卵巢癌R M G 一1 细胞增殖的机制前言4 2日舌4 2材料与方法4 3实验结果4 5讨论5 1结论5 2四、本研究创新性的自我评价5 3五、参考文献5 49O235777绩成研P一私一一录问介附期简、述学谢人六综在致
5、个中文论著摘要L e w i sY 抗原通过P 1 3 K A k t 及E R K M A P K 信号通路调控卵巢癌细胞增殖相关蛋白表达的机制研究刖罱卵巢癌的发生与发展是一个极其复杂的多因素的过程，目前对其发生机理尚不清楚。细胞膜表面有许多糖脂、糖蛋白构成的复合物，对细胞细胞、细胞一分子的识别十分重要，参与信号转导、粘附等分子相互作用，与细胞生长、凋亡、运动、分化等重要生命过程密切相关。细胞癌变后细胞膜上的糖复合物，特别是其糖链部分发生结构和量的变化。卵巢癌主要表现为I I 型糖链的改变，如L e w i sY 抗原。研究表明7 5 的上皮性卵巢癌出现L e w i sY 不同程度的过量表
6、达，且表达增高的患者预后不良。我们在前期工作中利用基因转染技术将人0 【1 ，2 岩藻糖转移酶( a l , 2 f u c o s y l t r a n s f e r a s e ，a l ，2 一聊基因转入卵巢癌细胞系R M G I ，建立了L e w i sY 稳定高表达卵巢癌细胞系R M G - I - H ，发现转染后R M G - I H 细胞对铂类、紫杉醇及5 F U 等化疗药物敏感性下降，提示L e w i sY 抗原具有提高卵巢癌细胞生存能力的作用。细胞表面的受体几乎都是糖蛋白，研究表明，改变糖基转移酶的表达可影响细胞表面受体的糖链结构，继而影响其表达数目及功能，促进细胞
7、增殖。体细胞通过跨越紧密调节的细胞周期进行增殖和分化，细胞周期的调控涉及一系列调控蛋白，这些蛋白表达量及活性的变化在周期调控中极为重要。我们在前期工作中利用基因芯片技术检测a 1 ，2 F T 基因转染前后细胞系癌相关基因的表达差异，结果显示转染后细胞中有8 8 种差异性表达基因，差异基因主要表现在细胞增殖、信号转导、蛋白氨基酸磷酸化、转录、凋亡等方面。因此，我们推测L e w i sY 可能作为信号转导通路上的重要结构参与细胞内信号转导，进而影响卵巢癌细胞的生物学行为。本研究主要在前期工作的基础上，利用已经建立的0 【1 ，2 F T 及L e w i sY 稳定高表达细胞模型，探讨L e
8、w i sY 抗原促进卵巢癌细胞增殖的具体作用机制，为研究卵巢癌的发生、发展机制奠定基础，为卵巢癌的早期诊断及靶向治疗提供理论依据。方法第一部分：用R T - P C R 、W e s t e r nB l o t 及免疫共沉淀等方法研究卵巢癌细胞系R M G I 转染0 c 1 ，2 F T 基因前后细胞中胰岛素样生长因子受体1 ( I n s u l i n 1 i k eg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r - 1 ，I G F R 1 ) 与L e w i sY 基因、蛋白的表达及两者的结构关系，以及抗体阻断前后I G F R 1 酪氨酸磷酸化水平
9、的变化；用免疫组化法检测卵巢上皮性恶性、交界性、良性肿瘤和正常卵巢组织中L e w i sY 抗原与I G F R l 的表达及相关性，并分析其表达与卵巢癌组织学类型、病理分级、临床分期及淋巴结转移等病理参数的关系；利用免疫荧光双标记法检测L e w i sY 抗原与I G F R 1 在卵巢癌组织中表达的相关性。第二部分：利用流式细胞仪分析a l ，2 F T 基因转染前后细胞的细胞周期；采用R e a l t i m eP C R 方法检测细胞中C y C l i n s ，C D K s 和C K I s 的m R N A 水平；利用W e s t e r nB l o t 方法检测基因
10、转染前后、L e w i sY 抗体阻断前后及信号通路抑制剂处理前后细胞中C y c l i n s ，C D K s 和C K I s 的蛋白表达水平。第三部分：利用R T - P C R 、免疫印迹法方法检测0 【1 ，2 F T 基因转染前后细胞中p 2 7 ，p - p 2 7 ，S k p 2 基因及蛋白的表达；采用免疫共沉淀方法检测p 2 7 泛素化水平；利用W e s t e r nb l o t 方法检测P 1 3 K A k t 和E R K M A P K 信号通路抑制剂L Y 2 9 4 0 0 2 ，P D 9 8 0 5 9 和抗L e w i sY 单克隆抗体处理前
11、后细胞中上述重要分子的变化。结果第一部分：基因转染后细胞系R M G I H 中I G F R - 1 的基因和蛋白表达水平均上调俨均 0 0 5 ) 。在卵巢上皮性恶性肿瘤中，L e w i sY 抗原的阳性表达率为8 8 3 3 ，明显高于交界性( 6 0 0 0 ) 俨 0 0 S ) ；I G F R 1 在卵巢恶性上皮性肿瘤中的阳性表达率为9 3 3 3 ，明显高于交界性( 6 3 3 3 ) ( P O 0 5 ) ；在卵巢癌中，L e w i sY 抗原和I G F R 一1 的表达水平随临床分期的增加、分化程度的降低而增加，但无统2计学意义( 尸l O 0 5 ) ，与组织学类
12、型及有无淋巴结转移无关俨 O 0 5 ) ；L e w i sY 抗原和I G F R 1 在卵巢癌组织中同时高表达，且其表达具有正相关性( P 0 0 5 ) I nm a l i g n a n te p i t h e l i a lo v a r i a nt u m o r s ，t h ep o s i t i v i t yr a t e so fL e w i s ( y ) a n dI G F R - 1d e t e c t i o nw e r e8 8 3 a n d9 3 3 3 ，r e s p e c t i v e l y , w h i c hi sh i
13、g h e rt h a nt h ep o s i t i v i t yr a t e si nm a r g i n a l( 6 0 0 0 a n d6 3 3 3 ，a l lP o 0 5 ) B o t hI G F R - 1a n dL e w i s ( y ) w e r eh i g h l ye x p r e s s e di no v a r i a nc a n c e rt i s s u e s ，a n dt h e i re x p r e s s i o nl e v e l sw e r ep o s i t i v e l yc o r r e l a t e d 俨 0 0 5 ) 。卵巢癌组根据病理分级：高分化。2 1 例，中分化2 1 例，低分化1 8 例；手术病理分期：按国际妇产科联盟( F I G O )标准：I I I 期3 9 例，I I I 期2 l 例；其中有盆腔淋巴结转移者1 2 例。所有病例均为初发，临床病理资料完整，术前均未行放、化疗。3 主要材料D M E M 培养基、胎牛血清( 美国G I B C O 公司产品) ；鼠抗人L e w i sY 单克隆抗体磷酸化兔抗人I G F R 1 多克隆抗体( 英国A b e a m 公司) ；鼠抗人I G F R - 1 单克隆抗体( 美国S a n
