《前列地尔对2型糖尿病大鼠脑组织IκB、NFκB、SUMOl表达的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《前列地尔对2型糖尿病大鼠脑组织IκB、NFκB、SUMOl表达的影响（35页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、前列地尔对2 型糖尿病大鼠脑组织I K B 、N F K B 、 S U M 0 1 表达的影响I n f l u e n c eo f A l p r o s t a d i lI n je c t i o nt ot h eE x p r e s s i o no fI v d 3 ，N F v , Ba n dS U M O1i nB r a i nT i s s u eo fT y p e2D i a b e t i cR a t s导二级学科：耋生匡堂论文课题起止时间：2Q ! Q 生兰旦二2Q ! ! 生! ! 旦中国医科大学( 辽宁)20 12 年5 月榧科大学研究生学位论文独创
2、性声明必本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：杰趁堑鱼竺日期：丝：垒：! r中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文
3、工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。综述”1 9在学期间科研成绩3 0致谢“31个人简介3 2饲养阶段均在中国医科大学动物部完成；将l O 只W i s t a r 雄性大鼠作为对照组( N C 组) ，1 0 只G K 大鼠作为糖尿病组( D M 组) ，1 0 只G K 大鼠作为干预组( D M + P 组) 。干预组( D M + P 组) 大鼠每日给予前列地尔2 5
4、 u gK g 尾尖静脉注射，其余两组尾尖静脉注射同等量生理盐水。实验期间所有大鼠均喂标准饲料，自由饮水，不使用胰岛素和其他降糖药。分别于第4 周处死大鼠取脑组织行免疫组化检测，观察血糖、血甘油三脂、血总胆固醇的变化及IKB 、N F -KB 和S U M 0 1 免疫组织化学染色表达。研究结果l 、D M 组、D M + P 组大鼠的血糖、血甘油三酯、血总胆固醇均高于N C 组( PO 0 5 ) ；2 、光镜下，N C 组脑细胞排列整齐，核圆形，核仁清楚，支架完整；D M 组大鼠脑组织细胞肥大疏松样改变，胶质细胞肿胀、局灶性增生，支架不完整；D M + P组脑组织细胞基本排列整齐，略呈肥大
5、疏松样改变；3 、N C 组、D M 组、D M + P 组I r , B 免疫组化结果( I r , B 阳性表达为脑组织细胞核或胞浆内呈现棕黄色颗粒) ：N C 组可见I r , B 少许阳性表达，主要分布在脑组织细胞核或胞浆内；D M 组大鼠脑组织细胞胞浆中I r , B 阳性表达较N C 组增多( P O 0 5 ) 2 2 B yt h el i g h tm i c r o s c o p y , w eo b s e r v et h a tt h eb r a i nt i s s u ec e l l so fN Cg r o u pa r r a n g eo r d e
6、r l i n e s s ，n u c l e a rr o u n da n dn u c l e o l ia r ec l e a r , s t e n t s ，c o m p l e t e ，w h i l ec e l l so f D Mg r o u pa l eh y p e r t r o p h i ca n da r r a n g ec r u m b l y ，a n dc e l l sa r el e s so r d e r l i n e s st h a nN Cg r o u pa n dr i oo b v i o u sh y p e r t
7、r o p h yi nD M + Pg r o u p 3 R e s u l t so fI r , Be x p r e s s i o nt e s t e db yi m m u n o h i st oc h e m i c a lm e t h o d ：w ec a l ls e eb r o w ng r a i n si nc e l ln u c l u so rc y t o p l a s mi ft h e r ea r eI r Be x p r e s s i o n T h e r ea r eal i t t l eI r 3 3e x p r e s s
8、i o ni nN Cg r o u p ，w h i l et h e r ea r em o r e ( P 1 6 7 m m o l L 验证G K 鼠2 型糖尿病成模。2 、取材标本及甘油三酯、血清总胆固醇测定：观察4 周后将各组大鼠禁食1 2 h ，手术当日使用4 水合氯醛腹腔注射( 1 0 m g k g l 体重) 麻醉，迅速打开胸腔，取下腔静脉血，室温下静置4 小时，3 0 0 0 r m i n 离心3 分钟，分离血清，用于7 1 5 0 型自动生化分析测定甘油三酯、胆固醇。3 、脑组织的包埋及H E 染色：( 1 ) 脑组织的包埋将各组大鼠深麻醉，经4 多聚甲醛P B S
9、 缓冲液灌注固定后，断头取脑，置于4 生理盐水中冲洗表面血迹，于冰盘上快速分离出大脑顶叶皮质，取顶叶2l l l m脑组织层面进行( 梯度乙醇7 5 乙醇4 0 m i n 、8 0 乙醇4 0 m i n 、9 0 乙醇4 0 m i n 、9 5 乙醇4 0 m i n 、1 0 0 乙醇6 0 m i n 、1 0 0 乙醇6 0 m i n ) 脱水、放入二甲苯中9 0 m i n 进行透明，放入加热的液体石蜡中侵蜡9 0 m i n ，取出后室温冷却6 0m i n ，拍成蜡块后室温保存。( 2 ) 脑组织的H E 染色取石蜡包埋的脑组织，连续冠状切片，切片厚4 u m ，置于6 0
10、 C 烤片3 0m i n 一切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯( I ) 5 m i n - c 甲苯( I I ) 5 m i n- “ 1 0 0 乙醇2 m i n - - 9 5 的乙醇l m i n 一8 0 乙醇l m i n - 一7 5 乙醇1 m i n 一蒸馏水洗2 m i n 一苏木素染色1 5 m i n ，自来水冲洗一盐酸乙醇分化3 0 s 一自来水浸泡5 m i n 一置已预热的伊红液染色l O m i n 一常规脱水，透明，封片：9 5 乙醇( I ) l m i n - - 9 5乙醇( I I ) 1 m i n 一1 0 0 乙醇( I ) 1
11、 m i n 一1 0 0 乙醇( I I ) I m i n - - - - - 甲苯石碳酸( 3 ：1 ) I m i n - - - - - 甲苯( I ) l m i n - - _ - 甲苯( I I ) l m i n 一中性树脂封固。4 、脑组织免疫组化染色过程：烤片，6 0 。C ，3 0m i n 一常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水一二甲苯I2 0 m i n 一二甲苯I I2 0 m i n - 1 0 0 酒精I1 0 m i n - 1 0 0 I Il O m i n - 9 5 5 m i n - 8 0 5 m i n - 7 0 5 m i n - * - 灭活内源
12、性过氧化物酶：3 H ：0 2 3 7 C 孵育1 0 m i n ，P B S 冲洗3 X m i n - 一抗原修复：置9l 枸橼酸缓冲液( P H 6 0 ) 中煮沸( 9 5 C ，1 5 m i n ) ，自然冷却2 0 m i n 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，P B S 冲洗3 5 m i n 一滴加正常山羊血清工作液封闭，3 7 。Cl O m i n 倒去勿洗一滴加S U M 0 1 单克隆抗鼠抗体( 1 ：2 0 0 ) 、N F _ KB 兔抗鼠抗体( 1 ：2 0 0 ) 、IKB 兔抗鼠多克隆抗体( 1 ：1 0 0 ) 一抗4 C 冰箱孵育过夜，P B S
13、 冲洗3 X 5 m i n ( 用P B S 缓冲液代替一抗作阴性对照) ；滴加生物素标记二抗( 即用型) ，3 7 C 孵育3 0 r a i n ，P B S 冲洗3 5 m i n 一滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，3 7 。C 孵育3 0 m i n ，P B S 冲洗3 5 m i n - - D A B H ：0 2 反应染色，自来水充分冲洗后苏木素复染，常规脱水，透明、干燥、封片。5 、脑组织免疫组化染色图片的分析光镜下观察染色结果，阳性表达为棕黄色，与背景同色为阴性，每组大鼠各随机选取5 张来自不同大鼠的脑组织切片，显微镜下每张切片随机选取5 个高倍镜( 4 0
14、0 ) 视野，每个视野内观察1 0 0 个细胞，统计出阳性细胞数，然后计算出每1 0 0 个细胞的阳性细胞率，不论染色强度，凡显色者均为阳性。( 三) 统计分析计量资料数据以石S 表示，正态分布组间差异用单因素方差分析( A N O V A ) ，差异有统计学意义者用N e w m a n K u e l sq 检验进行两两比较，统计学处理用S P S S l 6 0 软件，检验水准Q = 0 0 5 ，P O 0 5 )( 见表1 )表1 ，三组大鼠的随机血糖及甘油三酯、胆固醇检测结果( X S ，n = 1 0 )简称：R B G ，随4 日t l f l t 糖；T G ，甘油三酯；T
15、C ，总腰围醇。D M 组、D M + P 组与N C 组比较枣p 0 0 5( 二) 大鼠脑组织光镜观察与免疫组化l 、H E 染色光镜下观察：N C 组脑细胞核圆形，核仁清楚，细胞排列有序整齐，支架完整( 见图1 A ) ；D M组大鼠脑组织细胞肥大、空泡变性、核固缩，疏松样改变，胶质细胞肿胀、局灶性增生，支架不完整( 见图1 B ) ；D M + P 组脑组织细胞基本排列整齐，略呈肥大及疏松样改变( 见图l C ) 。2 、免疫组化方法检测脑组织IKB 、N 卜KB 、S U M O l 的表达( 以脑组织细胞核染色棕黄色为阳性表达) ：( 1 ) 可见G K 大鼠的脑组织IKB 、N F - KB 及S U M 0 1 的表达水平均明显高于正常W s i t a r 大鼠脑组织。其中：N C 组、D M 组、D M + P 组IKB 免疫组化结果( IKB 阳性表达为脑组织细胞核或胞浆内呈现棕黄色颗粒) ：N C 组可见IKB 少许阳性表达，主要分布在脑组织细胞核或胞浆内( 见图2 A ) ；D M 组较N C 组大鼠脑组织细胞胞浆中IKB 阳性表达增多( 尸 O 0 5 ) ( 见图2 B ) ，D M + P 组较D M 组脑组织细胞浆中IKB 表达减少( 尸 0 0 5 ) ( 见图2 C ) 。N C 组、D M 组、D M + P 组N F KB
