《砂梨上苹果茎痘病毒快速检测技术及其外壳蛋白基因克隆和原核表达研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《砂梨上苹果茎痘病毒快速检测技术及其外壳蛋白基因克隆和原核表达研究（52页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中农业大学硕士学位论文砂梨上苹果茎痘病毒快速检测技术及其外壳蛋白基因克隆和原 核表达研究姓名：侯雨萱申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：王国平;洪霓20050601华中农业大学硕：l ：学位论文摘要梨是我溺懿售绞果是之一，栽壤嚣3 舔酾慧产璧罄屡毯赛纂一，毽其擎产季瑟品质都遮低于世界先进阐家的水平，严熏影响了我国梨的出口和创汇。病毒病密是影响其产量移热质的重器因素，对梨造成了严黧戆危豢。苹襞莲瘗瘸毒( A p p l es t e r np i t t i n g v i r u s ，A S P V ) 对梨的危害就是典型的实例。A S P V 是凹陷病毒腿( F o v e a
2、v i r u s )的代袭弛，转港隐病毒，主要侵絷警果和梨，只在敏感型豹砖本上表现症状，霉见症状为死顶、内茎皮坏死、嫁接时液退、时偏上性生长等，能导致梨产量明显下降和晶质改交，严重影响羞梨业的发展。镪前，栽培无病海苗木怒解决梨上A S P V 危害的有效途径，病毒检测是培育和繁殖无病毒髓本的重要环节。另一方蕊A S P V 在苹果和梨树中的含壁极低，且苹果和梨树组织中含有大鬣酚类等物质，瘸毒的分离提纯非常困难，国内还没有能制备用于梭测A S P V 的抗体。本研究采用生物学、血清学和分子生物学三秭方法对砂槊上的A S P V 进行了快速检测方法的研究，井成功圭 熟克隆了来源于砂梨样晶6 1
3、，1 3 上A S P V 的外壳蛋白( C o a tp r o t e i n ，C P ) 蒸因，辩其进行了序歹0 溯定、藤梭表达和w e s t e r n b l o t 分析，具体研究结果如下：生物学输铡：程溢室，褥常规P A S E L I S A 租捡篷融往的1 0 个移梨样品通过汁液摩擦按种革本指示植物西方烟( N i c o t i a n ao c c i d e n t a l 妇3 7 B ) ，1 0 个样品在强方烟土郡产生不麓刘小斑赢，同时6 。l 1 3 、6 - 1 1 0 3 察4 - 2 。5 1 三个样晶产生弥黄瘫狄；通过二重芽按法嫁接木本指示植物，1
4、0 个样品在杂种楹椁( 毋r o n i av e i t c h i i ) 上普遗产生时簧发卷、疆拣矮仡、嚣开麓皮有痘簸鹃症状，在A 2 0 上翡瘢狄为时片上寿褪绿叶斑，支脉变黄。结果表明，A S P V 采用草本指示植物和木本攒示植物检测，症状鞠显，缀暴可靠。m 清学检测：采用常规的P A S E L I S A 、改进的P A S - E L I S A 和直接包被抗原E L I S A ( P T A E L I S A ) ，捻溺生物学鼗痉筠徉赫，透过将第二藏与酶拣A 虽爨器爱应后混合加入，可降低非特异反应，提高阳性样品和阴性样品的吸光度比值( P N ) ；鬻惑P A S E L
5、 l S A 与P T A E L I S A 检测麓结票一致。对撵鑫6 - 1 1 3 ，暴蘑提取缓冲滚等倍稀释研磨，结果表明稀释倍数越低，P N 值越高，检测效果越好，一般5 倍左毫弱爨P N 镶较裹，缝票较稳定。该方法安全可靠、饶速疆溺，遥台大量弹赫蕊捻测。分子生貔学检测：参照已报道静A S P V 全基园缝挟蓑酸窿歹l 设计台戏雩| 糖，戥芽接照症的杂种榀桴叶片为材料，提取d s R N A 为模板，分别对6 - 1 1 3 、4 2 - 5 1 、4 - 1 5 1 、堡! 墨些警槊茎痘瘸麟快速检测技术及其外壳虽自基阑克隆和朦棱表达研究6 - 1 - 3 5 、6 - 1 7 3 和
6、6 - 1 - 1 0 3 进行R T - P C R 扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，发现6 个样品都在3 1 6 b p 左右的位置上有特异| 黢扩增条带。另辨，采熙T C R T - P C R 梭溅在西方烟上显症的样品6 - 1 - 1 3 、4 2 5 1 、6 - 1 1 0 3 、6 - l 一7 3 、6 - 1 3 5 ，6 - 1 1 3 、4 2 ，5 1 、6 - 1 1 0 3 获得了预期的3 1 6 b p 的目标片断。6 - l 一7 3 、6 * 1 3 5 没鸯获褥髫标扩增片段。以d s R N A 为模板的R T - P C R ，d s R N A 稳定不易
7、降解，能照有效地检测病毒；T C - R T - P C R 以篱壁的非特异性吸附捎捉病毒岩立子，不闲提取核酸，操作简单，同时也减少了苯酚和氯仿封环境的污染和人体的伤害。这两种检测方法特辫性强、敏感性高，检测结槊稳定、可靠，尤其适合大量样品检测。A S P VC P 基因壳隆和序剃测定：参照已撤道的A S P V 全基因组核苷酸序列设计合成引物，以来源于6 1 1 3 的A S P V 的d s R N A 为模板，采用R T - P C R 扩增其C P基蠢，获得特辫往扩增条带1 3 2 8 b p ，并对扩增产物纯纯、T 克隧、序刭测定和分褫。分析表明其核箭酸序列与国外在G e n B a
8、 l l k 上擞录的1 0 个分离株有较高的同源性，溺潺率为8 2 8 8 。其中与分离袜S T l 3 2 阖深率最高达8 8 ，与分离拣G N K v n 搀4和N 1 同源性最低为8 2 。氨熬酸序列与1 0 个分离株也有很高的同源性，同源率为9 3 一9 8 ，与分离椽G N K v 珏，3 4 豹嚣源率最低为筠，箕稳筠这至l9 6 以上。与上述分离株作序列系统进化树分析，发现同分离株G N I I 4 5 亲缘关系最近。A S P VC P 蓥嚣暴孩表达懿w e s t e r n - b l o t 分孝厅：T 宠隆获褥粒嚣翡蒸霞与表达载体p E T 2 8 c 连接得到原核表达
9、顾粒p E T 2 8 c c P ，p E T 2 8 c C P 在大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 )孛表这，大小雒k D a ，表达蛋囊经S D S P A G E 邀沫帮w e s t e r n b l o t 分拳厅表羁该瘸毒的c P 在大肠杆菌B 比1 ( D E 3 忡正确袭达，且具有免疫原性。以上结暴黄次建立了羲鏊移黎上A S P V 熟抉速硷溺按末，并残功巍窿蟊爨核表达来源于6 1 。1 3 的A S P VC P 撼因，这也是我豳A S P VC P 基因克隆和原核表达的首次掇：i 莲。A S P V P 基波在大嬲抒蔻B L 2 1 ( D 鬟3 ) 中正确表达
10、，不仅巍剿釜A S P V 撬盔清提供了一条有效的途径，而且为该熬因的真核表达擞功能研究和利用该基因进行撬痪旁转奠定了基础。关键谰：砂梨；A S P V ；指示枣嶷甥；血浅学；分子生貔学：捡溅；C P ：魇核表达堂主查些奎堂堡圭堂燕笙茎A b s t r a c tP e a ri st h et r a d i t i o n a lf r u i ti nC h i n aa n di t sp l a n t i n ga r e aa n dt o t a ly i e l dr a n kt h ef i r s ti n 氇ew o r l d B u tt h ep o o ra
11、 v e r a g ey i e l da n dq u a l i t yo fp e a r ss e r i o u s l ya f f e c t e dt h eC h i n e s ep e a r se x p o r tb u s i n e s s V i r u sd i s e a s ei so n eo ft h ei m p o r t a n tf a c t o rw h i c ha f f e c t st h ey i e l da n dt h eq u a l i t ya n dl e a dt ot h es e r i o u sr e d
12、 u c t i o no fo u t p u ti np e a r s A p p l es t e mp i t t i n gv i r u s ( A S P V ) i so n eo ft h r e em o s ti m p o r t a n tl a t e n tv i r u s e si nC y r u sp y r i f o l i aa n di st h er e p r e s e n t a t i v es p e c i eo fF o v e a v i r u s ，I ts p e c i f i c l yi n f e c t sa p
13、 p l ea n dp e a r , c a u s i n gp e a kd i e i n g ，i n n e rt e g u m e n tn e c r o t i c ，g r a f td e c l i n i n g ，l e a fe p i n a s t yi nt h es e n s i t i v er o o t s t o c k sw h i c hr e d u c et h ey i e l da n dt h eq u a l i t yo fp e a r , i n f l u e n c i n gs e r i o u s l yt h
14、 ed e v e l o p m e n to fp e a ri n d u s t r y I np r e s e n t ，t h ec u l t i v a t i o no fv i r u s - f r e ev a r i e t i e si st h ee f f e c t i v ew a yt or e d u c e 氇el o s s e sc a u s e db yA S P VT h ev i r u sd e t e c t i o ni st h ec r i t i c a ls t e pi nt h ec u l t i v a t i o
15、na n dp r o p a g a t i o no fv i r u s f r e ev a r i e t i e s H o w e v e r , i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fA S P Vi sv e r yd i f f i c u l tb e c a u s eA S P Vi sl i t t t e ，a n dh y d r o x y b e n z e n e si sa b u n d a n ti na p p l ea n dp e a rt r e et i s s u e s ，T h
16、 ea n t i b o d yf o rd e t c c l i n gA S P Vh a sn o tb e e no b t a i n e di nC h i n aS Of a r I no r d e rt os e tu pr a p i dd e t e c t i o nt e c h n i q u e so fA S P V , t h r e em e t h o d si n c l u d i n gb i o l o g y , s e r o l o g ya n dm o l e c u l a rb i o l o g yw e r eu s e di no u rs t u d i e s + T h ec o a tp r o t e i ng e n eo fA S P Vi nt h es a m p l e6 - 1 一】- 3w a sc l o n e d ，a n di t sc o m p l e t en u
