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1、实验 蛋白质的沉淀反应与颜色反应一、实验目的掌握鉴定蛋白质的原理和方法。熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步熟悉蛋白质的有关反应。二、实验原理蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。三、实验仪器
2、1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH 试纸 6、水浴锅 7、移液管 四、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释 10-20 倍，3-4 层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。2、 0.5%苯酚：1g 苯酚加蒸馏水稀释至 200ml。3、Millons 试剂：40g 汞溶于 60ml 浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。4、尿素晶体5、1%CuSO4：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至 100ml6、10%NaOH：10g NaOH 溶于蒸馏水，稀释至 100ml7、浓硝酸8、0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于 9
3、5%的乙醇并稀释至100ml.9、 冰醋酸10、浓硫酸11、饱和硫酸铵溶液：100ml 蒸馏水中加硫酸铵至饱和。12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。13、95%乙醇。14、醋酸铅溶液：1g 醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至 100ml15、氯化钠晶体16、10%三氯乙酸溶液：10g 三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml17、饱和苦味酸溶液：100ml 蒸馏水中加苦味酸至饱和。18、1%醋酸溶液。五、实验步骤蛋白质的颜色反应（一） 米伦（Millons）反应1、苯酚实验：取 0.5%苯酚溶液 1ml 于试管中，加 Millons 试剂0.5ml，电炉小心加热观察颜色变化。2、蛋白质实验：取 2ml 蛋白
4、液，加 Millons 试剂 0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，观察现象。（二） 双缩脲反应1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热熔化，至重新结晶时冷却。然后加 10%NaOH 溶液 1ml，摇匀，再加 2-4 滴 1% CuSO4溶液，混匀，观察现象。2、取蛋白液 1ml，加 10%NaOH 溶液 1ml，摇匀，再加 2-4 滴1% CuSO4溶液，混匀，观察现象。（三） 黄色反应取一支试管，加入 1ml 蛋白液及浓硝酸 5 滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入 10%NaOH 溶液 1ml，观察颜色有什么变化。（四） 茚三酮反应取蛋白液 1ml 于试管中，加 4-8 滴
5、茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。蛋白质的沉淀（一）蛋白质的盐析作用1、试管中加蒸馏水 3ml，加固体硫酸铵至饱和。另一支试管加蛋白液 2ml，再加入饱和硫酸铵溶液 2ml，摇匀静置观察现象。2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。（二）有机溶剂沉淀蛋白质试管中加蛋白液 1ml，加晶体氯化钠少许，溶解后加 95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质1、取试管 2 支，各加蛋白液 2ml，一支管中滴加 1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加 1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。2、取一支试管加蛋白
6、液 2ml，再加入 10%三氯乙酸 1ml，充分混匀，观察结果。（四）生物碱试剂沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白液 2ml 及醋酸 4-5 滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。六、实验结果蛋白质的颜色反应（一） 米伦（Millons）反应1、苯酚实验：溶液即出现玫瑰红色。2、蛋白质实验：出现白色的蛋白质沉淀，小心加热后凝固的蛋白质出现红色。（二） 双缩脲反应1、有紫色出现。2、溶液有蓝紫色出现（三） 黄色反应先有黄色沉淀生成，加入 10%NaOH 溶液 1ml 后颜色变为橘黄色。（四） 茚三酮反应有蓝紫色出现。蛋白质的沉淀（一）蛋白质的盐析作用1、有蛋白析出。2、有蛋白质析出，加水后可复溶。（六）
7、有机溶剂沉淀蛋白质取一试管加蛋白液 1ml，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加 95%乙醇 3ml,摇匀，观察现象（七）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质取试管 2 支，各加蛋白液 2ml，一支管中滴加 1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加 1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。（八）生物碱试剂沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白液 2ml 及醋酸 4-5 滴，再加饱和苦味酸和鞣酸数滴，观察现象。七、 实验分析蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。其中米伦试剂能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应，而组成蛋白质的氨基酸中酪氨酸含苯酚基团，因此可
8、用米伦试剂检测蛋白质中酪氨酸的存在。尿素被加热，形成双缩脲，在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，也能进行此反应。蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及 a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条
9、件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。重金属离子（如 Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。植物体内具有显著生理作用的含氮碱性
10、化合物成为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸等。当溶液 PH 小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。蛋白蛋白质变质变性（性（protein denaturation） ）是指蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸、强碱、重金属盐、尿素、乙醇、丙酮等；能使蛋白质变性的物理方法有加热(高温)、紫外线及 X 射线照射、超声波、剧烈振荡或搅拌等。如果变性条件剧烈持久，蛋白质的
11、变性是不可逆的。如果变性条件不剧烈，这种变性作用是可逆的。这时，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质复性（renaturation）。例如胃蛋白酶加热至 8090时，失去溶解性，也无消化蛋白质的能力，如将温度再降低到 37，则又可恢复溶解性和消化蛋白质的能力。 蛋白质变性的应用价值医学：临床上的消毒和灭菌-使病原微生物变性 注射及外伤采用 75%乙醇灭菌 手术器械及其它用品采用高温高压灭菌 手术室用紫外线灭菌 用热凝法检查尿蛋白 实验室： 防止蛋白质变性：在生产和保存激素、酶、抗体血清等具有生物活性的蛋白质（如酶、疫苗、免疫血清等）时，应防止其
12、变性失活，其中在低温条件下生产与贮存以上蛋白质就是这个道理。 实验室的灭菌：细胞培养室等亦用紫外线照射消毒灭菌。日常生活：熟食较生食易消化：因为蛋白质变性后，肽链构象由卷曲变为伸展，使肽健暴露，易被蛋白水解酶消化水解。其中盐析法作为一种蛋白质胶体简便的提取手段被广泛应用于工业生产。盐析法盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,使某些成分在水中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离。 如向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐如(NH4)2SO4 或 Na2SO4溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。这样析出的蛋白质仍可以溶解在水中，而不影响原来蛋白质的性质。因此
13、，盐析是一个可逆的过程。利用这个性质，可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质 蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。 盐析法简单方便，可用于蛋白质抗原的粗提、丙种球蛋白的提取、蛋白质的浓缩等。但盐析法提纯的抗原浓度不高，只能用于抗原的初步纯化。目前盐析法应用于免疫球蛋白和酶提取、分离纯化、浓缩等和中药的提取。
