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1、T A K l s i R N A 对R A 患者滑膜细胞中r o m p 9和t i m p1 表达的影响E f f e c t so ft a k lo ng e n ee x p r e s s i o no fm a t r i xm e t a U o p r o t e i n a s e 9a n dt i m p li n R Ap a t i e n t sf i b r o b l a s ts y n o v i o c y t e s研究生：兰垒煌导一级学科：堕鏖匡堂论文课题起止时间：2Q ! Q 生! Q 旦二2Q ! ! 生鱼月中国医科大学( 辽宁)20 12 年4
2、 月删、, 2 0 9 t7 6 8中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：薹兰圣：立宴日期：趁2 兰：上：乡弓中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工
3、作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。、论文作者签名：芝墅宴指导教师签名：墨里聋坐日期：也2 ：兰豸目录一、摘要中文论著摘要：鬯：1 _ 英文论著摘要6二、英文缩略语1 2三、论文T K l s i R N A 对R A 患者滑膜细胞中m m p 9 和t i m p l 表达的影响前。占1 3日U 舌”。
4、3材料和方法1 5实验结果1 8讨论2 l结论2 2四、本研究的创新性和自我评价2 3五、参考文献2 4六、附录综j 苤2 6在学期间科研成绩3 7致谢? ! 3 8个人简介3 9中文论著摘要T A K lSiR N A 对R A 患者滑膜细胞电m m p 9和tim p l 表达的影响刖吾类风湿性关节炎( r h e u m a t o i da r t h r i t i s ，R A ) 是一种慢性进行性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎及对称性关节骨、软骨破坏为主要特征。R A 的发病率在我国约为0 4 ，其第一个5 年致残率达3 0 ，平均缩短寿命5 7 年，已经成为一种严重威胁人类健康的
5、疾病。近年来发现R A 滑膜细胞在类风湿关节炎发挥主要的作用，特别是分泌一些细胞因子像I L - 1 ，T N F - Q ，聚蛋白多糖酶等诱导关节炎症的发生和关节软骨的破坏。而且这些炎性因子之间相互作用，呈级联放大作用，促成关节炎症的不断加重。所以寻求一种良好的治疗方法成为现在学者研究的焦点。生长因子蛋白激活激酶( T A K l ) 属于M A P K K K 家族，能被多种细胞因子包括I L 一1B ，I L - 1 8 ，T N F - Q 等激活。细胞因子与膜受体结合后，通过T A K l 磷酸化并激活M A P 2 K s 家族的M E K 3 6 和M E K 4 7 ，随后M
6、E K 3 6 和M E K 4 7 分别激活M A P K 家族的P 3 8 激酶、应激活化激酶( J N K ) 进而激活转录因子激活蛋白1 ( A P 一1 ) 。此夕F T A K l 还能激活I K K ，从而使N F - k B 进入细胞核中，参与基因转录。转录因子A P 一1 和N F KB 能上调多着e p R A 发病中的重要基因产物表答，如基质金属蛋白酶( M M P s ) 、环氧化酶2 ( C O X 一2 )和多种细胞因子J 。其中M M P s 可导致关节破坏；C O X 一2 增加前列腺素生成，导致疼痛和持续滑膜炎症；细胞因子刺激周罔的滑膜细胞产生更多的炎性因子，
7、形成萨反馈机制使R A 病情不断持续和进展【3 】。目f i 已有研究表明在骨性关节炎软骨细胞中T A K l大规模的表达，并且阻遏T A K l 基因可以使其下游炎性因子表达减少【引。我们所作的前期工作已经证实了T A K l 在R A 病人滑膜中有较高水平的表达和活性，因此推断T A K l 可能在R A 发病中起重要作用，阻断T A K l 将有助于降低致炎性细胞因子对R A 关节和滑膜的影响，T A K l 可以作为R A 基因治疗中的一种新的靶基因。金属蛋白酶组织抑制剂( T I M P ) 是M M P 的特异性抑制剂，在E C M 代谢调节中是与M M P 对应的负调节剂。主要由
8、氨基末端和羧基末端结构域来维持自身的稳定性，目前己明确的T I M P 主要有四种最O T I M P l 、T I M P 2 、T I M P 3 、T I M P 4 。其中T I M P l 能抑制绝大多数i m P 可与M M P 9 前体及有活性的M M P l 、3 、9 形成高度亲和的、非共价键结合的复合物。T I M P 在组织中的主要作用是调节蛋白水解和抗水解作用之间的平衡，进而维持细胞外基质的稳定性。M M P 与T I M P 之间维持一种平衡的关系，一旦这种关系被打破就会导致细胞外基质分解和组织结构的重朔啼3 。T I M P l 与T I M P 家族中其他的成员不
9、同，并没有明确的特异性。它既可以抑制大多数M M P 酶类，也可以抑制人金属肽酶含血小板反应蛋白( A D A M T S ) 像A D A M T S 一4 和A D A M T S 一5 。目前已有研究证实重组的人T I M P l 可以明显抑带I J A D A M T S - 4 和A D A M T S 一5 ，这种抑制作用甚至强于对M M P 的抑制1 。T I M P l 可以在发育的胚胎细胞、正常的人软骨和滑膜细胞中表达，在关节炎滑膜细胞中表达会上调。另外在体外培养的滑膜成纤维细胞和软骨细胞中可被转化生长因子上调盯1 。I L - 1 也可更进步放大T I M P l 的分泌。
10、基质金属蛋白酶( M M P ) 是关节软骨中降解聚蛋白多糖和胶原的主要酶类，M M P s是在聚蛋白多糖核心蛋白的球问区( I G D ) A s n 3 4 12 P h e 3 4 2 位点裂解聚蛋白多糖，产生的聚蛋白多糖片段分别为G 1 2 DI P E N 和F F G 随3 。M M P 家族在类风湿关节炎的软骨、滑液、滑膜均有明显的增高趋势，它主要通过炎性通路被上游的介质激活。大量的研究证实M M P 在R A 的诊断中具有重要的意义。M M P 与T I M P 之间维持一种平衡的关系，特别是T I M P I 与M M P 9 特异结合，抑制后者的降解作用。同时又受转化生长因
11、子激活激酶的调节，T A K l 激活J N K 诱发M M P l 基因表达导致关节炎的发生一1 。M M P s 可降解细胞外基质的内肽酶，其可降解关节骨与软骨中的胶原、蛋白多糖及其他的基质大分子，从而促进血管翳对软骨的侵蚀。故而滑膜中的成纤维样细胞来源的M M P s 是导致关节病理损伤的重要因素。并有报道滑膜的过度生长引发致炎细胞因子及基质金属蛋白酶的产生。正常滑膜被覆细胞、R A 患者滑膜A 型细胞基本上不能合成或很少合成M M P s ，在R A 过程中，增生的B 型滑膜细胞可能在巨噬细胞分泌的I L 1 、T N F Q 等细胞因子刺激下，持续合成和分泌酶原形式的M M P 3
12、t 1 0 】。在血浆激肽释放酶、纤溶酶或组织蛋白酶G 等的作用下，转化为具有2活性的M M P 3 ，并激活滑膜被覆细胞分泌的胶原蛋白酶原，进而引发M M P s 家族其他成员活化。G l “ a v a l l e s e 利用原位杂交测定M M P s 的R N A ，发现M M P 3 在滑膜组织中过度表达，且滑液中含有大量M M P 3 ；另外，对R A 患者滑液中蛋白多糖、核心蛋白的分析表明，他们在原位被M M P 3 所清除【l l 】。1 9 8 7 年O k a d a 研究发现，R A 患者的关节液中M M P 1 ，M M P 2 ，M M P 一3 显著增高，对关节结构
13、有明显破坏作用，早期R A 血清中M M P 1 ，M M P 2 的表达水平与疾病的活动性和预期的功能损害及X 线表现呈正相关。通过对3 0 7 例临床患者研究发现，患者关节液中M M P 3浓度显著增高可以作为R A 的早期诊断和治疗观察指标之一，尤其在血清阴性患者中适合。基因研究发现，M M P 3 的基因多态性与R A 的严重性相关，而不是与R A是否发生相关，研究这种多态性有助于早期预见R A 的严重程度。虽然发现血清M M P s 水平与疾病的活动相关，但在疾病丌始的时候血清p r o M M P 3 高水平表达预示疾病的进展可能比较严重【l 引。一、实验材料材料与方法l 、1 1
14、 例滑膜组织标本来源于2 0 0 9 年1 1 月2 0 1 0 年1 2 月中国医科大学附属第一医院骨科住院患者。所有患者诊断均符合美国风湿病学会1 9 8 7 年提出的诊断标准，术前均经伦理学认证。R A 患者男4 例，女7 例，年龄5 0 6 4 岁，平均( 5 6 2 岁) 。2 、免疫组化染色试剂盒3 、R e a l t i m e P C R 反转录试剂盒4 、D h a r m a F E C Ts i R N A 转染试剂盒实验方法1 、细胞培养R A 患者滑膜细胞在D M E M 培养基和1 0 胎牛血清中于3 7 。C 、5 C 0 2 条件下进行培养。细胞单层生长达8
15、0 - 8 5 培养面积后，用于实验或传代。32 、细胞鉴定将培养至三代的滑膜细胞做免疫组化鉴定，取出贴满细胞的盖玻片，l O 甲醛溶液固定3 0 m i n 。晾干后P B S 冲洗三次，加入3 H 2 0 2 5 1 0 m i n ，P B S 冲洗后，加入正常善养血清f 室温静置1 “ 0 1 5 m i n ，倾去、勿洗、甩t 加一抗过夜。滴加辣根过氧化物酶，室温孵育1 0 m i n ，P B S 冲洗3 x 3 m i n ，D A B 显色。显色完全后复染、脱水、封片。3 、细胞转染取对数生长期的滑膜细胞种植于六孔板中，种板浓度3 1 0 5 孔。从六孔板中移除培养基，随机将培养的滑膜细胞分为阴性对照组，实验组。严格
