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1、RT-PCR 原理与实验操作步骤原理与实验操作步骤一、知识背景一、知识背景 ：1、基因表达：DNA RNA Protein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104 个丝心蛋白 mRNA（每个mRNA 存活 4d，可以合成 105 个丝心蛋白） 共合成 109 个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR 技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶 链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸 存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶 的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：A、变性：通过加热使
2、 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C、延伸：在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2存在下，退火引物沿 5 3 方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。3、逆转录酶和 RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链；2、Rnase 水解活性：水解 RNANA 杂合体中的 RNA；3、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以第一条 DNA
3、链为模板合成互补的双链 cDNA.二、二、RT-PCR 的准备的准备 ：1、引物的设计及其原则：1）引物的特异性决定 PCR 反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括a、引物长度:一般为 1530bp ，引物太短会影响 PCR 的特异性，引物太长 PCR 的最适延伸温度会超过 Taq 酶的最适温度，
4、也影响反应的特异性。b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3 个以上的单一碱基。GC 含量（Tm 值）：4060，PCR 扩增的复性温度一般是较低 Tm 值减去 510 度。c、 3端要求：3端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是 A 时错配的引发效率最低，G、C 居中间，因此引物的 3端最好选用A、G、C 而尽可能避免连续出现两个以上的 T。d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于 4 个连续碱基互补，3端不应超过
5、2 个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8 个的互补碱基存在。g、5端无严格限制：5末端碱基可以游离，但最好是 G 或 C，使 PCR 产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如 Primer5.0，Oligo6.0 等对于这些条件都可以自行设置。2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管 、枪头、EP 管之类事先都需经过0.1%DEPC 水浸泡处理，除去 RNA 酶，防止操作过程中 RNA 降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活 DEPC）。3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经
6、 DEPC 处理并高压的水。三、RNA 的提取方法：RTPCR 中从细胞分离的 RNA 的质量至关重要，包括 RNA 的纯度和完整性。RNA 分离的最关键因素是尽量减少 RNA 酶的污染。但 RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性 RNA 酶外，环境中也存在大量 RNA 酶。因此在提取 RNA 时，应尽量创造一个无RNA 酶的环境，包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制内源性 RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶，通过 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性 RNA 酶。实验操作步骤实验操作步骤一、实验器具与材料
7、：1、移液枪：1ml、200l、20l、10l、2l2、吸头 ：1ml、200l、20l3、匀浆管：5ml4、吸头 台：放置 1ml 吸头的一个，放置 20l 吸头的一个5、EP 管：1.5ml、0.2ml、100l6、试剂瓶：2 个 60ml 的棕色试剂瓶（广口，带盖）1 个 125ml 的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒 ：50ml、250ml、500ml8、容量瓶 ：250ml、500ml、1000ml9、试管 架：5ml、1.5ml、20l10、盐水瓶：250ml、500ml 各 2 个备用，一个装无水乙醇，另一个装 DEPC 水11、铝制饭盒：4 个12、塑料小饭盒：1 个13、大瓷
8、缸：2 个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2 卷16、三角烧瓶：带盖，稍大反转录反转录-聚合酶链反应（聚合酶链反应（RT-PCR）方法中常见的污染问题及对策）方法中常见的污染问题及对策反转录-聚合酶 链反应（RT-PCR）是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定，所以近年来 RT-PCR 技术被广泛应用于人和动物的多种传染病早期诊断。笔者一直从事实验室动物疫病检测工作，现就应用 RT-PCR 实验方法过程中出现的一些常见污染问题做如下论述，仅共同行参考和探讨。
9、RT-PCR 实验有三步：提取 RNA、反转录（RT）、PCR 扩增及扩增产物分析，在这一过程中，最令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性。污染原因主要有以下几个方面：1、样品间的交叉污染收集样品的容器最好使用一次性的，如重复使用，应在使用前应于180的高温下干烤 6 小时或更长时间；样品存放时要密封严实，以防外溢造成相互间的交叉污染；样品在提取过程中离心管 及吸样枪头最好使用一次性的，以免不同实验样品间相互污染；由于吸样枪污染会导致样品间的污染，也是一个值得注意的问题，由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取时要十分小心，吸时要慢，吸取尽量
10、一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染；同时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管 ，开盖时也容易造成气溶胶污染。若产生气溶胶较多，会造成环境污染，不仅会导致实验失败，而且也会损害操作人员身体健康，因此每次实验完毕都要及时清理实验台面，用 0.5%次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。2、RT-PCR 本身使用的试剂污染在试剂配制过程中，由于加样枪、容器及其它溶液被污染。因此所有试剂都应尽量小量分装，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外 RT-PCR 试剂 应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进行台面消毒和紫外线照射消毒。3、扩增产物的污染这是实验中最常见的问题，极微量的扩增
11、产物污染就可造成假阳性，每次实验完后，扩增产物都要及时密封后处理。在做 RT-PCR 实验时，一般都应设阳性对照，操作不慎，污染可能性很大，因而当某一 RT-PCR 试剂 经自己使用稳定，检验人员经验丰富心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照，或间隔性设阳性对照，以减少污染机会。4、操作人员污染只要存在少量的 RNA 酶就会引起 RNA 的降解，从而影响结果的准确性，RNA 酶可存在操作人员手汗、唾液中，也可灰尘中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成实验失败，因此操作人员应戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换，。设置 PCR 操作专用实验室，所用实验用具应为专用，并合理
12、分隔实验室，将样品的提取、配制 RT-PCR 反应液、PCR 循环扩增等步骤分室进行，实验前应将实验室及实验人员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的 DNA 或 RNA。任一种科学的实验方法都有其自身完善和发展的过程，RT-PCR 方法也不例外，在检测质量能保证的情况下，若能简化样品提取步骤或缩短其时间，减少扩增循环次数，都能对防止污染有利。总之，RT-PCR 不管从特异性方面还是从灵敏性方面讲都具有难以匹敌的优势，结果的可靠性和可信性应该是最好的，是较具权威性的检测方法，我们期待着它能尽快地自身完善和发展。RT-PCR 步骤步骤总总 RNA 提取提取1. 取 200mg 组织，放到 1.5m
13、l EP 管中，加入 1ml Trizol 剪碎。2. 震荡 30s。3. 加 0.2ml 氯仿，剧烈摇动 30s，室温 3min。4. 12000g，4 离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一 EP 管中（约 0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20，30min。7. 12000g，4 离心，10min。在管底部可见微量 RNA 沉淀8. 弃上清，加 75%乙醇 1ml，振荡。9. 7500g，4 离心，10min。10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥 5-10min。11. 沉淀溶于 20l DEPC 水，取 1l 加入 79l DEPC 水测 OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，-70保存。逆转录合成逆转录合成 cDNA反应体系如下混匀快速离心一次反应条件如下-20 冰箱冻存PCR 反应反应混匀快速离心一次PCR 产物-20冰箱保存取 PCR 产物 8l 加 5Loading Buffer 2l 2%琼脂糖凝胶电泳 120V100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果
