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1、论文课题起止时间：2Q ! Q 生垒旦= 至Q12 生垒旦论文完成时间：2Q12 生垒旦中国医科大学( 辽宁)20 12 年5 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明H I 丫I I z I I I 1 u 1 l l 譬I f l l z f f I f 。l l I 5 i i 4 i l l 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成杲也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意
2、。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：， 磁担中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规忌即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大尊本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。，论文作者签名：至丝指导教师签名：主：l ! 垫姿日期：勿7 j 川目录一、摘要
3、中文论著摘要1英文论著摘要6二、英文缩略1 3三、论文论文一E g r - 1 的特异脱氧核酶对大鼠颈总动脉损伤后内膜增生和E g r 一1 的影响前言1 4刖百1 4材料与方法1 5实验结果2 1讨论2 8结论3 1论文二E g r - 1 特异脱氧核酶抑制大鼠动脉损伤后内膜增生机制的研究前言3 2刚罱j Z材料与方法3 3实验结果3 6讨论4 4结论4 8四、本研究创新性的自我评价4 9五、参考文献5 0六、附录综述：5 7在学期间科研成绩8 0致谢8 1个人简介8 2中文论著摘要E g r - 1 特异脱氧核酶下调E g r - 1 支配的蛋白抑制大鼠颈动脉球囊损伤后的内膜增生- 。!
4、曼， 翮吾经皮冠状动脉介入治疗术( p e r c u t a n e o u sc o r o n a r yi n t e r v e n t i o n ，P C I ) 是目前治疗冠心病的重要手段之一，但P C I 术后再狭窄( R e s t e n o s i s ，R S ) 的发生严重影响了远期疗效。再狭窄的发生是机体对血管内皮损伤的一种修复反应，包括早期的血管弹性回缩和后期的血管平滑肌细胞( v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l ，V S M C ) 增生、迁移，细胞外基质的产生以及血管重塑等。以药物洗脱支架为代表的新医疗器
5、械的应用，显著降低了P C I 术后再狭窄的发病率。然而其远期疗效还有待考证。近年来随着分子生物学的发展，基因治疗很可能成为防治P C I 术后R S 的一种新策略。早期生长反应因子1 ( e a r l yg r o w t hr e s p o n s ef a c t o r - 1 ，E g r - 1 ) 是一种锌指结构转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，T F ) ，它控制与细胞生长、增殖、分化和凋亡相关的多个基因的表达，在外源性刺激( 包括生长因子、细胞因子和有害刺激) 下被激活，诱导V S M C 的分裂、增殖和内膜增生。脱氧
6、核酶( d e o x y r i b o z y m e ，D R z ) 是一个具有酶活性的小的单链D N A 片段，通过切割特定的R N A 链调节蛋白的表达，作为一种基因抑制剂有着实际的治疗作用。本研究应用合成的E g r - 1 特异脱氧核酶( D N A e n z y m e 1 0 2 3 D R z ，E D 5 ) 转染至球囊损伤后的大鼠颈总动脉中，观察其对大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响，评估转染E D 5 后对生长因子、细胞周期和炎症基因表达变化的影响，探讨其在血管损伤后抑制内膜增生的作用机制。材料和方法1 、E D 5 的合成与标记根据基因库合成E D 5 ( 由
7、上海博亚生物技术有限公司合成) ，其碱基序列为5 C C G C G G C C A G G C T A o C l A C A A C G A C C T G G A C - G A r - 3 ，在其5 和3 端进行硫代修饰，5 端用异硫氰酸荧光素( f l u o r e s c e i ni s o t h i o e y a n a t e ，F I T C ) 标记，以便于在荧光显微镜下观察转染后基因的分布情况。两侧下划线所示部分为寡核苷酸识别序列。2 、动物模型制备和实验分组9 6 只雄性W i s t a r 大鼠( 3 5 0 4 0 0 克) 由中国医科大学实验动物中心提供
8、。所有动物均根据实验室动物护理的原则以及中国动物保护法处理。随机分为4 组( 每组2 4 只) ：假手术组，M g C h 组，F u G e n e 6 组和F u G e n e 6 + E D 5 治疗组。在左颈总动脉造成内膜撕脱和血管损伤。具体过程为：1 0 的水合氯醛麻醉后，颈正中切开，暴露左颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，用血管夹暂时阻断左颈总动脉和颈内动脉，用2 F 导管( 美国B x a e t rH e a l t h c a r ec o r p o r a t i o n ) 从颈外动脉插入向前推进至主动脉弓，推入生理盐水充盈气囊，沿颈总动脉全长回撤，然后抽瘪气囊。这个过程
9、重复三次，且每次回撤时导管旋转9 0 度。撤除导管后将2 0 0 u l 含有5 0 0 9 9F I T C E D 5 、转染试剂3 0 9 lF u G e n e 6 ( 购自R o c h e 公司) 和17 0 9 lI m MM g C l 2 的溶液局部注入至损伤的血管节段内，使其在局部作用2 0 分钟。结扎颈外动脉，移除颈总动脉和颈内动脉的血管夹恢复血流，缝合伤口。术后局部使用青霉素以预防感染，术后3 、7 、1 4 、2 1 d 分批处死动物。3 、形态分析H E 染色用于形态学测量。颈总动脉用石蜡包埋，然后切成5 1 x m 厚的切片，并用H E 染色，结果用电脑辅助形态
10、分析系统分析，特别注意分析内膜和中膜的厚度。测量外弹力层包绕的面积( E E L A ) ，内弹力层包绕的面积( I E L A ) 和管腔面积( L A ) 用来评估新生内膜的厚度。其他面积计算如下：中膜面积= E E L A - I E L A ，新生内膜面积= I E L A _ L A ，内膜中膜面积比( I M ) = 新生内膜面积中膜面积。4 、免疫组化标本用4 多聚甲醛固定，石蜡包埋，然后制备成5 9 i n 厚的切片。然后用二甲苯和乙醇脱蜡。切片在3 H 2 0 2 孵育1 0 m i n 用来灭活内源性酶的活性。然后切片在牛血清蛋白( B S A ) 中孵育2 0 m i n
11、 以尽量减少非特异性结合的抗体。分别加入稀释至1 ：2 0 0 的一抗( E g r - 1 、P D G F B B ，C y c l i nD 1 ，C D K 4 ，M C P - 1 和I C A M 1 ) ，4 “ C 过夜。P B S 冲洗三遍后，切片滴加生物素标记的二抗，在常温下孵育3 0 r a i n 。2三遍冲洗后，滴加抗生物素蛋白一生物素一辣根过氧化酶复合物，常温下孵育3 0 m i n ，之后用P B S 清洗，在显微镜直视下用D A B 显色，苏木素复染。棕褐色用来表示阳性染色。P B S 代替一抗做为阴性对照。5 、实时P C R 分析按照制造商的说明( I n
12、v i t r o g e n ，生命科技，美国) 应用T R I Z O L 试剂从颈总动脉提取总R N A 。R N A 浓度用分光光度计测量( U V 3 0 0 ，H a m p s h i r e ，E n g l a n d ) ，c D N A 用反转录酶合成。使用A B I7 5 0 0P r i s m 序列检测系统和T a q M a n 引物探针完成实时P C R 的操作。总反应体积为2 0 I - t l ：2 p l 的c D N A ，1 0 1 x l 的S Y B R P r e m i xE x 呦饿，0 4 p l 的引物和7 2J d 的超纯水。主要的循环
13、参数如下：1 个循环的预变性( 9 5 。C3 0s ) ，4 0 个循环的退火( 9 5 。C5 s ) 和延伸( 6 0 。C3 4s ) 。I - a c t i n 作为每个样品的内参。2 - Q 方法计算基因表达的相对变化。6 、W e s t e r nb l o t 分析含有5 0 I - t g 总蛋白的样品用S D S P A G E 分离，并转移到P V D F 膜上。脱脂奶粉封闭过夜，用T B S 液清洗两遍，然后加入1 ：4 0 0 稀释的一抗( E g r - 1 、P D G F - B B ，C y c l i nD 1 ，C D K 4 ，M C P 1 和I
14、C A M - 1 ) 室温下孵育2 小时。辣根过氧化物酶标记一抗，化学发光试剂增强反应。7 、统计分析所有的测量数据用均数4 - 标准差表示，使用S P S S l 3 0 软件进行统计分析。用单因素方差分析进行数据分析，组间比较采用L S D 法，当P 1 个循环9 5 。5 s j( 5 ) 以1 3 - a e t i n 为内参照基因，校正每个样品C T 值；确定各样本中目的基因和内参照基因的C T 值，每个目的基因的C T 平均值减去对应模板的内参照基因的C T 平均值，得至U A C T ，根据公式：A C T ( 样本) = 目的组基因C T 一对照基因内参C T ；A C T
15、 ( 对照) = 对照组基因C T 一对照基因内参C T ；A A C T = A C T ( 样本) 一C T ( 对照) ；因此样本目的基因的相对表达量= 2 一C T 1 1 也l 。实验重复3 次。9 1 、W e s t e r n - b l o t 法检测血管壁组织的E g r - 1 蛋白含量：每两个血管样本为一组，剪碎后加人预冷裂解缓冲液2 0 0 p l ，冰水浴中超声粉碎。4 “ C ，1 2 0 0 0 r p m 离心l h ，取上清。上清即为总蛋白，采用酚试剂法进行蛋白定量。分别取样品l O p l 加入到装有2 5 m l 碱性铜液的试管中，混匀，室温放置2 0 m i n 。然后各管分别加入0 2 5 m l 的酚试剂，混匀，
