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1、，几种检测解脲脲原体方法的平行比较研究王荷英施荑琴叶颇章王红春中国医学科学院中国协和医科大学皮肤病研究所；中国C D C 性病麻风病防治技术指导中心摘要解脲脲原体( U r e a p l a s m aU r e a l y i t c u m U u ) 是人类泌尿生殖道中支原体感染的主要病原体之一，能引起典型或不典型的尿道炎等疾病的临床症状，且具有性传播性。为使病人得到及时防治，寻找快速、简便、特异性和敏感性高的检测支原体方法十分必要。传统的“二步法”即取样后先接种液体培养基，再用其阳性培养物接种到固体培养基上，观察是否有支原体特征性油煎蛋样集落生成再确定诊断。但此过程比较繁琐，尤其在固
2、体培养基上的支原体集落，若不是熟练的技术人员在显微镜下较难观察确切。聚合酶链反应( P C R ) 法虽较快速、准确，但在多数情况下需集中多量标本去完成操作。本研究共计采集性传播疾病( S T D )患者尿道( 宫颈) 分泌物标本6 1 7 份，经接种液体、固体培养基以及用同一标本作套式P C ( N e s t e dP C R ) 检测，对3 种不同来源的U u 液体培养基( 高效培养基和上海培养基甲、乙)的U u 阳性率及其生长速度作了平行比较，以及对U u 液体、固体培养基的检测和高效液体培暮基与套式P C R 的检测效果作了全面的评价。实验结果表明，高效u u 液体培养基优于其他2
3、种液体培养基，经统计学处理表明，显示有非常显著性差异( P O 0 5 ) ，提示液体培养基检测支原体可以替代其他方法检测。但以上实验中也表明，液体培养基中的质量是检测中的关键。优质的液体培养基具有简易、快捷、价廉、培养基易保存以及实验稳定性好等优点，适宜于广大基层单位使用。本研究对支原体的临床检测工作有重要的实践意义。荚键词解脲脲原体；聚合酶链反应；支原体培养淋病奈瑟菌抗生素耐药遗传学研究糜祖煌黄瑞萍郑亚芬摘要目的：探讨淋菌临床分离株抗生素耐药遗传学背景。方法：对分离自常州地区的4 2 株淋菌进行青霉素、四环素、环丙涉星、大观霉素纸片法药敏试验以及相关耐药基因T E M 一1 、p e n
4、A 、t e t M 、g y r A 、1 6 S r R N A 基因检测分析。结果：一、青霉素耐药状况：表型：耐药2 9 株( 6 9 O 纠、中介1 3 株( 3 1 0 引，青霉素不敏感率1 0 0 。基因型：3 l 株检出T E M基因( 7 3 8 ) ，经测序均为T E M - 1 型，与周伟琳等从大肠埃希菌中检出的T E M 一1 序列完全一致“。另5 例青霉素耐药但T E M 基因阴性，对其p e n A 基因测序发现与B r a n n i g a n 等报道的青霉素敏感株p e n A 序列相比均存在第3 4 5 位氨基酸密码子C G A 插入，而与他报道的青霉素耐药株
5、序列( 美国国立生物信息中心登录号分别为X 5 4 0 2 1 、X 5 4 0 2 2 ) 完全相同。两者合计作者单位：2 1 4 0 2 6 无锝无锝市克鹰遗传技术蹴所( 麋祖煌) ；常州市妇幼撂健院( 黄瑞萍，郏亚芬4 6 6 8 5 7 ( 3 1 + 5 4 2 ) 。二、四环素耐药状况：表型：耐药2 7 株( 6 4 3 ) 、中介6 株( 1 4 3 ) ，敏感9 株( 2 1 4 ) ，四环素不敏感率7 8 6 。基固型：2 2 株检出t e t M 基因( 5 2 4 9 ) 。三、环丙沙星耐药状况：表型：耐药3 9 株( 9 2 9 ) 、中介3 株( Y 1 ) ，环两沙
6、星不敏感率1 0 0 。基因型：g y r A 基因测得序列与D e g u c h i 等报道环丙沙星敏感的野生型淋菌标准株( A T C C l 9 4 2 4 ) 序列( 美国国立生物信息中心登录号D 3 2 2 5 2 ) 相比，4 2 株均存在第9 1 位和第9 5 位氨基酸密码子突变，突变率1 0 0 。突变形式由T C C G A C ( 第9 1 位第9 5 位) 转变为T T C G G C ( 2 5 株，5 9 5 ) ，T T c G C C ( 1 3 株，3 1 0 茗) 、T T C A A C ( 4 株，9 5 ) 3 种。四、大观霉素耐药状况：表型：耐药1
7、株( 2 4 ) ，敏感4 1 株( 9 7 6 ) ，不敏感率2 4 基因型：4 2株1 6 S r R N A 基因测得序列与R o s s a n 等报道的淋菌标准株( N C T C 8 3 7 5 ) 序列( 美国国立生物信息中心登录号X 0 7 7 1 4 ) 相比均没有发现突变存在。结论青霉素、四环素、环丙沙星的耐药相关基因检测提供了淋菌高耐药的遗传学证据。表型与遗传学均支持大观霉素是淋菌感染治疗的有效药物。淋病奈瑟菌( 淋菌) 临床分离株的青霉素、四环素、环丙沙星耐药率逐年上升，仅大观霉素的耐药率仍在较低水平”。1 。多年来，我国淋菌临床分离株耐药的遗传学背景研究侧重于细菌的质
8、粒谱分析”2 ，而耐药相关基因的直接研究较少甚至缺如。为深入了解淋菌临床分离株的生物学特性和指导临床用药，我们对分离自常州地区的4 2 株淋菌进行了与青霉素耐药相关的8 内酰胺酶T E M 基因、青霉素结合蛋白2 编码序列p e n A 基因、与四环素耐药相关的核糖体保护蛋白编码序列t e t M 基因、与环丙沙星耐药相关的D N A 回旋酶A 亚单位编码序列g y r A 基因、与大观霉素耐药相关的1 6 S r R N A 基因等5 种主要耐药基因检测与分析，现报告如下。1 材料与方法1 1 材井4 2 株淋菌均为2 0 0 1 年8 月至2 0 0 2 年2 月分离自常州地区淋病患者病灶
9、部。4 2 株菌均经形态学检奁、氧化酶试验、糖发酵试验和淋菌种特异c p p B 基因P C R 检测证实。青霉素、四环素、环丙沙星和大观霉素敏感试验采用纸片扩散法，并按美国临床实验室标准化委员会( N C C L S ) 标准操作与判读结果。1 2 方法1 2 1 研究策略T E M 基因、t e t M 基因为质粒介导基因，对临床分离株进行P C R 检测，阳性表示已获得该基因。但鉴于T E M 基因已有不同亚型，为探讨琳菌是否存在新型别，因此本文对T E MP C R 阳性产物再进行D N A 序列测定；p e n A 基因、g y r A 基因、1 6 S r R N A 基因为染色体
10、介导基因。基因突变多数因点突变所致，故采用P C R 扩增产物直接D N A 序列测定。测得D N A 序列与美国国立生物信息中心核酸库( w w w n c b i n l m n i h g o v u n c l e o t i d e ) 已登录的序列进行比对分析。1 2 2 引物序列从美国国立生物信息中心核酸库中检索细菌质粒介导的T E M 和t e t M 基因序列以及淋菌的p e n A 、g r y A 、1 6 S r R N A 基因序列，自行设计P C R 引物，序列见表1 。1 2 3 优化后的P C R 扩增体系正向和反向引物各0 5 斗m o F L ，d N T
11、P s 各2 0 0 卜m o F L ，K C l1 0 陆m o l L ，( N t - h ) 2 S O , 8 m m o l L ，M g c k2 m m o l L ，T r i s H C l ( D H 9 0 ) 1 0 m m o l L ，N P 柚0 5 , T a qD N A 聚合酶1 u 。全部反应体积2 0 斗1 ，其中模 板液5 I 。T E M 基因P C R 热循环按9 3 预变性3 r a i n ，然后9 3 6 0 8 ，5 5 6 0 7 2 1 2 0 s 共3 5 周期。p e n A 、t e r m 、g y r A 、1 6 S r
12、 R N A 基因P C R 热循环按9 3 6 C 预变性3 m i n ，然后9 3 6 C 3 0 s - - + 5 5 。C 3 0 s - - - 7 2 6 C 6 0 s共3 5 周期。- 4 6 7 表1P C R 引物序列靶基因引物序列( 5 一+ 3( 正向) A T A ，A A A 仰C( 反向) G A C ，A G T T A C( 正向) C C G ，T A A ，C C G( 反向) T G C ，A T A ，A T G( 正向) G T G ，T c A ，C G A( 反向) G C T T I C ，T A T ( 正向) G T A c T G ，
13、T A C( 反向) C G A ，G C C ，G T I “( 正向) C T T ，A C C ，T G G( 反向) C G A ，T r A C T A眦A A GC A A T G CA T A T G AC C C C G C A C T mC T c C A A G C G A 他G A C G A GT ( c ，T ) T C C G A 订A C G A A A +刀4 A T CAT C G 从C 十A C A T C CC C G A A +C A A C A CC A C G A $C A G TT G A C A T c T G +C C G A C注：+ 表示并
14、且为D N A 测序B I 物1 2 4D N A 测序为双脱氧末端终止法，在A B l 3 7 7 型测序仪上进行。 2 结果2 1 青霉素耐药状况表型：耐药2 9 株( 6 9 O ) 、中介1 3 株( 3 1 O ) ，青霉素不敏感率1 0 0 。基因型：3 1 株检出T E M基因( 7 3 8 ) ，经测序均为T E M 一1 型，与周伟琳等从大肠埃希菌中检出的T E M l 序列完全一致”。图1 为T E M 基因测序图谱；另5 例青霉素耐药但T E M 基因阴性，对其p e n A 基因测序发现与B r a n n i g a n等报道的青霉素敏感株p e n A 序列相比均存
15、在第3 4 5 位氨基酸密码子C G A 插入，而与他报道的青霉素耐药株序列( 美国国立生物信息中- t L “ 登录号分别为X 5 4 0 2 1 、X 5 4 0 2 2 ) 完全相同。图2 为p e n A 基园测序图谱。两者合计8 5 7 ( 3 1 + 5 4 2 ) 。2 2 四环素耐药状况表型：耐药2 7 株( 矾3 ) 、中介6 株( 1 4 3 ) 敏感9 株( 2 1 4 ) ，四环素不敏感率7 8 6 。基因型：2 2 株检出t e t M 基因( 5 2 4 ) ，图3 为t e t M 基因P C R 电泳图。2 3 环丙沙星耐药状况表型：耐药3 9 株( 9 2 9
16、 ) 、中介3 株( 7 1 ) ，环丙沙星不敏感率1 0 0 。基因型：g y r A 基因测得序列与D e g u c h i 等报道环丙沙星敏感的野生型淋菌标准株( A T C C l 9 4 2 4 ) 序列( 美国国立生物信息中心登录号D 3 2 2 5 2 ) 相比，4 2 株均存在第9 l 位和第9 5 位氪基酸密码子突变，突变率1 0 0 。突变形式由T C C G A C ( 第9 1 位磨羁9 5 位) 转变为T r c G G C ( 2 5 株，5 9 5 ) ，T Y C G C C ( 1 3 株，3 1 O ) 、 r r c I K A C( 4 株，9 5 ) 3 种。图4 为3 种g y r A 基因突变形式的测序图。2 4 大观霉素耐药状况表型：耐药1
