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1、 江苏大硕士学位题目：作者姓名：l I I II I II III I II I II III II Y 2 0 9 3 5 8 5江苏大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：导师签名：日期：矽I 峰切月E 1日期：沙哞I 月l IE l 关天矾一瓢r、，“、肌氟萼学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论
2、文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于( 请在以下相应方框内打“ ) ：l 、保密口，在年解密后适用本授权书。2 、不保密囱。t作：J 歌导师签名：球日期：俨J 7 年D 钿日日期：妒I 埠月c1 日江苏大学硕士学位论文摘要目的：为了探讨在中国人群中m i R 1 4 6 a 基因多态性与胃癌发生风险之间的关系。方法：本研究有1 6 8 6 例胃癌患者和1 8 9 5 例与之相匹配的非胃癌患者被列入我
3、们的研究范围。将从外周血中提取的D N A ，用T a q M a n 法对基因进行分型，采用双盲法判读基因型。采用单因素和多因素L o g i s t i c 回归分析计算比值比( o d d sr a t i o s ，O R s ) 及其相应的9 5 可信区间( c o n f i d e n c ei n t e r v a l s ，C I s ) 表示各S N P s基因型与胃癌的相对危险度，采用分层分析和多因素L o g i s t i c 回归控制混杂因素的影响。所有的统计检验均为双侧概率检验，P C 多态性，是m i R 1 4 6 a 前导序列中G ：U 碱基对和C ：U
4、碱基对的错配导致的5 1 。已经阐明，这个多态性能够导致成熟序列的低表达并最终影响乳头状甲状腺癌的易感性【I6 1 。到目前为止，已经有好几项调查研究，m i R N A 1 4 6 ar S 2 9 1 0 1 6 4 多态性和好几个癌症之间的关烈7 1 引，如肺癌【1 9 】，乳房癌【2 0 1 ，肝细胞癌【2 2 2 1 ，前列腺癌【2 3 1 和胃癌【2 4 2 5 1 。然而这些研究的结果并不完全一致。r s 2 9 1 0 1 6 4 多态性的作用对胃癌易感性的影响之前已经有过研究，分别是在中国人群【2 5 1 和在同本人群中【2 4 1 ，但是这两个研究结果并不完全一致。在中国人
5、群中7江苏大学硕士学位论文r s 2 9 1 0 1 6 4 G G 基因型是胃癌的易感因素，而在日本人群中G G 则是保护因素。因此我们在中国人群中进行一个两阶段病例对照研究，这个研究由1 6 8 6 个病例及1 8 9 5 个对照组成，我们进一步探讨r S 2 9 1 0 1 6 4 多态性是否对胃癌的易感性有影响。目前国内外研究m i R N A 1 4 6 ar s 2 9 1 0 1 6 4 对胃肠道肿瘤的临床作用的研究因选择的样本不同、研究方法不同而不同。在本实验中，我们选择的样本，具有一定的代表性，选择的样本数量足够进行有意义的统计学分析。研究对象与方法一、研究对象和流行病学调查
6、1 、研究对象这项研究由南京医科大学研究机构审查委员会批准。这项研究的设计是以医院为基础的，由两个独立组的受试者被列入本研究，这些胃癌病例和对照组病例均来源于南京医科大学第二附属医院、南通市肿瘤医院、宜兴市人民医院和宜兴市肿瘤医院。所有参与研究的对象是来自中国汉族人不同的家庭和没有任何血缘关系的家族。所有患者都是最近被组织病理学检查确诊的胃癌患者，没有癌症病史，以往也没有化疗或放疗史。那些有癌症史的病人，转移癌症或非原发癌的，或以前有放疗或化疗病史的被排除。在招募中，所有的参与者获得书面知情同意书参与这项研究。2 、流行病学调查使用统一的健康状况调查表，以面对面的方式对病例和对照进行现场流行病
7、学调查。调查内容包括一般人口学特征、吸烟史、饮酒史、饮食、个人史和家族史等。吸烟者定义为每天吸烟并持续一年以上者。饮酒者定义为每周饮酒一次以上并持续一年以上者。所有调查人员均经过统一培训。8江苏大学硕士学位论文3 、调查表设计使用统一设计的健康状况调查表对研究对象进行流行病学调查，调查内容涉及四个方面共4 2 项指标：第一、人口学资料，包括性别、年龄、职业、婚否、经济收入等基本情况，以及吸烟、饮酒等生活习惯和自身消化系统疾病史等。规定每天吸烟至少一支，连续半年者定义为吸烟者，其余为非吸烟者。每周饮酒至少一杯，持续半年以上者定义为饮酒者，其余为非饮酒者；第二、病理资料，包括病变部位、肿瘤大小、肿
8、瘤组织学类型、浸润深度，有无淋巴结转移、组织器官粘连、远处转移等病理诊断：第三、临床资料，包括术前最后一次血常规、血生化、血清学检查，手术日期、手术方案，术后免疫病理、生存时间以及术前、术中、术后是否做过放化疗及具体方案等。由经过培训的流行病学专业人员对研究对象进行逐一访问调查，调查表资料使用E p i d a t a 软件录入后供分析使用。4 质量控制为确保资料的真实性，填表工作由高年资医师和研究生组成专职调查小组，并集中培训，统一填报标准。有关数据输入数据库后进行分类统计。为避免重复填报的现象，在输入计算机时剔除姓名、性别、住址、住院号和病理号( 患者入院时由医院和病案室统一编制的号码，每
9、位患者的住院号、病理号唯一) 相同的报表，再经人工复核，进一步确认。5 诊断依据5 1 临床分期根据2 0 0 2 年国际抗癌联盟( U I C C ) 第6 版T N M 分期标准，将胃癌分为五期：0 期、I 期( 包括IA 、IB2 个亚期) 、I I 期、I I I 期( 包括I l i A 、I I I B2 个亚期) 、期。5 2 组织分型9江苏大学硕士学位论文根据W H O 组织学分类标准，将胃腺癌分为乳头状、管状( 又分为高分化、中分化、低分化) 、黏液性和印戒细胞癌，并对应L a u r e n 分期将其划分为肠型和弥漫型，对应关系见表l ：表1胃腺癌W H O 组织学分类标准
10、与L a u r e n 分期对应关系删O乳头状管状高分化中分化低分化肠型印戒细胞癌黏液性弥漫型二、样本收集和基因组D N A 提取1 、样本收集采用真空非抗凝采血管采集静脉血5I I d ，静置，吸取上层血清备用，剩余血块用于D N A 提取。2 、基因组D N A 提取D N A 的提取采用酚一氯仿抽提法，具体方法如下：取1 5m l 的研磨器，加入5m l 血块，加4 5m l 溶血试剂( 约血块体积的1 3 ) ，研磨至无血块存在，移至1 5m l 离心管中，2 ，5 0 0r p m 离心1 0 m i n ；弃上清，再加l Om l 溶血试剂洗l 遍，2 ，5 0 0r p m 离
11、心1 0 m i n ，洗至无明显红色：弃上清，加lm l 溶血试剂，移至2m lE P 管中，2 ，5 0 0r p m 离心1 0 m i r a 继续弃上清，加lm l 细胞裂解液，分别加1 0ul 的蛋白酶K ( 2 0m g m 1 ) ，3 7 。C 水浴过夜；第二天在通风柜内每管加lm l ( 等体积)平衡酚，上下颠倒混匀，6 ，0 0 0r p m 离心1 0 m i n ：重复上面步骤一次：吸取上清1 0江苏大学硕士学位论文于另一个2m lE P 管中，再加等体积氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，上下颠倒混匀，6 ，0 0 0r p m离心1 0 m i r a 吸取上清1
12、5m l 于另一E P 管中，加1 0 0ul 的3 MN a A c ( 约1 1 0 ) ，轻轻混匀，再加等体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，可见白色絮状物，1 0 ，0 0 0r p m 离心5 m i r a 弃上清，加2 0 0 - 5 0 0I ll 无水乙醇，轻轻振洗，1 0 ，0 0 0r p m 离心5 m i n ，去酒精后，风干( 大约2 h ) ；加T E 约3 0 5 0ul ，2 0 。C 冰箱保存。最后使用3 7 。C 水浴溶解D N A ，取9 9u1 双重蒸馏水到O 5m lE P 管中，取1I IlD N A 到E P 管中。紫外分光光度法测定D N A 的浓
13、度( O D 2 6 0 ) 和纯度( O D 2 6 0 O D 2 8 0 ) ，稀释分装置，2 0 。C 冰箱保存备用。3 、D N A 纯度鉴定及浓度测定稀释D N A 溶液：取1uLD A N 溶液加入9 9uL 超纯水，即稀释1 0 0 倍。以超纯水调零，用紫外分光光度计分别在波长2 6 0r l i n 及2 8 0n l n 下测定吸光度A 2 6 0 、A 2 8 0 ，以分别表示提取样品的D N A 纯度和蛋白质的残留程度，以A 2 6 0 A 2 8 0 在1 6 2 0 之间为宜。根据公式计算：D N A 浓度( “g m L ) = 5 0P g m L X A 2
14、6 0 稀释倍数。4 、M G B 探针的r e aI - tim eP C R 反应4 1 主要仪器A B IP 刚S M7 9 0 0 H T 型荧光定量P C R 仪R A I N I N 手动连续移液器lO 肛Le p p e n d o r f 排枪2 5I t LG i l s o n 移液器A X Y G E N3 8 4 孑L 板F L 2 0 离心机X W 二8 0 A 旋涡混合仪超低温冰箱( 8 0o C )4o C 冰箱4 2主要试剂美国A B I 公司美国R A I N I N 公司德国e p p e n d o r f 公司法国G i l s o n 公司美国A X
15、Y G E N 公司德国e p p e n d o r f 公司上海楚定分析仪器有限公司日本三洋公司中国海尔公司江苏大学硕士学位论文T H U N D E R B I R DP r o b eq P C RM i x 、用于基因分型的引物及探针均购自南京骥骜生物技术有限公司，并按生产公司操作要求：将引物稀释为1 0 X 的工作浓度，探针稀释为2 0 X 的工作浓度。M i R 0 1 4 6 a 基因t S N P s 的引物、探针见表2 ：表2M i R - 1 4 6 a 基因t S N P s 的引物及探针4 3r e a I _ t i m eP C R 反应体系表3r e aI -
16、tim eP e R 扩增反应体系5 、实时荧光P C R 扩增并同步S N P 分型在A B IP R I S M7 9 0 0 H T 型荧光定量P C R 仪上进行S N P 分型，按生产公司提供的操作手册，依次进行：第一步，9 5 。C ，1 0m i n 使酶活化第二步，9 5 。C ，1 5S 使D N A 变性第三步，6 0 。C ，6 0S 使引物和探针退火及延伸，共5 5 个循环，用S D S 软件进行基因分型，结果示意图见图l ，蓝色和红色为两种不同1 2江苏大学硕士学位论文的纯合子，绿色为杂合子，灰色为未成功分型的样本D N A 。图2T a q m a n 方法应用于M i R - 1 4 6 a 基因S N P s 分型示意图6 、实验室质量控制采用双盲法判读基因型，由两个人同时进行，对基因型不一致的样本重新进行检测。此外，随机抽取1 0 的样本盲法重复。部分样本由于D N A 质量不佳造成不能分型的予以剔除。三、统计分析方法所有资料和实验数据经复查和
