《禽流感病毒ELISA快速检测试剂盒的研制及其重组核蛋白粘膜免疫研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《禽流感病毒ELISA快速检测试剂盒的研制及其重组核蛋白粘膜免疫研究（121页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中农业大学博士学位论文禽流感病毒ELISA快速检测试剂盒的研制及其重组核蛋白粘膜免 疫研究姓名：肖运才申请学位级别：博士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：毕丁仁;熊远著20050501兰主壅兰竺查兰竖主兰垡堡塞堂垩垄论文摘要禽流感( 似) 是由A 型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。自1 8 7 8 年意大利首先发现至今，世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆发和流行，导致禽类的大量死亡和生产性能的急剧下降，造成了巨大的经济损失。目前，高致病性禽流感( H P A I )是国际兽疫局规定的A 类动物传染病。近年来，禽流感的发生与流行，在我国已造成了巨大的经济损失和严重的社会影响，尤其是香港1
2、9 9 7 年和东南亚2 0 0 3 - 2 0 0 4 年出现的禽流感病毒( A r V ) 直接感染并致死人的事件，已引了世人的震惊和关注。其防制已直接关系到我国养禽业的持续稳定发展和人民的身体健康。本研究主要是建立一种快速的检测禽流感病毒抗原的E L I S A 方法，弥补其它检测方法的不足，为该病的早期诊断提供可靠依据和技术保证；另外，由于禽流感病毒亚型之多，不同亚型之间无交叉保护作用，给该病的防制带来了极大的困难，鉴于此，本研究试图利用霍乱毒素B 亚基( C h o l e r at o x i nBs u b u n i t , C T B ) 强有力的粘膜免疫佐剂作用，将禽流感病
3、毒型特异性N P 基因的表达产物与C T B 混合或与C T B 融合表达后，制成疫苗通过鼻腔粘膜免疫鸡，以期提高鸡体鼻腔、气管粘膜表面s I g A 的含量，从而达到预防和控制禽流感的目的。主要研究工作和结果如下：1 鸡抗A I V 、兔抗A I V 和山羊抗兔I g G 高免血清的制备及山羊抗兔I g G 的H R P 标记将H 9 N 2 亚型的A I V 经争1 1 目龄鸡胚传代后，收获鸡胚尿囊液，经3 0 ，0 0 0 r i m离心l h 后，A 沉淀用原尿囊液1 3 0 倍体积的0 0 1 m o l L ，p H 7 2 的P B S 重悬，所 得悬液与福氏佐剂乳化后免疫鸡和兔
4、，得到鸡抗A I V 和兔抗A I V 的高免血清，其琼扩效价均达到l ：6 4 ；同时，以纯化的兔I g G 免疫山羊，将获得的山羊抗兔I g G 高免血清( 1 ：6 4 ) 纯化后，经辣根过氧化物酶( H R P ) 标记山羊抗兔I g G ，制备出特异性强、免疫学活性和催化活性高的山羊抗兔I g G - H R P ，且工作浓度高达1 ：4 0 0 0 ，为禽流感的夹心E L I S A 诊断方法的建立奠定了坚实的物质基础。2 检测禽流感病毒的酶联免疫吸附试验( E L I S A ) 方法的建立以纯化的鸡抗A I VI g G 为包被抗体，兔抗A I VI g G 为第二抗体，通过E
5、 L I S A 反应条件的优化选择，建立了检测A I V 抗原的夹心E U S A 法。结果表明，鸡抗A I V I 空G的最佳包被浓度为l g g m L ，兔抗A I V 瑭G 的最适工作浓度为5 e d m L ；对已知的阳性样品，用夹心E L I S A 法测得的病毒滴度比血球凝集滴度高1 6 倍以上，且能检出其它亚型的禽流感病毒；与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡痘病毒、马立克氏病病毒等无交叉反应，说明该方法有很高的特异性和敏感性。对1 4 个鸡场送检的患有呼吸道疾病或有腹膜炎、眼炎、产蛋下降、怀疑为禽流感感染的病鸡进行了检
6、测，结果有7 个鸡场为阳性。禽流感病毒E L I S A 快速检测试剂盒的研0 搜其重组核蛋白粘膜袋壅研究3 禽流感病毒夹心E L I S A 诊断试剂盒的研制与应用将本研究建立的禽流感病毒( A I v ) 夹心E L I S A 快速检测方法组装成诊断试剂盒。试剂盒由1 1 l 号试剂、一块E L I S A 板和一份漉明书组成。对试剂盒内各组份进行了特异性、敏感性、重复性及保存期的测定。结果表明，试剂盒在1 0 。C 下能保存6 个月，而且特异性强、敏感性高、重复性好，操作简单、方便，能快速、准确地检测出样品中是否带有禽流感病毒抗原。迄今为止已在湖北、安徽、河南等地共检测样品1 2 1
7、7 份，并从阳性样品中分离到多株不同亚型的A I V ，其中包括鸡的H 5 、H 9 亚型和犬雁鹅的H 5 亚型。4 禽流感病毒核蛋白( N P ) 基因与霍乱毒素B 亚单位( a f B ) 基因的融合表达研究从p U C T l 质粒中扩增C T B 基因，并将C T B 基因克隆在融合性原核表达载体p G E X K G 的G S T 编码区下游，构建了表达C T B 的表达载体p G E X K G C T B ；接着 将A W 的N P 基因克隆至C T B 下游，构建了表达C T B N P 融合蛋白的表达载体p G E X - K G C N 。将p G E X K G C T
8、B 和p G E X - K G C N 质粒分别转化至大肠杆菌B L 2 1 ( c o d o np l u s ) 进行表达，S D S P A G E 检测表明，融合蛋白G S T - C T B 和G S T - C T B - N P 成功表达，分子量大小分别约为3 8 0 k D 和9 4 0 k D ，与预期的分子量大小一致。W e s t e r n b l o t 分析表明，融合蛋白G S T - C T B N P 中的N P 蛋白具有良好的生物学活性。5 禽流感病毒重组核蛋白粘膜免疫研究将4 5 只1 5 日龄小鸡随机分成5 组，每组9 只，分别用重组N P 蛋白、N
9、P + C T B混合蛋白、C T B - N P 融合蛋白、C T B 蛋白免疫鸡，同时设空白对照组。各组鸡均免疫3 次，每次间隔1 0 d ，在每次免疫前和最后一次免疫1 0 d 后，采集血清、鼻腔洗液、气管洗液、肠洗液等样品，用E L I S A 法检测血清中的I g G N P 、I g A - N P 以及鼻腔洗液、气管洗液、肠洗液各样品中的s l g A N P 。结果发现，血清中均能产生较高水平的I g G - N P 抗体，但I g A - N P 抗体水平较低：免疫后2 0 和3 0 d ，在鼻洗液、气管洗液、肠洗液样品中，C T B + N P 组和C T B N P 组的
10、s f g A N P 抗体水平与N P 组比较，所测得的O D 值差异显著( p C T B + N P 组 N P 组，且两两差异显著( p O 0 5 ) ，而两者均与N P 组差异显著( p C T B + N Pg r o u p N Pg r o u p ) ，a n dt h ed i f f e r e n c ew e r es i g n i f i c a n t 诚t 1 1e a c ho t h e r ( p 0 0 5 ) b e t w e e nC T B N Pg r o u pa n dC T B + N Pg r o u p ，b u tt h e r
11、 e W a ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) b e t w e e nt h et w og r o u p sa n dN Pg r o u p I nc o n c l u s i o n ， w h e nm i x e dw i t ho rf u s e de x p r e s s i o np r o d u c to fr e c o m b i n a n tN P , C T l 3w a sac a n d i d a t ea d j u v a n tf o re n h a n c
12、 i n gm u c o s a li m m u n i z a t i o no fr e c o m b i n a n tn u c l e o p r o t e i no f A I V K e yw o r d s ：A v i a ni n f l u e n z av i r u s ( A I V ) ，E n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( E L I S A ) ，D i a g n o s e sk i t ，N u c l e o p r o t e i n ( N P ) ，C
13、h o l e r at o x i nBs u b u n i t ( C T B ) ，M u e o s a li m m u n i z a t i o nV禽流感病毒E L I S A 快速检测试剂盒的研制及其重组核蛋白粘膜免疫研究英文缩略词表A b b r e v i a t i o n _-，_-，-_一缩写英文名称中文名称v 1华中农业大学博士学位论文肖运才I T U t i t M W M D PN L S N C R N I TN E P1 1 m O I E O DO n O R FO s p A 队G E P B S P T P E Gr m i nr NR N a s
14、 e R N PR T P C R R ES D S D SS e c S K L S N T ET E 匝D 啊旧 Ugl a L p mX g a lM i n u t en n nM o l e c l _ t L a rw e i g h t分子量m u r a m y ld e p e p f i d e胞壁酰二肽 N u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l核定位信号区N o n c o d i n gr e g i o n非编码区n e u r a m i n i d a s ei n h i b i t o rt e s t神经
15、氨酸酶抑制试验N u c l e a re x p o r tp r o t e i n核运输蛋白 n a n o m e t e r纳米 O f f i c eI n t e r n a t i o n a ld e se p i z o o t i e s国际兽疫局O p t i c a ld e n s 埘光密度O r i g i no f r e p l i c a t i o n复制起始区O p e nr e a d i n gf r a m e开放阅读框O u t e rs u r f a c ep r o t e i nA体外表蛋白AP o l y a c r y l a m i
16、 d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳P h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液p e r t u s i st o x i n百日咳毒素P o l y e t h y e n eg l y c o l聚乙二醇R o t a t i o no e a “ m i n u t e每m i n 转数I e c o m b i n a a tn u c l e o c a p s i dD r o t e i a重组核衣壳蛋白R i b o n u c l e a s e核糖核酸酶R i b o n u c l e o D r o t e i n核糖核蛋白R e v e r s eT r a n s c
