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1、A T C I C 致敏树突状细胞抗肾癌免疫效果评价E v a l u a t i o no nt h ea n t i r e n a lc e l lc a r c i n o m ai m m u n ee f f e c t so fd e n d r i t i cc e l l sa r m e dw i t hA T C I C研究生：型：盘基导论文课题起止时间：2Q ! Q 生垒旦二2Q12 生兰月中国医科大学( 辽宁)2012 年5 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注
2、和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：玉：盘整日期：弘1 2 ，奠f 矿中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关
3、部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅牙口借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：猫：邀蕉j指导教师签名：墨丝日期：丝! 兰：，：! 星目录一、摘要中文论著摘要1英文论著摘要。3二、英文缩略语5三、论文前言6日U 舌材料与方法9实验结果1 1讨论16结论17四、本研究创新性的自我评价18五、参考文献19六、附录综j 苤2 1在学期间科研成绩3 0致 射31个人简介3 2中文论著摘要A T C I C 致敏树突状细胞抗肾癌免疫效果评价目的l 、根据抗原抗体免疫反应原理，制备A T C I C ，为进一步将A T
4、C I C 作为肿瘤抗原物质致敏D C 做好准备。2 、通过检测D C 负载A T C I C 后的表型及分泌因子变化情况，探讨A T C I C 对D C生物学功能的影响。3 、通过检N D C 负载A T C I C 后激活的C T L 对肿瘤细胞的杀伤率的影响，评价D C 负载A T C I C 后诱导的抗肾癌免疫效果情况。方法l 、用5 氟尿嘧啶诱导肾癌细胞凋亡，获取凋亡肾癌细胞后与G 2 5 0 单抗结合，形成复合物A T C I C 后，用其致敏i D C ，未致敏i D C 为对照组。2 、用流式细胞仪检测D C 负载A T C I C 后其表面分子C D 8 3 、C D 8
5、6 、C D 8 0 及H L A的变化情况。3 、E L I S A 试剂盒检；1 9 1 , U D C 分泌I L 1 2 和I F N 吖等细胞因子的量的变化。4 、M T T 法检测D C 负载A T C I C 后对T 淋巴细胞增殖反应的影响。5 、C C K 8 检测D C 负载A T C I C 后激活的C T L 对肿瘤细胞的杀伤活性。结果l 、获取凋亡的肿瘤细胞，G 2 5 0 单抗与凋亡细胞表面的G 2 5 0 抗原特异性结合，形成复合物A T C I C 。2 、D C 的表型变化相对于负载A T C 、G 2 5 0 单抗和未负载的D C ，负载A T C I C 的
6、D C 疫苗显著上调C D 8 6 、C D 8 0 、C D 8 3 和H L A 的表达( 4 2 0 4 v s 2 8 3 4 、3 3 7 7 、2 6 5 2 ，P O 0 5 ) 。I F N y 分泌量的组间比较结果显示，D C + A T C I C 组高于其他各组，差异具有统计学意义( 6 3 2 3v s 5 1 7 4 、5 2 4 3 、4 9 0 4 、4 3 6 4 ，P 0 0 5 ) 。结果表明，A T C I C 致敏后D C 分泌I L 1 2 和I F N 吖的能力明显增强( 图3 ) 。单纯D CD C +D C + A T CD C + I C单纯T
7、 A T C - I CG r o u pI 聊卜YI L _ 1 2图3经抗原致敏后的m D C 的I L 1 2 和I F N 吖的分泌水平四、A T C I C 致敏m 1 ) C 的免疫表型表达上调D C 培养第8 天时，流式细胞仪检测各组D C 的表型表达，结果( 表1 ) 显示，D C + A T C I C 组D C 表面H L A D R 的表达明显高于D C + A T C 组、D C + G 2 5 0m A b 组和单纯D C 组 ( 3 5 5 2 - 土2 7 2 ) V S ( 2 7 4 2 - 士2 1 1 ) 、( 2 6 9 0 士2 8 2 ) 、( 2
8、9 4 5 + 1 5 8 )，P O 0 5 ) 。对于C D 8 3 、C D 8 0 、C D 8 6 的表达，D C + A T C I C 组也明显高于其他各组 ( 7 9 3 9 M 4 4 ) v s ( 6 6 7 1 + 3 8 3 ) 、( 6 9 0 6 士2 0 1 ) 、( 7 4 4 9 士1 3 5 ) ，P O 0 5 ) 。结果提示，A T C I C 致敏D C 的表面C D 8 3 、C D 8 0 、C D 8 6 、1 3衙的幻O幻HHo。DoH_。H目如A H L A D R 的表达水平明显升高，G 2 5 0 m A b 致敏D C 也可促进D C
9、 成熟和增加D C 表面免疫分子的表达。，G 2 5 0 m A b 致敏组相比于D C - N 组和D C - A T C 组差异也具有显著性( P 0 0 5 ) 。表l培养第8 d D C 的免疫学表型( n - 5 ，；士s )G r o u pC D 8 3C D 8 0C D 8 6H L A D RD C - N6 6 7 1 士3 8 32 4 3 2 士3 2 32 6 5 2 士2 1 42 7 4 2 士2 1lD C 十A T C I C7 9 3 9 士1 4 4 3 8 1 7 士2 5 5 4 2 0 4 士3 4 2 3 5 5 2 士2 7 2 D C 十A
10、T C6 9 0 6 2 0 12 3 7 蛀2 4 12 8 3 4 士1 162 6 9 任匕8 2D C + G 2 5 0 m A b7 4 4 9 圭1 3 5 A3 1 9 4 士3 2 9 a3 3 7 7 士1 6 1 2 9 4 5 士1 5 8 F17 0 6 01 6 7 182 8 7 2 58 3 8 7J P0 0 0 10 0 0 10 0 0 00 0 0 7P O 0 5 )( 表3 ) 。表3D C - A T C I C 诱导的C T L s 对不同靶细胞的杀伤活性( ，n - - 6 ，工士s )G r o u pE f f e c t o rc e l
11、 l T a r g e tc e l l2 5 ：15 ：11 0 ：12 0 ：17 8 6 - 0A 5 4 9F4 3 6 7 士2 5 2 3 0 0 4 + 4 4 55 0 7 8 74 7 3 3 + 3 18 +3 3 3 3 士3 7 8 “2 5 3 7 151 0 0 士2 0 0 43 3 6 7 士3 0 56 7 6 0 05 6 12 士2 0 4 +3 6 6 7 + 1 5 26 2 0 4 3P O 0 1 0 0 1 0 0 1 O 0 11 5讨论D C 是可分泌促进T 、B 淋巴细胞增殖的高效刺激因子，还具有很强的诱导初次免疫应答、显著刺激初始性T
12、细胞增殖的能力，因而在机体抗肿瘤免疫应答中起重要作用1 6 1 7 1 。研究f 1 8 】表明，肾透明细胞癌( r e n a lc e l lc a r c i n o m a ，R C C ) 的发生与患者的免疫细胞功能缺陷有关，肿瘤细胞无法被T 细胞识别、杀伤是由于荷瘤宿主的D C 数量减少及功能缺陷有关。肾癌对放化疗不敏感，但它又是一种免疫原性较强的肿瘤，能诱发宿主产生免疫反应，是理想的免疫治疗模型。但肾癌的相关或特异性抗原目前知之不多，已知的抗原肽并不一定能诱导最佳的抗肿瘤免疫反应，难以制成有效肿瘤疫苗【1 9 】。目前，A T C 作为一种全细胞抗原较肿瘤相关抗原( t u m
13、o ra s s o c i a t e da n t i g e n ，T A A ) 更有助于产生特异性的抗肿瘤免疫应答，但由于A T C 诱导D C 成熟的能力不强，因此在诱导抗肿瘤免疫时，仍然不能达到令人满意的效果。G 2 5 0 是表达于R C C 的肿瘤相关抗原，它位于肾癌细胞膜上，其胞外区( p r o t e o g l y c a n ，P G ) 可作为抗体结合部位与G 2 5 0 抗体结合【2 0 1 。G 2 5 0 的特性使其应用于肾癌的诊断与治疗中。T s o 等【2 1 】用G 2 5 0 与G M C S F 融合形成G 2 5 0 G M C S F 融合蛋白
14、，将这种融合蛋白加入到外周血单个核细胞的培养体系中，能够培养出带有R C C 相关抗原的成熟D C 疫苗。该疫苗高表达C D 8 3 等成熟表面分子，能够产生强大的C T L 效应。B l e u m e r 等【2 2 1 研究证实，以G 2 5 0 为基础的靶向治疗对肾癌也有治疗作用。在肿瘤免疫过程中，细胞抗原的交叉提呈具有特殊的意义，但肿瘤细胞本身的抗原提呈能力很差【2 3 1 免疫复合物( i m m u n ec o m p l e x e s ，I C ) 能够显著地诱导D C的活化与成熟，为进一步激活特异性的C T L 提供第二信号【2 4 1 。在激发肿瘤特异杀伤T 细胞方面，单克隆抗体与肿瘤细胞负载的D C 一直优于负载多肽或
