疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索

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1、一 一 臼 一一一 竺0_;摘 要 本文对疏水层析及其相关技术辅助蛋白质重新折叠复性进行了探索。 实验发现， 直接采用蛋白 质纯化用的商业疏水作用介质不能有效地辅助蛋白 质正确折叠， 导致较低的活性收率和不可逆吸附; 然而在层析流动相中加入甘油则能够克服上述问 题， 促进了蛋白 质的正确折叠。 由此， 本文建立了甘油介导下疏水层析辅助蛋白 质 折叠复 性技术。 应 用此技术 复 性溶菌 酶， 蛋白 终浓 度为1 .2 m g / m l , 蛋白 回收率达到8 5 % ，总活性回收率为8 6 .3 %，产物达到天然比活性: 应用此技术复性重组a - 2 b 千 扰素， 蛋白 终 浓 度 达到1

2、 . 1 m g / m l , 蛋白 回 收 率 达 到8 4 ， 比 活为3 ,O x 1 0 $ 1 U / m g ;而采用传统的稀释法，复性溶菌酶的蛋白 回收率仅为3 2 : 6%，复性重组a - 2 b 于扰素的 蛋白 回 收 率 为5 9 % ，比 活 只 有0 .4 x 1 护 l U / m g o 为克服现有商业疏水作用介质的不足，本文采用固定化技术，制备了聚乙二醇( P E G ) 介质、 聚合环 糊精 Q - C D ) 介 质和T r i t o n X - 1 0 0 介质， 分别 对重组 金黄 色葡萄球菌肤链翻译延长因子( E F - G ) 和重组绿色荧光蛋白(

3、 G F P ) 包涵体蛋白 质进行了折叠复性。采用固定化聚乙二醇 ( P E G ) 介质辅助E F - G复性，解决了稀释复性产生沉淀 和 错误折叠的 难 题， 得到了 浓 度为5 劝u g / m l 的 产物， 蛋白 回 收率为8 8 % ， 正 确折叠率达到8 0 %。而稀释复性的蛋白回收率为4 9 %，正确折叠率含量只有4 6 %. 采 用聚 合 环 糊 精 ( R - C D ) 介 质， 与 表 面 活性 剂T r it o n X - 1 0 0 相结 合 复 性E F - G o 将T r i t o n X - 1 0 。与 E F - G结合形成复合物，通过聚合环糊精(

4、 (3 - C D 介质柱吸附T r it o n X - 1 0 0 ， 释放出E F - G 进行折 叠， 在复 性 产物蛋白 浓度5 3 0 u g / m l 下， 蛋白 回 收率为9 8 .7 %，正确折叠含量达到1 0 0 % 。 采用空白 介质、固定化p - C D单 体介质和直接穿过方法均不能有效折叠E F - G . 将T r i t o n X - 1 0 0 作为固 定 相， 采用p - C D为 流动 相是本文发展的 又一复 性系 统。将G F P 包涵体变性蛋白 质吸附到固定化T r i t o n X - 1 0 0 柱上后用p - C D洗脱，复性产物蛋白 浓度为

5、3 8 0 u g / m l ， 蛋白 回 收率为6 4 ， 正 确 折叠产 物 含量提高 到4 6 % 。 采用 稀释复性得到的正确折叠产物含量仅为4 . 7 % .关键词:蛋白 质复性， 疏水作用， 甘油，聚乙二醇，聚合环糊精，T r i t o n X - 1 0 0摘 要P r o t e i n r e f o l d i n g a s s i s t e d b y h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o nc h r o ma t o g r a p h y a n d r e l a t e d t e c h n i q u e

6、 sL I J i n g - J i n g ( C h e m i c a l T e c h n o l o g y )D i r e c t e d b y P r o f e s s o r S U Z h i - G u oAb s t r a c t H y d r o p h o b i c i n t e r a c t io n c h r o m a t o g r a p h y ( H I C ) , a p o w e r f u l t o o l f o r p r o t e i np u r i f i c a t i o n , h a s b e e n

7、 u s e d s u c c e s s f u l l y i n t h i s t h e s i s f o r r e f o l d i n g o f p r o t e in s . S e v e r a lr e la t e d t e c h n i q u e s w e r e a l s o d e v e l o p e d t o i m p r o v e t h e r e f o l d i n g e ff i c ie n c y . I t w a s d i s c o v e r e d t h a t c o m m e r c i a

8、ll y a v a i l a b l e h y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h i c m e d i a ,w h i c h a r e u s e d f o r p r o t e i n p u r i f ic a t i o n , w e r e n o t a b l e t o a s s i s t p r o t e i n re f o l d in g w h e nb e i n g e m p l o y e d d i r e c t l y i n t h e s a m e w a y a s

9、in p r o t e i n p u r i f i c a t i o n . L o w a c t i v i t y y i e ld a n di r r e v e r s i b l e a d s o r p t i o n w e r e f o u n d . H o w e v e r , t h i s p r o b l e m w a s c i r c u m v e n t e d b y a d d i t i o no f g l y c e r o l t o t h e m o b i l e p h a s e o f t h e c h r o

10、m a t o g r a p h y , f a c i l i t a t i n g t h e p r o t e i n s t o r e f o l dc o r r e c t l y . T h e r e f o r e a s t r a t e g y o f g l y c e r o l - m e d i a t e d H I C r e f o l d i n g w a s d e s i g n e d a n dd e v e l o p e d . Wi t h t h i s s t r a t e g y , s u c c e s s f u l

11、 r e f o ld i n g o f l y s o z y m e w a s a c h i e v e d , r e s u lt i n g i n8 5 %o f p r o t e i n r e c o v e r y a n d 8 6 . 3 %o f a c t i v i t y y ie l d w i t h t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f t h ep r o t e i n o f 1 .2 m g / ml . C o m p a r a t iv e l y , w h e n c l a s

12、 s i c a l d i l u t i o n3 2 .6%o f p r o t e i ni n t e r f e r o n b r o u g h tw a s o b t a i n e d . F u r t h e r a p p l i c a t i o nr e f o l d i n g w a s a d o p t e d , o n lyt o r e f o l d r e c o mb i n a n t a - 2 ba b o u t 8 4 %o f p r o t e i n re c o v e r y w i t h fi n a l p r

13、 o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 1m g / m l . T h e s p e c i f i c a c t i v it y r e a c h e d I N 1 0 8 I U / m g . W it h d il u t io n r e f o ld i n g , h o w e v e r , th ep r o t e in r e c o v e r y w a s 5 9 %a n d th e s p e c if i c a c t iv ity w a s 0 .4 x 1 0 3 I U / m g T

14、 o d e v e l o p b e t t e r h y d r o p h o b i c m e d i a f a r p r o t e i n r e f o l d i n g , w e p r e p a r e d p o ly e t h y l e n eg l y c o l- c o u p l e d , p o l y m e r i z e dp - c y c l o d e x t r i n( p - C D ) - c o u p l e d a n d T r it o n X - 1 0 0 - c o u p l e dm e d i a

15、u s i n g i m m o b i l i z a t i o n t e c h n i q u e s . T h e s e m e d i a w e r e a tt e m p t e d t o r e f o l d疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索r e c o m b i n a n t S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s e l o n g a t i o n f a c t o r G ( E F - G ) a n d r e c o m b i n a n t g re e nfl u o r e s

16、 c e n t p r o t e i n ( G F P ) f r o m i n c l u s i o n b o d i e s r e s p e c t i v e l y . I m m o b i l i z e d P E G m e d i u ma s s is t e d r e f o l d i n g o f E F - G s u c c e s s f u l l y b y p r e v e n t i o n o f p r e c i p i t a t i o n a n d m i s f o l d i n gw h ic h u s u a

17、 l l y o c c u r r e d i n t r a d i t i o n a l d i lu t i o n r e f o l d i n g . T h e p r o t e i n r e c o v e ry r e a c h e d 8 8 %a n d t h e y i e l d o f c o r r e c t r e f o l d i n g w a s 8 0 %. T h e f i n a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s 5 8 0 p g / m lI n c o m p a

18、r i s o n , o n l y 4 9 %o f p r o t e i n r e c o v e ry w a s o b t a i n e d w i t h 4 6 %o f c o r r e c t r e f o l d i n g . p - C D p o l y m e r - c o u p l e d m e d i u m w a s c o m b i n e d w it h a d e t e r g e n t , T r it o n X - 1 0 0 , t or e f o l d E F - G I n t h i s p r o c e

19、s s , E F - G a n d T r i t o n X - 1 0 0 , f o r m e d a c o m p l e x i n t h e s o lu t i o n .T h e i m m o b i l i z e dp - C D p o l y m e r c o l u m n w a s s u b s e q u e n t l y u s e d t o b i n d T r i t o n X - 1 0 0 a n dr e le a s e E F - G f r o m t h e c o m p l e x , t h u s f a c

20、 i l i t a t i n g E F - G t o r e f o l d . T h e p r o t e i n r e c o v e r y w a s9 8 . 7 %w i t h t h e 1 0 0 %o f c o r r e c t r e f o l d i n g . T h e f in a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s 5 3 0 ji g / m l .I n c o m p a r i s o n , u n c o u p l e d m e d iu m , i m m o b

21、i l i z e dp - C D m o n o m e r a n d d i r e c t g o i n g - t h r o u g hw a y w e r e a l l u n a b l e t o e f f i c i e n t l y e n h a n c e E F - G r e f o l d i n g . A n o t h e r r e f o l d i n g s y s t e m w a s d e v e lo p e d u s i n g i m m o b i l iz e d T r i t o n X - 1 0 0 a s

22、t h e s o l i dp h a s e a n d p - C D a s t h e m o b i l e p h a s e . U n f o l d e d G F P f r o m i n c l u s i o n b o d i e s w a s a d s o r b e d t oi m m o b i l i z e d T r i t o n X - 1 0 0 c o l u m n , f o l l o w e d b y e lu t i o n w i t hp - C D , w h i c h i n i t i a t e d t h ep

23、 r o t e i n t o r e f o l d . T h e p r o t e i n r e c o v e ry w a s 6 4 %w i t h 4 6 % o f c o r r e c t r e f o l d i n g . T h e f i n a lp r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s 3 8 0 l i g / m l . I n c o n t r a s t , d i l u t i o n r e f o l d i n g o n ly p r o d u c e d 4 .7 %o f c

24、 o r r e c t s t r u c t u r e c o n t e n t .K e y w o r d s : P r o t e in re f o l d i n g , h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n , g l y c e r o l , P o l y e t h y l e n e g l y c o l( P E G ) , (3 - c y c l o d e x t r i n p o l y me r , T r i t o n X - 1 0 0独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是在导师指导下进行的

25、研究工作和取得研究成果， 除了文中特别加以标注和致谢之处外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国科学院过程工程研究所或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我共同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。学 位 论 文 作 者 签 名 : 澹 林签字日期: 2 4 年 2 月2 )日学位论文版权使用授权说明 本学位论文作者完全了解中国科学院过程工程研究所有关保留、使用学位论文的规定。 特授权中国科学院过程工程研究所可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 并采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、 汇编，以 供查阅

26、和借阅。同意研究所向国家有关部门 或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的论文在解密后应遵循此规定)确丹才翎学位论文作者签名: 烤 t )月 飞 v日导师签名:签字日 期: 2 ,D a 年签字日期: 2 055- 年 工 月 1 Y - 日引言 2 0 0 2年人类基因组测序工作最终完成，从此生命科学的发展进入了 后基因组时代。 研究发现人类基因的数量( 约3 万个 ) 远远低于蛋白 质数量( 至少2 5 万种) ， 而蛋白质是生命活动的主要承担者， 因而仅从基因水平揭示生命现象的本质是不够的。 随之而来人们将面对着生物学下一个挑战性领域的 研究: 蛋白 质组学( p r o t e o

27、m i c s ) 。 人类细胞中的全部基因称为基因组， 由 全套基因组编码控制的蛋白 质则相应地被称为蛋白质组。蛋白质组学的主要任务是在整体水平上研究细胞内蛋白 质的组成及其活动规律，了 解基因如何编码产生形态功能各异的蛋白 质是蛋白 质组学研究的一项重要内容。 中心法则指出了遗传信息是从D N A通过m R N A传递到由按顺序排列的氨基酸组成的肤链。 人们己经知道蛋白 质只有形成一定的空间结构才能发挥其生理功能， 然而新生肤链如何将一级结构中其特定的氨基酸顺序反映到独特高级结构的过程还不清楚，蛋白质折叠的一个重要内 容就是解密所谓 “ 第二遗传密码” ，为人们从蛋白 质的一级结构预测高级

28、结构提供理论依据，从而帮助人们设计自 然界不存在的全新蛋白质。 研究显示许多蛋白 质的特征活动如翻译后修饰加工、 跨膜转移、 定位以 及蛋白 质之间的相互作用等都可能涉及到一定程度的结构变化，形成一种类似折叠过程中的“ 熔球态” ，因此研究蛋白质的折叠过程对于阐明蛋白质活动规律的本质具有重要意义。 尽管除性细胞外所有其它细胞都含有相同的基因组， 然而不同细胞不同周期不同蛋白 质的表达水平截然不同， 一些蛋白 质如调控蛋白在细胞内含量极微， 对编码它们的基因进行功能研究非常困难，基因工程使获取大量蛋白质进行功能研究成为可能。原核细胞如大肠杆菌由于培养条件简单生长迅速而成为常用的表达异源蛋白质的宿

29、主细胞， 然而其过量表达往往形成包涵体，需要进行复性才能得到活性蛋白 质。 人类一些遗传病如帕金森氏症和白内障等是由于体内某些蛋白质发生错误折叠导致聚集体形成而引起的病变， 对蛋白 质折叠过程和方法的研究， 有助于启示人们寻求纠正错误折叠的治疗手段。 蛋白 质复性是利用基因工程手段大规模生产重组蛋白 类药物的关键技术， 然而由疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索于竞争性的聚集生成而严重降低了活性蛋白 质的产率， 同时也增加了后处理的生产成本， 这使得它成为生物工程下游的瓶颈技术， 也是目 前国际上限制生物制品产业化的最大障碍之一， 仅美国 每年因 这一技术难题造成的 损失就高达数

30、十亿美元。 这一技术的突破不仅对蛋白质折叠领域的理论研究产生深远影响， 同时也对重组蛋白药物的产业化进程产生了巨大的推动力。 细胞内的蛋白质能在大分子拥挤的环境中进行高效折叠得益于分子伴侣的辅助，这提示外界伴侣辅助下的折叠复性能有效地抑制错误折叠和聚集， 人工分子伴侣的出现为伴侣辅助蛋白 质复性的产业化展示了应用前景。 层析介质由于其内在的特点如内部网状结构对蛋白 质分子的隔离效果以及复性和纯化的祸合等有助于获得高浓度和高活性收率的复性蛋白 质。 本文将分子伴侣的 作用原理和层析技术的优越性相结合，建立了 一系列基于疏水作用机理的固定化分子伴侣复性系统。 将高浓度的蛋白 质在高盐条件下吸附到商

31、业化疏水 柱上， 采用变性剂梯度解吸甘油介导下洗脱， 使释放的蛋白 质在一个亲水性逐渐增强的 环境中正确折叠， 采用此法对溶菌酶和重组a - 2 b干扰素包涵体蛋白质进行了复性。 采用固定化 P E G作为一种 “ 温和”的疏水作用介质，在高盐条件下吸附高浓度的变性金黄色葡萄球菌蛋白 质翻译延长因子( E F - G ) 包涵体蛋白 质， 利用小体积的8M脉脉冲解吸，促使释放的蛋白 质在亲水的环境中复性。采用表面活性剂胶束捕捉高浓度变性E F - G ， 利用固定化聚合环糊精从蛋白 质复合物中剥离表面活性剂而释放目 标蛋白 质， 并使其在一个相对封闭的 亲水环境中 折叠。 采用固 定 化的T

32、r i t o n X - 1 0 0 作为 疏水层析介 质， 在高盐 条 件下 吸附以 p 一 环 糊精 作为 洗脱剂， 对变性绿色荧光蛋白 ( G F P ) 包涵体进行复性。 此外，考察了上述系统复性过程的一些重要影响因素，并对机理作了 初步探讨。文献综述于疏水作用的自由能变化 ( 约2 5 - 1 0 0 k c a l / m o t ) ，另一方面其不受侧链结构的影响，所以氢键不可能成为蛋白质折叠的主要驱动力。 同样， 盐桥的静电作用虽然可以稳定蛋白 质结构， 但其数量较少 ( 仅约占氨基酸组成的1 0 %) ，因而也不是折叠的主要作用力。 蛋白质折叠的主要驱动力取决于疏水作用和构

33、象墒之间的能量差。 疏水作用指非极性溶质转移至水系统时， 水分子规则排列产生的表面自由能导致的非极性基团尽可能相互结合的趋势， 它能降低表面自由能促使系统稳定， 这一过程的能量变化具有温度依赖性。 蛋白质折叠的疏水自由能由变性蛋白质和天然蛋白质暴露疏水基团的面积差和单位面积疏水基团自由能的乘积决定。 构象嫡是指肤链折叠后的侧链氨基酸之间的空间障碍，它降低了自由 度而导致系统的墒减， 所以这是一 个热力学不利的过程。折叠过程的疏水作用力由于显著大于构象嫡减， 从而推动了 蛋白质折叠的自 发进行，但同 时 也暗示了 天 然蛋白 质的 稳定 性 较 低， 易 受外 界环境 如p H值， 压力、 温

34、度等)因素的影响而发生变性。 蛋白 质的疏水作用要求疏水基团尽可能多地相互接触， 使折叠过程具有强烈的选择性，它使得蛋白 质折叠能潜在形成的紧密结构数量大大减少，从而使折叠过程的迅速进行成为可能。 蛋白 质在疏水作用的驱动下坍塌成初步的紧密结构， 同 时 精细的 二级结 构( 如 c c - 螺 旋、 p 一 折 叠和 转角) 形成并加以 稳定， 这暗示 三级结构推动着二级结构的形成。 总之，蛋白质折叠过程由疏水作用形成结构框架， 疏水作用、 构象嫡、 氢键、盐键以 及内 聚倾向 力 ( 聚合物的内 在特性) 的综合作用决定了天 然结构的 最终形成2 11 .2 .2蛋白 质折叠的过程和途径

35、小 分子蛋白 质( 1 0 0 个氨基酸以 下 ) 在 折叠 过 程中 没有 稳定中间 体累 积， 即 符合“ 两态” 模型( 图 1 .2 ( a ) ) 。 但从 变性状态到天然状态的结构转变需越过高能量的过渡态。基于蛋白质工程和计算机模拟手段的分子动力学研究显示，过渡态结构类似天然态，但具有相对较多暴露的表面疏水基团， 且缺乏紧密包裹的精细结构。 过渡态的形成是小分子蛋白 质折叠的限速步骤。与大分子相比，其折叠速度显然快得多，通常小于。 I s 1 1$ 1 。 另 有 研究表明 小 分子 蛋白 质的 折叠 速率和 折叠 机理不是由 其一级结 构的 具体组成决定而是由 肤链更普遍的 特征

36、 拓扑学决定， 而侧链的 变化决定 着折叠过程中各种结构的稳定性并由 此组成了 整个折叠能图 15 1 。 小 分子蛋白 质的 折叠速率 和一个参疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索数一 接触级( 夭然蛋白 质内相互接触氮基酸残基间间隔序列长度与蛋白 质序列总长度的比 值) 存在显著相关性 1 1 6 1 ， 这一发现解释了 很多一 级结构不同蛋白 质具有相似过渡态的原因 1 7 1 大分 子蛋白 质的 折 叠一 般遵循“ 三态” 模型， 即 有 短暂稳定的中间 体形 成 均 。 折叠中间体的结构有如下特征: 有亚稳态的二级结构， 具有一定的紧密性， 其直径仅大于天然态的1 0 -

37、 3 0 %， 缺乏特异性的三级结构，结构具有可变性，具有松散的疏水核心， 有朝向溶剂的外在疏水表面， 具有相当的柔韧性， 易相互结合形成聚集体， 总之，它是一 种具 有 熔化侧 链结 构的 致密 球体， 因 而常常 被称为“ 熔球体” ( 1 8 -2 0 1 。 折叠中 间体有的形成了天然状态的部分结构区域， 局部结构区域在折叠后期通过重组形成天然结构， 这种结构重 组过程成为折叠的限 速步 骤 ( 图 1 I ( b ) ) ; 有的 含有大 量紧密的 非天然结构， 它们处于折叠途径外， 难以继续折叠形成正确结构， 而形成热力学不稳定的错误折叠， 最后发生聚集。 多结构域的蛋白 质折叠过

38、程中， 不同结构域的折叠速度可能 各 不 相 同 ， 折叠 速 度 慢的 结 构 区 域 形 成 往 往 是 限 速 步 骤 15 1( 图1 .2 ( c ) ) .C o o p e r a t iv e f o r u ia b o n o f a l l n a t iv e In l e r a c i o n sC v t f a p w i n 七n no 加n g lo b u le尺 田r m 阅. 厅 闷 n to f f o ld e d r e g io n s 一 一， 弓卜2又倒/L、(cj 图1 . 2不同类型蛋白 质的折叠途径F i g i . 2 R e f

39、o l d i n g p a t h w a y s o f v a r i o u s p r o t e i n s . S m a l l p ro t e in f o l d in t e o - s t a t e ( a ) i n v o lv i n g t h ec o - o p e r a t i v e f o r m a t i o n o f a l l n a t i v e i n t e r a c t i o n s . H o w e v e r , p r o t e i n s w i t h m o r e t h a n 1 0 0 r e s

40、 i d u e s u s u a l lyp o p u l a t e i n t e r m e d i a t e s d u r i n g f o l d i n g . S o m e o f t h e s e p r o t e i n s f o l d t h r o u g h a m o l t e n g l o b u l e s t a t e ( b ) .T h i s i n v o l v e s c o l l a p s e i n t o a m o l t e n g l o b u l e f o l l o w e d b y t h e

41、r e a r r a n g e m e n t o f t h e f o l d e d r e g i o n s . O t h e rp ro t e i n s f o l l o w a m u l t i d o m a i n f o l d i n g p a t h w a y ( c ) t h a t i n v o l v e s t h e f o r m a t i o n o f t h e fi r s t f o l d i n gd o m a i n a n d o n l y t h e n t h e f o r m a t i o n o f

42、t h e r e m a i n i n g s t r u c t u r e .1文献综述 蛋白质折叠的限速步骤可能涉及到脯氨酸肤键异构化。 蛋白 质肤键具有某种程度的双键性质，一般除脯氨酸外，其他氨基酸之间形成顺式构象的肚键是极为不利的，因此天然蛋白 质中非脯氨酸的 顺式肤键非常少见 ( 约 1 % 或0 . 1 % 1z ) ， 对于脯氨酸肤键顺式和反式之间的能量差则少得多， 因此某些蛋白 质特别是某些短肤偶尔可见顺式 构 象 ( 1 0 % - 3 0 % ) 2 2 1 0 脯 氨酸 肤键顺式 与反 式构 象的比 例和两 侧氨 基酸的 空间 构象、 静电作用以及范德华力有关。 脯

43、氨酸异构化涉及到部分双键的旋转， 具有较高的活化能 ( 约2 0 k c a l / m o l ) ， 反应速度较慢， 其半速期为1 0 -1 0 0 s , 脯氨酸肤键异构能垒的 存 在使其成为蛋白 质折叠 过 程的限 速步 骤 2 3 1异构 化反 应原理如图1 . 3 所示。 天 然蛋白 质脯氨酸肤键顺式或反式的构象是恒定的， 然而蛋白 质变性后由于脯氨酸肤键的顺式和反式构象可以缓慢的异构化而产生含天然和非天然两种脯氨酸肤键构象的异构体，由于只有非天然脯氨酸肚键会发生异构化， 因此一些蛋白质折叠呈现快慢两种现象 2 4 1 图1 .3 脯氨酸肤键的异构化F i g . 1 . 3 I

44、s o m e r i z a t i o n b e t w e e n t h e c i s a n d t r a n s f o r m s o f a n X a a - P r o p e p t id e b o n d 二硫键的存在使得天然蛋白 质更加稳定， 但同时也使变性蛋白质的折叠过程变得更加复杂， 含二硫键蛋白质的折叠过程伴随着二硫键的形成， 含多个二硫键的蛋白 质折叠时容易形成较多的错误折叠中间体。 蛋白质天然结构的获得要求那些内埋的二硫键先产生， 而表面二硫键最后形成。 二硫键形成的速率取决于琉基的靠近程度和反应活性， 影响二 硫键反 应的主要因素是琉基的离子化一琉

45、酸的形成。 琉基的p K a 值不仅决 定了 各 种p H值下离子 化的 程度也决 定了 疏酸阴 离 子和二硫键 S原 子的 反 应活性。 蛋白质折叠和二硫键的形成是协同进行的， 二硫键一般首先在那些序列上靠近的疏基间形成， 而那些空间距离较远和不易被二硫键试剂靠近的疏基往往不易形成二硫键， 蛋白质折叠过程中往往形成多种不同二硫键配对的中间体， 它们的正确配对需要疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索一个折叠过程弓 1 导的重排过程2 5 1 .2 . 3蛋白 质折叠的理论 基于对一些典型蛋白质折叠过程的研究， 人们提出了 一些模型用于描述蛋白 质折叠过 程( 如图1 .4 所示 1

46、 5 1 ) 早期 建立的 成核 峡速生 长 模型 ( n u c l e a t i o n g r o w t h m o d e l ) 认为， 伸展的多 肤链 上邻近基团先形成许多小“ 核” ， 而其它部分以 其为 模板， 快速折叠生长， 最终形成天然。 这一 模型中， 成核阶段是限 速步 骤 2 b 。J i g s a w模型指出 每一个蛋白 质分子都沿不同的途径折叠， 最后都形成天然结构扩散一 碰撞一 缔合模型强调多 肤链在折叠起始阶段迅速形成一些类天然结构，如(X -、 P 一 折叠等， 这些结构在伸展的多肤链中不稳定， 它们之间相互碰撞相互作用象圳旋构阶螺结 合 在一 起时，

47、 这些“ 微” 结 构域 就稳定 下 来， 多 肚 链 进一 步形 成天 然构 象 2 4 7 框架模型则认为蛋白质折叠起始于独立、 短暂的二级结构的形成， 然后它们通过彼此组装，得以 稳定， 在此基础上水分子从疏水核心被 “ 挤出” ， 最后形成三级结构 1 5 , 3 0 疏水坍塌模型提出蛋白 质折叠起始于疏水坍塌形成高度紧密富含二级结构但缺乏精确三级结构的熔球体， 熔球态的 形成对于后期的折叠至关重要 I S M o lt e n g lo b u le sh y d r o p h 曲沁浏妇 P se/ 图1 .4蛋白 质折亚过程的几种模型F i g , 1 .4 V a r i o

48、u s m o d e l s f o r m e c h a n s i m o f p r o t e i n f o l d i n g1文献综述 目 前比较受公认的蛋白质折叠理论是三维能量地形图或漏斗能图模型 ( 图 1 . 5 所示) 。它认为蛋白质折叠不存在单一而特异性的途径，折叠过程中能量的变化呈漏斗状， 变性蛋白质处于能量最高的顶端， 蛋白质能潜在地通过具有多条途径折叠成天然状态， 这些途径取决于研究蛋白质的氨基酸序列和实验条件， 不同的途径产生不同能量的中间体， 代表能图中一个个小的动力学能穴， 它们由于不稳定而进一步折叠， 最后在漏斗的 低端形 成能量 最低的 天然蛋白 质

49、 3 1 1 。 如 溶菌酶的 折叠时就具有快慢两 条途径， 3 0 %的分子可以直接经过疏水坍塌形成天然结构， 7 0 %的分子先形成含a 区域但缺少日 折叠区 域的 折叠中间 体3 2 1 B e g in n in g u l h e lix f o r m a tio n e rx f c o lla p s e 图 1 .5蛋白质折叠的漏斗能图理论示意图F ig . 1 . 5 T h e s c h e m a t i c d i a g r a m o f f u n n e l - l i k e e n e r g y l a n d s c a p e o f p r o

50、t e in f o l d in g2 .4蛋白质在细胞内的折叠1 . 2 . 4 . 1细胞内蛋白 质折叠的 特点 蛋白 质在细胞内 折叠面临两大困难: ( 1 ) 蛋白 质形成稳定的三级结构要求完整的肤链或 者至少一个完整的区 域存在， 而肤链的合成 是有序进行的， 而蛋白 质折叠速率( 通 常 为t It2 l s ) 显 著 快 于 多 肤 合 成 速 度 ( 约4 -2 0 a a S b ， 因 此 新 生 肤 链 在 合 成 时 容 易丛 水 作 甩 层 析 及 其 相 关 技 术 辅 助 蛋 白 质 折 0 复 性 的 探 索非 特异 性 作用， 而非 特异性 作用比 同 种

51、蛋白 质聚 集的内 在作用弱 得多 1 5 1 1 。 可 溶性 聚集体的 形 成主要 是由 于 特异性作 用所决 定， 更 大聚集体的 增长是 通过非 特异性 作用 1 5 2 1目 前比较认同的观点是， 聚集体的产生起始于基于蛋白 质分子间特异性疏水作用相互结合形成的可溶性寡聚体， 聚集体的大小随时间而增长， 而其浓度基本不变， 聚集体增长过程遵循聚集串 之间的多聚模式而不是蛋白 质单体的逐渐加入， 二 硫键和不同分子间的非特异性作用促使可溶性聚集体的增长， 最后形成协同 沉淀1 5 n i1 .3 .2包涵体的形成 外源蛋白 质在重组大肠杆菌等原核细胞中过量表达时， 往往形成不溶性的无活

52、性的蛋白 质聚 集体， 被称为 包涵体1 5 3 1 包涵体的形成主要是由 于外源蛋白 质高水平表达的结果， 除了含二 硫键的蛋白 质由 于在还原环境下的胞浆中通常无法形成二 硫键而错误折叠导致聚集外， 它与蛋白 质本身 的 性质( 如分子量、 疏水 性、 折叠 途径等) 以 及表达系统无直接 相关性 1 5 4 1 。 在 缺乏相 应而有效的分子伴侣等辅助蛋白 质的情况下， 高水平表达产生大量非天然结构的肤链， 发生聚集而形成包涵体。 培养温度的提高能加速肤链的合成， 同时也加速聚集的形成。 在细胞内 减少包涵体形成和增加可溶性蛋自的表达可以 通过降低肤链合成速率 ( 如降低温度和改变培养基

53、组成) ，与分子伴侣协同 表达以 及构建与水溶性肤链的融 合 蛋 白 5 4 1 包涵 体的 形成过程可用两种 模型 14 4 1 描 述， 第一种是少量 聚集体首 先形成 单一 或有限数量的 “ 种子” ， 然后错误折叠的单体蛋白 质向 种子扩散堆积， 结果不断生长形成巨 大的 聚集体; 第二种模型将包涵体视为蛋白 质聚集的聚合体， 即由 错误折叠蛋白 质形成若干独立的聚集体单元组合形成大聚合体。 包杨体形成过程中产生的聚集体核心是相互排斥的， 预先形成的聚集体阻碍新聚集核心的形成， 使得后续产生的 可溶性聚集体 进入 预先 形成少 数的 早期 聚集核 心， 从而导 致大 尺寸的 包涵体 均

54、 。 研究显示形成的包涵体并非是静止不变的， 它在多种宿主细胞蛋白( 如分子伴侣和蛋白 酶) 的 共同参与 下， 受折叠 和酶解两种反应的 调控 5 6 1 ， 始终处 于聚集和 折叠的平 衡 1 5 7 1当 细 胞内 蛋白 质合成减少， 包涵体能 部分 解聚 而产生可溶 性蛋白 1 5 8 1 。 因 此一 定程度上包涵体可视为细胞内 能抗酶解的蛋白 质储存库， 在分子伴侣作用下重新折叠或被蛋白酶水解。1文献综述3 3包涵体的特征、结构及组成 包涵体通常位于 细胞质中， 但偶尔在细胞周质中可见1 5 9 1 ， 它具有折光性， 可以 用光 学 显 微 镜 观 察 到 (s a t ， 为

55、多 孔 的 圆 柱 状 或 卵 形 结 构 6 0 1 ， 平 均 直 径 为0 .3 8 g m (6 11 ， 平 均密 度 约 为1 .3 g / m l (6 2 1 d 重组大肠杆菌包涵体的主要成份是过量表达的外源蛋白 质 ( 可能占5 0 %以 上) ，富 含二级 结构( 主 要是反 平 行p 折叠) ， 除了 蛋白 质 聚集体 可能 还有活性结 构的 蛋白 质存在(6 3 1 。 此外还含有协同 沉淀的非特异性杂质，其中富含小分子的热休克蛋白 质一l b p A a n d I b p B (6 4 1， 它 们 可 能 与 错 误 折 叠 蛋白 质 聚 集 的 调 控 有 关

56、(6 5 1 ; 还 有 膜 蛋白 ， 它 们通常是水不溶性的， 在分离过程中， 往往和包涵体混杂在一起; 另外可能还有少量的核酸 和磷 脂存 在6 6 1 非正确折叠的肚链由于暴露不正确的疏水基团， 易被蛋白酶识别并受攻击。 聚集体的形成减少了疏水表面， 从而减少了蛋白 酶攻击的机会， 因而包涵体具有抗蛋白 酶解的能力。1 3 4包涵体的分离和纯化 包涵体位于细胞内 或细胞周质当中， 因 此要从包涵体提取目 标蛋白 质首先需要将细胞破碎以将其释放。 鉴于原核细胞有坚硬的细胞壁而包涵体具有较大的稳定性， 一般需要较为剧烈的机械、 物理或化学的方法破碎细胞壁。 常用的细胞破碎方法有高压匀 浆 (

57、 如F r e n c h P r e s s ) 、 超 声、 高 速剪 切 ( 如 珠磨 机 ) 、 酶 解 ( 如溶菌酶) 。 为了 提高 破碎效 率， 减少细 胞碎片 体 积， 采 用循 环破碎 6 6 1 或协同 破 碎( 如超声 破碎和酶 解协同 进行) 效 果 更 佳。 为了 有 利 于 包 涵 体 分 离 和 后 面的 蛋白 质 复 性， 破 碎时 可以 加 入D N A酶水 解D N A从而降 低破碎 液 粘度， 加入 苯甲 基 磺酸氟( P M S F ) 可以 抑制蛋白 水 解 酶。 包涵体由于密度较高， 通常采用离心或过滤的方法进行分离。 比较有效的方法是采用 密度梯度

58、离心， 如 蔗糖密 度梯度离 心 ( 6 7 1 ， 这样包涵体可以 和比 它轻的 外 膜颗粒( 1 .2 g / m l) 和比 它 重的 核 糖体 ( 1 .5 g /m l) 同 时 分 开 (6 8 1 ， 但 这 种方 法 不 适 宜 在 大规 模生 产中使用。 理论上采用差示离心可以分开包涵体和细胞碎片， 但由于细胞碎片的大小与破碎次数有关，它们有一部分能和包涵体的大小重叠，所以很难得到精确分离的条件，而且容易损失部分包涵体。 为了提高收率， 通常采用比 较剧烈的离心条件， 将固体成分全部沉降， 再通过后续的 洗涤和变性将包涵体蛋白 质同杂质分离。 采用连续离心的疏水作用层析及其相

59、关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索办 法可以 实现自 动化能满足大规模生产的 要求。 切向 过滤由 于对设备要求相对较低，也易实现自 动化，也可用于分离包涵体， 缺点是固 液不易达到完全分离. 有证据表明 包涵体纯度对蛋白 质的复 性效果有显著的影响 6 9 ) 。因 此包涵体需要进行洗涤， 尽可能地去除杂质成份， 以 提高目 标蛋白 质的纯度。 高浓凰0 . 5 - 1 M ) N a C l可以 用来除去 残留的 核酸， 一些表面活性剂( 如T r i t o n 和脱氧胆酸) 可以 除去膜蛋白 ，低浓度的变性剂( 脉和盐酸服) 可以除去疏水性的可溶性蛋白， 它们使用的浓度一般通 过 实 验

60、 优 化 获 得 7 0 -7 1) 最 近本实 验室 采用 特定大 孔径的 凝胶过 滤 介质如S e p h a r o s e 4 F F或S e p h a r o s e H PP r e p - g r a d e 使大 尺寸的 包涵体被 排阻， 在 外水体 积下 洗脱， 而 允许核糖体、 包裹 膜蛋白 的表面活性剂胶束以 及残留的核酸和蛋白 质进入介质内 部， 采用此方法分离的 包涵体中目 标蛋白 质电 泳呈 现单一 条带 7 2 1 。 还有 人采用P E G 8 0 0 0 - 磷 酸盐 双水相系统 对 包涵 体 进 行了 有 效 的 分 离 7 3 11 .3 . 5包涵体的

61、溶解 包涵体蛋白 质由 于处于高度稳定的聚集沉淀状态， 在体外温和的条件改变下不易使其发生结构变化而实现折叠复性， 一般要求先采用剧烈的条件将其溶解变性， 然后进行复性。 最常用的方法是采用高 浓度变性剂，如6 - 1 0 M脉或6 - 7 M 盐 酸肌溶解包涵体7 4 1 。 它 们的 作 用 原 理 可 能 在 于 能 和 蛋白 质结 合 ( 可 能 通 过 形 成 强 烈的 氢 键 ) 7 s ) ， 也 有 可能通过改变水分子的有序排列从而减弱蛋白质的疏水作用( 它们因 此被称为紊乱剂或离 液剂( c h a o t r o p i c ) ) 而导致 包涵体蛋白 质的 变性 和 溶解

62、。 变 性的 包 涵体蛋白 质 尽 管是 澄清 溶液， 然而 变性剂较弱 时它 可能 处子可 溶性的 寡聚体 状态 7 5 )随变 性 剂的 除去往往难以 完全复性， 由于盐酸孤的 变性能力强于 脉， 而且由 于 脉溶液可能含有能 修饰蛋白 质自 由 氨基的 异 氰酸 7 6 1 ，因 此盐 酸 肌变 性包涵体 效果可能 优于 脉. 表 面 活 性 剂 也 可 用 来 溶 解 包 涵 体， 通 常 有 十 二 烷 基 磺 酸 钠 ( S D S ) 7 7 1 ， 十 六 烷 基 氯化 铁 ( C T A C ) 7 1 1 和 十 二 烷 基 肌 氨 酸 钠 7 9 1 等 。 表 面 活

63、性 剂 溶 解 包 涵 体 通 常 要 求 其 浓 度 在临界 胶束 浓度之上 ( C M C ) ， 因 此其作 用原理 可能 是由 于胶束的 形成导 致包涵 体蛋白 质的 解聚。 表面活性剂溶解的包涵体蛋白 质可能形成部分的二级结构， 如C T A C 溶解的生 长 激素 有1 0 - 1 5 % oz - 螺 旋 和3 0 - 4 0 %p 一 折 叠， 它 们 有 助于 提高 后 面 的 复 性 效 率 (6 6 1文献综述但表面活性剂特别是十二烷基磺酸钠( S D S ) 可能与蛋白 质发生不可逆的结合而难以 除去，因此对于药用重组蛋白 质的生产不推荐使用S D S . 此 外 某

64、些 情 况 下 使 用 极 端p H值 ( 酸 性 8 0 1或 碱 性 8 1 ,8 2 ) 以 及 低 变 性 剂 浓 度 下 的 高 压作用 8 3 也能 溶解包涵体。 含有二硫键蛋白质包涵体的溶解一般需要加入过量的还原剂，如二硫苏糖醇( D T T ) 、 二 硫赤鲜 糖醇 ( D T E ) , R - A基乙 醇和 半 肤氨酸 等打开 错配的 二 硫 键 5 0 ， 以 便于在以后的复性过程中形成正确的二硫键; 也可加入过量的氧化型谷肤甘肤形成混合型 二 硫键8 4 1或者将疏基氧 化成磺酸衍生 物 8 5 1 ， 二 者 在复性过程中 微量疏 基 还原 剂的存在下能发生二硫键的重

65、排。 为了防止体系中微量金属离子催化半肤氨酸的空气氧化， 通 常 在 变 性 剂 中 加 入 一 定 量的 鳌 合 剂 ( 如1 m M E D T A ) s b a 选择包涵体的溶解变性条件通常需要从多角度有时需从发酵到复性的整套工艺进行综合考虑。 在不影响变性效果的情况下， 有时可以采用低浓度变性剂， 既可以提高变性蛋白质的纯度也有可能提高后面的复性收率， 而多种方法的联合使用也可能有助于提高包涵体的溶解效果。 采用直接化学抽提的方法提取包涵体蛋白 质可以 实现过程自 动化，主要方法是在发酵液中直接加入变性剂抽提蛋白 质，可以省去收集细胞、包 涵体分离 及变性 等诸多步 骤e 7 ， 甚

66、 至可以 采 用低浓度 变性剂同 时 提取 和复 性 蛋白 质 8 8 1 溶解的包涵体蛋白 质如果纯度较低， 将会显著影响后面的复性收率， 因此有时需要 将其在 变性条 件下进行纯化 5 0 1 ， 常用的 方 法主 要 有离 子 交换层 析【8 9 凝 胶 过 滤 9 0 金属鳌合层析9 1 和反相层析【9 2 与体外操作不同的是， 细胞内有一套A T P 酶特性的分子伴侣系统( 主要包括D n a i ,G r p E , C 1p B以 及G r o E L - G r o E S ) 可以 使 包 涵 体 解聚 而 折 叠 形 成 天 然结 构。 其 作 用 原理涉 及一 个序列过程

67、 3 9 。 根 据 细胞内 包涵 体酶 溶 解和折叠 作用的 原 理， 人 们 可以 将分子伴侣酶系在体外溶液体系中或采用固定化方法进行应用，可能也具有类似效果。1 . 4蛋白质的体外复性方法 根据 A n f i n s e n提出的蛋白 质的一级结构决定三级结构理论，随着变性剂的浓度的降低或去除， 变性蛋白质能自 发地折叠成天然结构。 然而蛋白质在体外复性时往往伴随着聚集和错误折叠结构的形成， 而使活性蛋白收率显著降低。 由于聚集是分子间疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索反应， 而折叠复性是单分子反应， 因而随着复性时蛋白 浓度的提高， 聚集的速率会显著提高， 而在高蛋白

68、浓度下复性是生物技术产业化的要求。 因此寻求能促进蛋白质折叠复性同时抑制聚集体生成， 从而提高活性蛋白 质收率的高效的复性方法是蛋白 质体外复性方法学研究的出发点和方向。 文献报道的复性方法， 可以按照如下几个方面来分类: 1 ) 改变变性剂除去的方式和速率;( 2 )加入折叠促进剂;( 3 ) 加入聚集抑制剂;( 4 )促进二硫键重排;( 6 )体内复性体系的体外应用及模拟;( 7 ) 基质辅助及层析复性;( 8 )反胶束复性。1 .4 . 1变性剂去除的经典方法及改进1 .4 . 1 . 1 稀释复性 稀释法是操作最为简便而成本低廉的复性方法。 其特点是将变性蛋白 质加入至大体积的复 性缓

69、冲液中使变性剂浓度迅速降 低而启动折叠。 蛋白 质在稀释复性时， 折叠和聚集是相互竞争的， 如上所述蛋白 浓度是决定因素， 抑制聚集最直接的办法就是降 低 复 性 蛋白 浓 度， 一 般要 求 为1 0 - 5 a u 创 M I 9 3 ) 。 显 然 ， 过 低 的 蛋白 浓 度 无 疑 增 加了后处理的困难。 稀释复性成功的关键是控制变性蛋白 质加入复性缓冲液的速度， 使其迅速混合均匀至较低的浓度。由于折叠充分的蛋白 质不易聚集，因此采用流加( f e d - b a t c h ) 9 4 7 或 脉 冲 4 5 1 的 方 式 可以 使 复 性 过 程 维 持 较 低的 变 性蛋白

70、浓 度 而 复 性终 产物浓度较高。 流加复性的流速应利于变性蛋白 质的 扩散和复性， 脉冲复性的关键在于掌握变性蛋白 加入的时间间隔， 这需要通过优化实验确定。 采用以 上两种方法复性时，需考虑到不同时间的复性缓冲液组成不同， 可能会影响到正确折叠。1 .4 . 1 .2透析及超滤复性 与稀释复性不同， 采用透析复性时， 变性剂是通过扩散而除去的， 因此变性剂浓度的降低是一个缓慢的过程。 变性剂扩散的速率取决于透析管内 外的浓度差， 因此通过改 变浓度差可以 控制变性剂去除的速率。 基于 此原理， 透析复性又可以 分为一次透析、 分次 透析和 渐降 变性剂 浓 度的 透析7 5 ,9 6 7

71、 。 一次透析是 指将变性蛋白 质直接 对复 性缓冲液透析， 变性剂去除的速率比其他两种透析方法快， 如果变性蛋白质折叠速度较慢， 这种方法反而促进聚集沉淀。 分次透析指将蛋白 依次置于含从高到低变性剂浓度的缓冲液中， 最后才对复性缓冲液透析， 它的特点是在不同变性剂浓度达到平衡， 折文献综述叠过程中一定浓度的变性剂存在有利于肤链的运动， 特别是对于二硫键重排反应和多结构域蛋白的折叠过程有利。 渐降变性剂浓度的透析指将变性蛋白对高浓度变性剂透析， 然后逐渐稀释透析管外溶液中的变性剂浓度。 由于透析前后变性蛋白的体积变化不大， 因此相对稀释复性而言， 透析复性可以获得较高浓度的复性产物。 变性蛋

72、白质起始浓度对透析复性的效果有重要影响。 透析复性一般适用于在中浓度变性剂条件下折叠中间体相对稳定而不易聚集的蛋白质。 由于透析复性过程比较缓慢， 且不易实现自 动化， 基于透析原理的超滤复性具有大规模应用的潜力。 超滤复性主要用复性缓冲液置换变性剂， 变性剂去除的速度取决于超滤膜两侧的压力， 人们可以方便控制变性剂去除的速率以减少聚集。 超滤复性的主要缺点是疏水性膜材可能会非特异性吸附蛋白 质， 而且超滤过程中的剪切力可能会破坏折叠蛋白质的结构。1 .4 .2复性添加剂 由于前面所列的两类复性方法无法从根本上解决聚集的问题，因此人们设法在复性缓冲液中添加一些小分子物质，以促进蛋白质折叠 (

73、折叠促进剂) 或者抑制聚集( 聚 集 抑 制 剂) 7 5 1 .4 .2 . 1折叠促进剂和渗透质 折叠 促进剂主 要包括渗透质( o s m o l y t e s ) 和 一些盐。 渗透质是 细胞在外界 变性 环境 ( 如高温、 干燥、 高盐和变性剂)的压力下进行目 我保护而累积的小分子极性有机物，主要包括三类物质:( 1 )多元醇，如甘油，糖类 ( 蔗糖、海藻糖等) ;( 2 ) 某些氨基酸( 如脯氨酸和甘氨酸) ;( 3 ) 特殊的甲 基胺( 如肌氨酸、 N - 氧化三甲 基胺( T M A O )以 及甜菜碱( 三甲 胺已内 酷等) 9 7 ,9 8 。 这些渗透质不仅在细胞内而

74、且在体外具有稳定蛋白 质的能力9 9 。 渗透质稳定蛋白 质的原理在于它们能被蛋白 质优先排斥， 结果 使蛋白 质优先水化，从而增加蛋白 质的 稳定性 1 0 0 ,1 0 1 。蛋白 质在渗透质溶液和水溶液热力学能量的变化 即转移自由能) 显示， 渗透质使天然蛋白质和变性蛋白 质的G i b b s 能量都增加， 但变性蛋白 质的增加值远远高于天然蛋白， 因而可以看出 渗透质对蛋白 质的 稳定 性不是由 于 它能 稳定 天然结构 而是 使 变性状态去稳定 1 0 2 - 1 0 4 。 蛋白 质 稳定 性的提高表明天然状态到变性态是热力学不利的过程， 反过来则意味着从变性态到复性态疏水作用层

75、析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索的过程是热力学有利的过程， 也就是说渗透质的加入可以促进蛋白质的折叠。 实验证明， 许多 渗透质具有辅助蛋白 质折叠复 性的 功 效 1 0 5 - 1 1 0 需要强调的 是渗透 质虽 然可以 促进蛋白 质水化而加强蛋白质折叠过程中的疏水坍塌， 但同时也可能促进错误折叠和聚集， 它们可能使坍塌的结构过于紧密和富于刚性而使错误折叠结构无法进行重组形成天然结构7 5 1 。 另外， 高浓度的渗透质具有较高的 粘度， 可能阻止肤链的自 由 运动:而且它 们 可能 使琉基P K a 值升高 不利于二 硫键的 正 确形 成 【 10 5 。 因 此， 渗透质用于

76、 辅助蛋白 质折叠时有必要优化使用浓度。 盐类如硫酸铁促进蛋白 质折叠可能是由 于增加系统的 表面张力而使蛋白 质折叠的能量变化更为显著 u o 11 4 .2 .2聚集抑制剂 同渗透质与蛋白质的相互排斥作用相反，聚集抑制剂能和蛋白质存在相互作用而减弱折叠中间体相互结合的倾向，同时又不妨碍蛋白质的正常折叠。 低浓度的 变性剂能提高折叠中间体的 溶解性1 7 5 ， 而且能增加肤链的 柔韧性4 .7 5 从而促进折叠和抑制聚集. 变性剂浓度的选择是成功复性的关键， 浓度过低可能不能起到助溶的效果， 浓度过高可能抑制折叠过程的顺利进行， 对于不同的蛋白质需要的变性剂浓度可能相差很大 l u 聚乙

77、二 醇( P E G ) 可通过亲水和疏 水两种作 用力 特异 性地与牛 碳酸配酶的 熔球态 -第一折叠中间体结合形成非聚集复合物使其向 第二中间体折叠，随后P E G被释放，中间体最终折叠成天然蛋白， 聚乙二醇的分子量和它与蛋白质的摩尔比 对复性效果有重要影响 u z 具有疏水空腔和外在极性基团的环糊精也能和蛋白 质折叠户间体形成作用较弱可逆的 复合物， 从而减少聚集，随 着蛋白 质的逐渐折叠环糊精被去除 1 1 3 L 一 精氨酸是应用最为广泛而最为成功的聚集抑制剂， 实验证明它能提高多种蛋白质的 复 性收率 1 1 4 - 1 1 8 a L 一 精 氨酸 对天然蛋白 质不具 有稳定 效

78、果， 甚至 使蛋白 质 去 稳定 1 1 9 ，因而不能促进从变性态到天然状态的复性过程， 但它能提高折叠中间体的 溶解性， 因 而能 抑制 聚集使复 性过 程得以 继 续 12 0 1 表面活性剂也具有提高折叠中间体溶解性的效果，因而也有利于提高复性效率 12 1 1 。 用 于复 性的 表 面活 性剂 有阳 离子 型 如 十 六 烷基 三甲 基溟 化i y t ( C T A B ) 1 2 2 1 ， 非 离子 型 如 辛基 葡 糖昔( o c t y l g lu c o s id e ) 1 12 3 1 , T r i to n X - 1 0 0 1 12 4 , +二 烷 基麦

79、 芽 糖 昔 1 2 11献综N o n id e t P - 4 0 12 2 1 以 及 两 性型 如z w i tt e r g e n t 系 列 12 2 1 、 CHAPS92。 非 去 垢剂s u lf o b e t a in也具有相似功能 1 2 5 。 表面活性剂使用的 浓度对复 性效果有重要影响，一般情况下需要大于C M C 1 2 2 1 ， 但没有 直 接的 证据 显示 胶束的 形 成对复 性 有显著的 影响。 脂质体是一种封闭的双层磷脂膜， 可以视为一种双水相系统， 它在溶液中识别并结合蛋白 质折叠过程中的中间 体减少聚集【 1 2 6 1 ， 由 于磷脂膜具有流动

80、性因而它不阻 碍折叠过程的 进行，而且可以 采用带不同电荷或不同 疏水性的磷脂对脂质体进行修饰，从而使其具有类似分子伴侣的 功能 【 1 2 7 11 .4 .3促进二硫键重排 蛋白质折叠机理显示， 具有二硫键蛋白质的复性过程与二硫键的形成与重排紧密是祸联的， 变性还原蛋白 质在复性的 最初阶段就可能形成二硫键， 而这种折叠过程早期的二硫键往往可能是错配的， 它们需要通过分子内重排形成天然配对， 二硫键的重排过程可能成为这类蛋白 质折叠的限速步骤。形成二硫键的常用方法主要有下列四种:空气氧化法、氧化重排体系、形成混合二硫键和蛋白质磺酸化。 传统的空气氧化法主要是利用空气中的氧气自发地或者在痕量

81、金属离子的催化下 氧化自 由 疏基而形成二 硫键 9 3 ,1 2 8 1 。 空 气氧化虽 然价 格低廉， 然而由 于缺少 能 传递二硫键的小分子化合物， 因而蛋白 质内部二硫键重排速度较慢， 复性速度降低， 从而导致复性收率减少。 加入微量琉基还原剂可能由于能打开分子内的错配二硫键形成与蛋白质的混合二硫键因而能部分加速重排反应。 氧化重排体系又称氧化还原对，由 氧化型和还原型的小分子疏基化合物混合组成， 它们的 特点是既能促进蛋白 质二硫键的形成又可以 促进二 硫键的 重排。 最常用的氧化还原对 有还原型 和氧化型的 谷肮 甘肤( G S H / G S S G ) ， 它 们的 浓度和比

82、 例对复 性 效果有及其重要的影响。 典型的使用浓度为1 - 3 m M G S H , G S H与G S S G比 例为1 0 : 1 ,5 : 1 , 3 : 1 或1 : 1 9 3 ,12 9 1 ， 偶 尔 也 可 见 半 肤 氨 酸 / 肌 氨 酸， D T T / G S S qD T E / G S S G 等 15 0 形成混合二硫键的过程包括复性前将变性还原蛋白 质的自由琉基用过量的二硫键 试 剂 ( 最 常 用的 为G S S G ) 氧 化， 形 成 蛋白 质与 谷 胧 甘 肤的 二 硫 键 1 3 0 1 ， 这 种 方 式 适 用于折叠中间体溶解度低、 采用氧化还

83、原对效果差的蛋白 质， 尤其是那些富含二硫键的大分 子蛋白 质( 如r t P A ) ， 因 为 蛋白 质与 谷 胧 甘肤形 成混合二 硫键后可能 提 高 折叠中 间体的溶解性 5 4 1疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折蚕复性的 探索 与混合二 硫键的过程相似， 在还原剂存在下亚 硫酸钠能将变性蛋白 质的 疏基磺酸化，从而保护了疏基，复性时加入微量还原剂可以 脱去保护基而促进二硫键的重排，变性蛋白 质的磺酸化同时也可以 提高折叠中间 体的 溶解性9 2 , 1 3 1 11 .4 .4体内 折叠体系的 体外应用及模拟1 .4 .4 . 1 分子伴侣和折耍酶辅助蛋白 质的体外复性 细胞内

84、 广泛存在的分子伴侣家族和折叠酶( P D I 和P P D 使蛋白 质在体内的折叠过程快速高效而不受细胞内复杂成份的影响， 将它们用于蛋白质特别是药用重组蛋白质的体外复性无疑具有强烈的诱惑力。 蛋白 质体外复性采用较多的是G r o E L I G r o E S 分子伴侣系统， G r o E L能特异地识别折叠中间 体暴露的疏水表面并和其结 合， 防止折叠中间体的聚集， 随后促使蛋白 质在其中正确折叠1 3 3 。实验证明它们能显著提高某些蛋白 质的复性收率。完整的G r o E L I G r o E S 分子伴 侣系统 ( 包括G r o E L 及辅助因 子G r o E S 和A

85、 T P ) 能 使体外 难以 复性的 热 变性的 线粒体苹果 酸脱氢 酶的复 性收率 提高4 5 0 倍1 3 2 1 。 然而体 外研究显 示，单独的G r o E L也能显著辅助蛋白 质复性， 辅助因子G r o E S结合和A T P的水解不是G r o E L 发 挥分子伴 侣功能的 必要条 件， 但它 们可以 明 显 促进折 叠反 应的 顺利进 行 1 13 2 1董 晓 燕等 采用G r o E L 成 功地将溶菌 酶的 复 性收 率 从4 5 ( 自 发 折叠) 提高到9 5 % 1 3 3 1 .进 一 步 研 究 表 明 即 使是G r o E L的 顶 端 区( 被 称

86、为m i n i c h a p r o n e a 1 13 0 1甚 至 是 最 小 的1 9 3 - 3 3 5 和1 9 1 - 3 4 5 位 的 残 基 片 断 1 3 5 1 对 某 些 蛋 白 质 的 复 性 也 有 显 著 的 辅 助 效 果。 这表明分子伴侣辅助蛋白质复性的功能主要取决于一小部分的结构区域， 也暗示了 根据分子伴侣的作用原理人为设计全新的伴侣系统辅助蛋白 质复性的可能性。 除了 热休克分子伴侣H S P家族外， 其它一些蛋白 质分子也被发现具有分子伴侣功 能 ， 如 。 一 晶 球 蛋白 ( o L- c r y s ta l li n ) 11 3 s 1

87、 、 核 仁 蛋白B 2 3 1 13 11 和 微 管 蛋 白 ( T u b u i in ) 1 13 a 1 都 证明能和蛋白 质折叠中间体结合减少复性过程中的聚集，从而提高某些蛋白 质复性收率。 P D I 在体外具有分子伴侣的功能， 它能和底物蛋白 质C 1 2 5 A白 介素- 2 的 折叠中间 体迅速结合， 使其稳定， 然后P D I 和C 1 2 5 A I L - 2 形成混合二硫键， 最后C 1 2 5 A I L - 2与P D I 解离形成天然活性结构， G S H和G S S G的浓度和比值对复性效果有重要影响，它 们 决定了P D I 体外 催化的 活 性形 式一

88、 氧 化态P D I 的 数 量 1 3 9 11 .4 .4 .2 人工分子伴侣及人工折叠酶辅助蛋白质休外复性 由于从细胞内提取含量较低的天然分子伴侣较为困 难， 大规模的制备本身可能要求重组技术， 将它们大规模用于蛋白质复性无疑提高了使用成本。 因此， 根据分子伴侣的功能和作用特点寻找廉价易得的人工分子伴侣成为蛋白 质折叠复性领域的一个新的研究热点。 辅助蛋白 质折叠复性的分子伴侣具有两个特征:( 1 ) 具有能和部分非天然疏水基团外露的折叠中间体或变性蛋白质结合形成复合物的疏水部位:( 2 )在外力作用下( 一般是A T P 水解) 能发生结构变化， 使暴露的疏水部位内埋形成亲水表面，

89、从而促使底物蛋白 释放并进一步折叠形成天然结构的蛋白 质。 因此人工分子伴侣系统应该具有一定强度的疏水性， 足以和折叠中间体结合并能抑制聚集的生成; 同时它具有恢复亲水表面的能力。 1 9 9 5 年， G e l l m a n 实 验室 1 4 0 1 第一次设 计出 基于 两步反 应机理的 小分 子 人工 分子伴侣用于蛋白 质体外复 性。 第一步他们将变性蛋白 质在去除变性剂的同时用表面活性剂捕捉， 从而防止聚集的产生， 形成表面活性剂一蛋白 质复合物从而抑制蛋白 质自 发折叠; 第二步加入环糊精将表面活性剂从蛋白 质上剥离， 从而启动蛋白 质折叠， 其作用机理如图 1 .9所示。他们采

90、用此系统成功地复性了三种模型蛋白质一碳酸醉酶B ( C A B ) 14 1 、 溶 菌 酶 14 2 1和 柠 檬 酸 合 成 酶 ( C S ) 14 3 。 研 究 显 示 表 面 活 性 剂 的 种 类 对 于 蛋白 质一 表面活性剂复合物的形成效果有显著影响，阳离子表面活性剂对C A B有效，阳离子和两性离子型对溶菌酶皆有效， 而三种类型的表面活性剂皆可用于c s 的复性。环糊精疏水空穴的大小是剥离表面活性剂的关键因素， 由于 。 环糊精空穴较小不能容纳 表 面 活 性 剂 ， 一 般 采 用 卜 环 糊 精 作 剥 离 剂 14 3 1 。 除 卜 环 糊 精 外 ， 线 形 葡

91、聚 糖 一 1 0 也 可用来表面活性剂使蛋白 质复 性 1 4 4 。一 种能在水中自 我结合形成纳米凝胶的物质一 胆固 醇 取代的支 链淀粉 ( C H P ) 能 包裹 变性蛋白 质从而 防止 其聚集， 在p 一 环糊精 作用下纳 米 凝胶能发生 解聚从而 释放结 合的 蛋白 质使其折叠形成天 然结构 1 4 5 1 。 一 种具 有自我结 合特性的 刺激反应型聚合物一 聚 氧丙稀一 苯基一 聚乙 二醇 ( P P O - P h - P E G ) 能随 温度改 变改 变其结 构， 它能 在4 0 - 5 5 0 C 条 件下使C A B的 复 性收 率达到1 0 0 % 1 4 1

92、1 。 而另一 种温 度反 应型 聚合物一 P N I P A A m能 将p 一内 酞胺酶的复性收 率提高6 0 哪14 7 1疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索。 一 -dU r l - . - - - r. - - . 图1 .9人工分子伴侣辅助蛋白 质复性的机理F I G 1 .9 P r o p o s e d m e c h a n i s m f o r a r t i f i c i a l c h a p e r o n e - a s s i s t e d r e f o ld i n g . T h e p r o p o s e d m e c h a

93、n i s t i c p a t hb e g i n s w i t h U - d n , t h e n o n n a t i v e p r o t e i n ( U ) b o u n d t o s o m e n u m b e r ( n ) o f d e t e r g e n t m o l e c u l e s ( d )S t e p w i s e r e m o v a l o f d e t e r g e n t m o l e c u l e s 妙 t h e a d d i t io n o f c y c l o d e x t r i n ,

94、 r e s u l t s i n a n o n n a t i v e f o r m o ft h e p r o t e i n ( F ) , w h i c h t h e n f o l d s t o t h e n a t i v e s t a t e倒) . A lt e r n a t i v e n o n p r o d u c t i v e r o u t e s b r a n c hd o w n w a r d . T h e p a rt i a l l y s t r i p p e d s p e c i e s , U - d n - m , h

95、 a s t h e a b i l i t y t o s e l f - a s s o c i a t e a n d m a y r e s u l t i nc o m p l e x e s w i t h m u l t i p l e p r o t e in m o le c u le s , ( U - d o - m ) p . F u r t h e r r e m o v a l o f d e t e r g e n t m o le c u l e s l e a d s t ou n a v o i d a b l e p r o t e i n a g g r

96、 e g a t i o n . A l s o , t h e d e t e r g e n t - fr e e s t a t e ( F ) m a y h a v e a p r o p e n s it y t o a g g r e g a t e . 除了上述类型的基于两步反应机理的人工分子伴侣外， 一些分子由 于能与 折叠中间 体发生可逆结合从而抑制聚集生成但不影响蛋白 质的自 发折叠过程， 它们可以 被称为 广义的 人工 分子伴侣， 它们的 本质属于聚 集 抑制剂范畴。 在此意义上， P E G 1 1 u 1 ,脂 质 体 12 6 ,14 8 , 14 9 1 , 疏

97、 水 染 料 一 A N S ( a n i l in o n a p h t h a le n c e s u lp h o n a t e ) 5 0 ,1 5 11 等 都 由 于 具有人工分子伴侣的功能而提高某些蛋白 质的复性产率。 除了人工分子伴侣外， 有学者根据P D 1 的催化二 硫键形成与重排反应的特点， 设计成功了非蛋白 质类的小分子二硫键异构酶- N ,N 二疏基乙酞基一 1 , 2 一 二氨基环己 烷( B M C ) 用于 促进蛋白 质复 性过 程中 二 硫键的 正 确形 成 。 5 2 11 .4 . 5 反胶束复性 在表面活性剂存在下水溶液和有机溶剂混和可以形成反胶

98、束， 变性蛋白 质可以 通过相转移技术进入反胶束中 进行复性。 改变水与表面活性剂的比 例可以 得到不同 大小的反胶束， 从而使得每一反胶束只含一个蛋白 质分子， 这样蛋白质在相互隔离的环境中 折 叠 有 效 地 避 免了 聚 集 【 l s s - 1 5 8 1 。 牛胰 核 糖 核 酸 酶 采 用反 胶 束 复 性时 ， 氧 化 还原 对 后2 4小时能恢复天然活性，再用含乙酸乙酷的 1 M K C t 成功地将酶提取至水相。H a s h i m o t o h l 等将变性蛋白 质重新 沉淀 后， 再 用二 - 2 乙 烯基己 磺酞玻拍 酸 ( A O T ) 直 接进 行 固 相

99、萃 取， 加 入 氧 化 还原 对 后 复 性， 复 性 率 可 达 到1 0 0 % 。 V i n o g r a d o v 等 1 16 0 ) 采用 水一 二 一 2 一 乙 烯基己 磺酞 珑 拍酸 ( A O T ) 钠一 异辛 烷反 胶束 系统 对用 经典 方 法无 法复性的 重组S a p 8 0 成功地 进行了 复性。1文献综述1 .4 . 6层析复性 层析复性也可称为固相复性， 它的原理在于利用层析介质的空间将蛋白 质分子相互隔开， 从而减少它们在层析柱中折叠时相互聚集的机会。 此外它具有溶液状态无法比拟的许多优点: 可以重复使用一些价格昂贵的配基， 如分子伴侣和折叠酶，

100、降低了使用成本; 可以打破反应平衡， 使反应向产物方向进行， 溶液状态下的蛋白 质复性往往变性蛋白质与天然活性蛋白质的混合物， 采用固相方法可以将不同状态的蛋白质分离， 从而有利于折叠过程的持续进行; 由 于蛋白 质在层析柱上互相聚集的机会明显降低， 使蛋白质复性浓度显著提高， 从而提高了复性效率; 便于回收复性好的活性蛋白质， 溶液状态下由于引入了许多杂蛋白( 如分子伴侣等) 或其它添加剂，降低了产品的纯度， 带来了后处理的麻烦; 便于自 动化、 规模化生产， 可以将复性层析柱和分离柱串联在一起，实现蛋白 质的在线复性和纯化。 根据蛋白质采用层析柱的类型， 用于复性的层析模式可以分为如下几类

101、: 凝胶过滤层析、共价层析、离子交换层析、亲和层析、疏水层析、反相层析和折叠催化剂层析6 6 ,1 6 11 。为了区分于作为分析手段的 色谱技术， 本论文将用于制备目 的的蛋白 质复性的色谱技术称为 “ 层析” 。除凝胶过滤外，其它层析方法都利用了蛋白 质与介质配体间的相互作用， 它可能会影响蛋白 质的自 发折叠过程， 特别多点结合的作用力可能会超过蛋白质的疏水坍塌倾向， 从而阻止蛋白质复性; 此外， 基质骨架对蛋白 质复性的立体阻碍作用也不容忽视， 所以蛋白 质与基质应维持较弱的吸附作用而不影响折叠进程6 6 ,7 5 11 .4 .6 . 1 凝胶过滤复性 凝胶过滤复性的 特点是用复性缓

102、冲液平衡凝胶过滤层析柱， 然后将变性蛋白 质上柱， 再用复性缓冲液淋洗， 由于凝胶介质内 孔径大小的差异首先将变性剂和蛋白 质分开而启动蛋白质折叠， 折叠过程中不同构型的蛋白 质也能分开， 最后洗脱得到天然结构的蛋白质。 它从本质上属于一种置换缓冲液的方法， 同时也存在稀释的过程， 但与稀释和透析法不同的是， 凝胶过滤复性有介质骨架的空间阻碍作用， 它可以 有效地抑制蛋白 质互相靠近 和聚集。 B a t a s B .等 1 6 2 - 1 6 4 1 提出了 凝胶过 滤复性蛋白 质的 机理， 认为在折叠过程中不同折叠程度的蛋白 质具有不同的动力学半径， 它们在凝胶介质的分配系数存在差异。

103、变性蛋白质具有最大的动力学半径， 因而被大多数孔隙所排斥， 随着疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的 探索洗脱过程的 进行， 变性蛋白 质移动到变性剂浓度较低的 环境中逐渐发生折叠， 折叠使蛋白 质更加紧密， 半径更小， 从而使蛋白质进入更多的孔隙， 即在固定相的分配系数增大，蛋白 质在这种多孔性凝胶中的转移是 “ 扩散限制性” 的，因而折叠中间体的聚集倾向被有效地抑制。 凝胶过滤介质的惰性亲水界面一般不干扰蛋白质的自发折叠过程， 同时又能减少聚集的生成， 使其成为应用最广泛的 层析复性模式， 许多蛋白 质采用 凝 胶过 滤复 性获 得了 成 功。 6 2 , 1 6 5 - 1 6

104、 7 1 。 采用 凝胶过 滤复 性时， 介 质孔径大小( 即 分级范围) 、 进样和洗脱过程对复性效果有重要影响。小 孔径介质可以迅速将变性剂和蛋白 质分离， 但不利于隔开不同 构型的蛋白 质， 孔径过大则不利于变性剂和蛋白 质的有效分离， 一般需要通过实验优化确定适宜的凝胶过滤介质， 如脉激酶纤溶酶原激活剂片 断 采 用S e p h a c r y l S - 3 0 0 复 性 ， 效 果 就 优 于S e p h a c r y l S - 1 0 0 和S e p h a c y l S - 4 0 小 1 6 7 1而变性蛋白 质进入凝胶介质的起始过程可能 发生迅速坍塌而产生聚集

105、， 从而减少活性收率甚 至 堵塞 层析柱。 6 1 0 B a t a B 研究发 现折叠蛋白 质的 动力学半径和分配系 数与 变性剂 浓度呈负 相关 1 6 3 ,1 6 4 1因 此变 性剂 在 凝胶 过滤柱中 的 除去 速度影响 着部 分 折叠蛋白 质、 变性蛋白 质的 分开效果， 显 然 凝胶过滤的 流速对复 性收率也具 有显著影响 ( 6 8 1 为 避免 凝 胶过滤复性时 变性剂 浓度的 突然降 低而降 低复 性收率， 谷 振宇等 ( 1 6 8 1 在凝胶过滤柱上引入脉梯度， 使蛋白 质在柱中 移动时处于逐渐降低的变性剂 浓度， 采用此 方法 溶菌 酶的复 性 效率( m g 蛋

106、白 / n i l 介 质) 可以 提高2 : 5 倍。 一般线性变化的 脉 梯度可以 满足高浓度变性蛋白 质的复性， 一定 浓度变性剂的存在可能有 利于某些蛋白 质的结构变化， 但某些蛋白 质在中 浓度变性剂下有聚集倾向， 因此变性剂梯度斜率的 选择 是 这 一 方 法 成 功 的 关 键 ( 16 1 1 。 另 有 研 究 显 示， p H 梯 度 和 JR 梯 度 的 联 合 使 用 可以 使 重组S C F V融 和蛋白 的复性收率 提高7 0 0/ 6 16 9 1 . 而 在流动相中 添加人工分子 伴侣也能显 著提高 凝 胶过滤的复 性收率， 而且可以 允 许更高的 流 速 (

107、1 6 9 11 . 4 .6 .2共价层析复性 具 有半肤 氨酸的变性还原蛋白 质可以 除去过量还原剂后吸附到疏基柱上， 然后用复 性缓冲液将变性剂冲去， 随即启动复性过程， 随着折叠过程的进行， 蛋白 质与基质间 通过二硫键的形成和交换， 不断地被吸附和解吸， 最后形成天然结构( t 7 o 11文献综述1 .4 .6 .3离子交 换层析复性 离子交换层析复性的一般过程是在高浓度变性剂 ( 如6 -8 M脉)中将变性蛋白质吸附到离子交换层析柱上，然后逐渐降低变性剂浓度促使蛋白质在柱上逐渐折叠，最 后 用含一定盐 浓度的 缓 冲液洗脱复 性蛋白 质。 C r e i g h t o n采 用

108、此方法 成功 地复 性了细胞色素C , 凝乳酶原，金属蛋白 酶抑制剂以 及猪生长激素 I 7 ， 一 ，7 3 1离子交换层析复性的优点是吸附容量大， 有利于得到高浓度的复性产物， 另外采用盐梯度洗脱可以对包涵体变性的蛋白质可以同时起到复性和纯化的效果。S U t t n a r等采用强阴离子交换柱M o n o Q复性并同时纯化了 乳突淋瘤病毒融和蛋白H P V 1 6 E 7 M S 2 1 7 a 3 o 离子交换介质过高的配基密度可能使吸附的蛋白过于密集， 以至变性剂除去时易产生聚集， 使其难以洗脱和复性。 为防止蛋白质在柱顶端密集吸附， 可以将离子交换介质采用分批方式在变性剂溶液中吸

109、附蛋白 质， 使其均匀地分散到介质颗粒上以降低结合密度， 然后将其置于复性缓冲液中， 最后将介质装入柱中并用盐梯度洗脱复性蛋白质，这一办法可能有助于解决上述矛盾。另外一个途径是当蛋白质在 8 M脉中吸附到离子交换柱后， 采用同时降脉浓度和升盐浓度的 洗脱办法， 这样允许单个蛋白 质分子在梯度中每一优化的脉浓度下逐渐折叠， 从而减少了聚集和促进活性结构的形成 16 11 。 此 外 ， p H 值 也 是 影 响 复 性 效 果 的 重 要 因 素 。 一 方 面 远 离 等 电 点 的p H 值 可 以 使蛋白 质产生静电斥力从而减少聚集: 另一方面高p H值是二硫键形成和重排的 重要 条件，

110、 折叠过 程中 不同 的 二 硫键对由p H 值决定的 琉 基阴 离 子的 活性 要求可能 不同。 李明 等引 进降 脉和 升p H值的 双 梯 度 用于 离 子 交 换 成 功 地复 性了 鸡卵 清 溶 菌 酶 17 5 1 、 人溶菌 酶包涵体 1 7 6 1 和F e - S O D 包涵 体 1 7 7 11 .4 . 6 .4亲和层析复性 亲和层析复性蛋白质的原理是采用分子生物学手段给目标蛋白质接上特异的“ 尾巴” ， 使其在变性条件下吸附到某些特殊的亲和柱上，然后通过降低变性剂浓度启动复性过程， 最后用特异的配体将目 标蛋白 质洗脱。 亲和层析的优越性在于能最大程度地去除杂蛋白，既

111、有利于复性也有利于纯化。 应 用 最 广 泛的 是 金 属 鳌 合 层 析 ( 通 常 采 用N i 离 子 鳌 合 介 质 ) 1 7 8 - 18 11 ， 它 能 特 异 性 地捕捉带多聚组氨酸“ 尾巴” 的重组蛋白 质， 最常用的洗脱剂为咪哇， 也偶尔采用渐降的p H梯度 1 8 2 1 。 金 属鳌合层析的 缺点 在于 金属离 子可能 会影响 二 硫键的 正 确 配对 1 8 3 1疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折摄复性的探索 除 接 上多 聚 组 氨酸“ 尾巴 ” 外， 将多 聚 精 氨 酸 1 8 3 1 或 纤 维 素结 合 区 1 1 8 4 1 与目 标 蛋白质形成融

112、和蛋白能使其被多聚阴离子介素( 如固定化肝素层析) 或纤维素介 质特异性吸附，然后采用上述方法复性蛋白质。 同离子交换相似， 变性蛋白 质在亲和柱上的过量吸附折叠过程中可能会导致聚集， 因 此 推 荐 采 用分 批 方 式 预吸附 变 性 蛋白 质 1 1 6 代1 .4 . 6 .5反相层析复性 反相层析由于易导致蛋白 质不可逆疏水结合， 所以很少用于对变性蛋白 质直接复性。 但如果使变性蛋白 进行预折叠形成早期疏水核心， 而折叠的蛋白 质比 较稳定， 也可以 考虑 用反 相层析辅助复 性。 凌名圣等 “ 9 5 15K用 反相高 压液相 层析复性了 重 组 人白细胞介素- 2 ，活性收率和

113、比活分别比常规方法高9 倍和1 4 倍。1 .4 .6 .6固定化折叠催化剂复性 前面已 经谈到分子伴侣和折叠酶用于蛋白 质的体外复性能显著提高收率， 考虑到分子伴侣使用的成本较高， 因而将它们固定到基质或层析柱上重复使用更具 有应用价值， 这种方式被成为固定化折叠催化剂层析。固定化的G r O E L复性溶菌酶的回收率 达 到$ 1 % 13 3 1 0 A l t a m i r a n o 等 将M i n i c h a p r o n e 、 二 硫 键 异 构 酶 ( D s b A ) tQ 脯 氨 & 异 构酶( P P I ) 固定到琼脂糖4-胶柱上， 能使蝎毒C n 5 蛋

114、白 恢复天然结构，复性收率达到8 7呀1 8 6 1 。 这 一 层 析 柱 还 被 成 功 地 用 于a s s e m b l e C D I 的 复 性 1 8 7 3 。 由 于 分 子 伴 侣 的 固 定 化反应条件可能会改变其结构， 因此推荐使用反应条件较为温和的活化介质。 分子伴侣和折叠酶固定化的关键在于活性中心的维持， 除了采用共价结合的方式， 还可以 考虑采用非共价方式如静电吸附或亲和吸附. 为了 可以重复使用人工分子伴侣并且避免复性产物后续处理中去除人工伴侣伴侣分子的麻烦， 有人尝试了 采用环糊精的聚合微球和扩张床技术相结合的 方法复性蛋白 质， 然而采用传统的 层析方 式

115、时 却 未获得成 功 I S a 3 由于一些广义的人工分子伴侣一聚集抑制剂只是暂时结合折叠中间体的疏水区域而不影响折叠进程， 将它们固定化可以 将这种结合能力与 基质的空间隔 离效果加以综合， 从而更有效地防止聚集的产生。 研究显示脂质体固定化后保留了 其作为人工分子伴侣的特点， 能识别并结合构象变化的蛋白质如折叠中间体， 而且省去了 从复性产物中除去脂质体的麻烦: 它在强变性剂和温度等外在压力作用一 F 保持稳定， 可以长期反复 使用; 另外它还可能作为一种新型的双水相生物分离反应器起到复性和 纯化的双重 效 果 (12 7 ,189 其它层析柱如精氨酸亲和柱、 抗体祸联层析柱和合成的Mi

116、 n i 分子伴侣祸联层析柱 可 能 都 具 有 辅 助 蛋白 质复 性的 功能 ( 16 11 5疏水作用层析原理及应用1 .5 . 1 疏水作用和蛋白 质的疏水性1 . 5 . 1 . 1疏水作用原理 疏水性是指非极 性物 质与 极性环境间 的 排斥 作用 1 9 0 。 它也可以 指 水分 子在非 极性溶质周围规则排列的 特殊分子模型2 1 。 当非极性物质进入水中， 使得水在非极性物质周围形成洞穴。 这一过程当中， 洞穴产生排斥的水分子之间的大量氢键被破坏， 而在洞穴周围的水分子之间形成新的氢键， 因而焙变 H为负， 另一方面洞穴周围水分子有序排列的程度提高，导致明显的嫡减 ( A S

117、 0 。 因 此， 上述过程是热力学上不利的， 它不能自 发发生 1 9 1 1 。 水 溶液中由 于 疏水作 用非极性 溶质之间 相互结合， 这样非 极 性分 子周围 规则排列的水分子被置 换到无规则的水相中， 即 嫡增A S 0 ， 而正焙变A H 相对而言小得多，使得自由能 G 0 ，因而为热力学允许的自发过程。疏水作用过程如图1 . 1 0 ( A ,B ) 所示。 疏水作用对于生物系统有重要作用， 它是蛋白 质折叠和结构稳定性的主要驱动力2 ,19 2 - 19 4 1 ， 也 是 抗 原 抗 体 反 应 、 酶 与 底 物 反 应 19 5 ,1 9 6 以 及 维 持 生 物 膜

118、 磷 脂 双 分 子 层 的 重要作用力 19 7 1 . 5 . 1 .2氨基酸和蛋白质的疏水性 氨基酸的疏水性可以 用两种方法测定， 一是直接测定氨基酸在水和有机 溶剂中的溶 解度， 不同 氨基酸的 疏水性 可以 从 有机 溶剂到 水的 转换自 由 能 获得 1 9 8 -2 0 0 1 ; 二是分析己知蛋白 质的结构， 不同氨基酸的疏水性可以通过它们所处的环境， 埋在蛋白 质内 部氨基 酸的比 例， 侧链作 用参 数 或者 氨 基酸 靠近溶 剂的比 例获得2 0 1 .2 0 51 。 亲水 性 氨疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索鲁H y d rop h o b i c

119、 l i d s n d s 图1 . 1 0疏水作用原理示意图F i 目 1 0 . S c h e m a t ic r e p r e s e n ta t i o n o f t h e h y d r o p h o b ic i n t e r a c t io n . ( A ) D i s s o lv in g o f a n o n p o la r s o lu te inw a t e r .( B ) T h e i n t e r a c t i o n o f t w o n o n p o l a r s o l u t e s i n w a t e r .

120、( C ) A h y p o t h e t i c a l r e p re s e n t a t i o n o f l i g an d so f a n a m p h i l i c g e l an d h y d r o p h o b i c s u r f a c e s o n a p r o t e i n . L re p r e s e n t s w a t e r m o l e c u l e s .基酸的 疏 水性可以 通过 测量单 个原子的 疏水 性而 获得 (2 0 6 1 尽管大多数疏水性氨基酸倾向与埋藏在球蛋白内， 亲水性氨基酸暴露在外， 但许多疏

121、水性氨基酸也出现在蛋白 质表面， 蛋白 质表面的疏水性应当是暴露氨基酸疏水性和骨架疏水性的总和， 为含C 和S 侧链的区域以及主链C 原子的区域， 蛋白 质的表面并不光滑而是 粗 糙和复杂的， 非极 性表 面约 为 4 1 % 一 6 8 峪1 9 1 11 . 5 .2疏水作用层析的 概念及其沿革 疏水作用层析是利用蛋白质与具有疏水配基的吸附剂之间疏水作用原理用于蛋白 质分离的一种层析方法， 其作用原理如图1 . 1 0 ( c ) 所示。不同蛋白 质疏水氨基酸的数目、 分布以及疏水性的差异各不相同， 因此它们采用疏水性介质有可能实现特异性的 分离。 蛋白 质通常 在有利于 疏水作用的 条件

122、 下( 如高 浓度盐 ) 吸附到 疏水 作用介质的疏水配基上， 然后通过降低盐浓度洗脱， 与介质结合疏水强度不同的蛋白 质从而得到分离 (2 0 7 -2 0 9 1 。 蛋白 质的 疏水作用 层析是指溶 质与吸附 剂间 作用力的 疏水 性而不是 指层文献综述析过程的疏水性，因此严格说来采用 “ 疏水作用层析”的说法比“ 疏水层析” 更为准确 12 10 疏水作用层析由 于 采 用与离 子 交换 层析、 凝 胶过 滤和亲和层析截然 不同 的 分离机理而成为一种与上述层析互补的分离手段， 而且由于其样品不需要经过脱盐处理，因此可以与经典的蛋白质盐析技术相结合。 反相层析和疏水作用层析介质都含有疏

123、水性配基， 两种层析方法都基于蛋白 质与配基间的疏水作用， 然而二者分离机理显著不同。 反相层析吸附剂疏水配基的取代程度远远高于 疏水作用层析介 质， 前者通常 达到几百 u m o ll m l 介质， 可以 看成是连续的疏水相， 后者的 疏水配基密 度通常为1 0 - 5 0 p m o l/ m l 介质， 在亲水环境下仅是与蛋白质发生局部疏水作用。 蛋白质与反相层析吸附剂的结合非常强， 需要强烈的洗脱条件，如有机溶剂， 这样往往导致蛋白 质的变性， 它通常用于多肤和在有机溶剂的水溶液中稳定的小分子蛋白 质。 而疏水作用层析由 于采用水盐系统， 有利于蛋白 质活性的维持，因 此它 是一

124、种更实 用的 基于蛋白 质疏水 性 差异 分 离机 理的 分离 手 段1 9 1 ,2 1 0 T i s e l iu s首先提出 采用盐析吸附方法分离蛋白 质的观点，为现代疏水作用层析方法的 建 立奠 定了 基 础 2 12 1 ， 但 这 一 技 术 是 在 2 0 世 纪 7 0 年 代 早期发 展 起来 的。 药 e r te n 首先提出 现在普遍的 接受疏水作用层析的概念2 1 3 1 。 早期的疏水作用层析介质具有混合离 子 交 换 作 用 与 疏 水 作 用 的 特 点 2 14 -2 17 1 . p o r a t h 等 2 18 1 以 及 琦 e r te n 等

125、2 19 1 发 展了 中 性 的疏水吸附 剂。最早出 现的 商业化的 疏水作用介 质为 P h a r m a c i a B i o t e c h公司的 P h e n y l和O c t y l S e p h a r o s e C L - 4 B 12 2 0 1 ， 目 前 可以 得 到 的 商 业 化 疏 水 作 用 层 析 介 质 如 表 1 . 1 所 示 1 9 1 11 . 5 . 3疏水作用层析的保留机理1 . 5 . 3 . 1热力学模型 热力学模型指出中性盐对蛋白 质的溶解性和对蛋白质在疏水作用层析柱保留的影响相似， 盐析过程中蛋白 质相互之间的接触和疏水作用层析

126、过程中蛋白 质与配体之间 的 接触都同 盐 浓度 存 在定 量 关系 2 2 1 ,2 2 2 1 。 根据 这一 模型， 溶质结合的自 由 能 变 化与溶质、 配体以 及二者混合物的溶剂化过程有关。 溶剂化过程中， 溶剂首先形成与溶质大小相同的洞穴， 而后溶质进入洞穴中通过静电作用以 及范德华力与周围 环境相互作用。 疏水 作 用层析 过程中， 洞穴形 成的能 量变 化 G . 。 与盐 浓度、 表面 张力 和分 子疏水 作用层析及其相关技术 辅助蛋白 质折叠复 性的 探索 表 1 . 1可得到的商业化疏水吸附剂和疏水柱T a b l e 1 . 1 C o m m e r c i a l

127、l y a v a i l a b l e a b s o r b e n t s a n d c o l u m n s f o r H I C厂商产品名功能基基质A 常规介质J . 工 Ba k e rBi o - R a d GEHe a l t h c a r e H 1 - P r o p y l Me t h y l H I C t - B u t y l P h e n y l S 印h a r o s e B u t y l S e p h a r o s e 4 BO c 勺 4 S e p h a r o s e C L 一 BP h e n y l S e p h a r

128、 o s e C L - 4 B B u t y l S e p h a r o s e 4 F FP h e n y l S e p h a r o s e 6 F FH i l o a d P h e 叮1 S e p h a r o s e硅胶， 1 5 - -4 0 p m ,3 0 0 和 2 7 5甲 基丙烯酸醋, 5 0 p m琼脂糖( A g a r o s e ) ,3 4 p m琼脂糖,4 5 - 1 6 5 p m琼脂糖, 4 5 - 1 6 5 p m琼脂糖, 4 5 - 1 6 5 g m琼脂糖, 4 5 - 1 6 5 p m琼脂糖, 4 5 - 1 6 5 p m

129、琼脂糖, 3 4 p m ， 预装柱4 % 交联或非交联琼脂糖S ig m a 丙基( P r o p y l ) 甲 基( M e t h y l ) 一 l . 基( B u t y l ) 苯基( P h e n y o 丁基 辛基( O c t y l ) 苯基 丁基 苯基 苯基。 氨基C-2 , C - 3 ,C - 4 , C - 5 , C - 6 , C - 8 , C - 1 0 , C - 1 24 - 苯基丁胺， 2 , 2 一 二苯基丙胺.烷基: C 么C - 3 , C - 4 , C - 5 , C - 6 ,S y n C h r o mS y n C h r o

130、 p r e p C - 8 , C - I 0 , C - 1 2 .苯基，三苯甲 基( T r i t y l ) 丙基 寡聚乙二醇( O l i g o e t h y le n e g l y c o l ) 苯基 寡聚乙 二醉 丁基 苯基硅 胶， 1 5 和 3 0 p m , 3 0 0 人聚合物, 2 0 - 4 0 u mTOS OHAASP h e n y l - 5 P WE t h e r 6 5 0B u t y l 6 5 0P h e n y 1 6 5 0聚合物, 2 0 - 4 0 t m聚合物， 2 0 - 5 0 I t m聚合物, 4 0 - 9 0 1

131、t m聚合物,5 0 - 1 5 0 1 tmB . H P L C 介质 上 T B a k e r H I - P r o p y lH y d r o c e l l C 3 1 0 0 0H y d r o c e i l C 4 1 0 0 0H y d r o c e l l C 3 N P 1 0H y d ro c e l l C 4 N P 1 0 丙基烯丙基( A l l y l ) 丁基 烯丙基 丁基硅胶， 5 - 1 5 1 t m , 3 0 0 人聚合物。多孔聚合物，多 孔聚合物，非多孔聚合物，非多孔1文献综述厂商产品名功能基基质Bi o - Ra dI n t e

132、 r a c t i o n B i o - G e l MP - 7 H I CB i o - G e l P h e n y l - 5 P W S p h e r o g e l - H I CMC I G E L C Q H 3 x sH y d r o p h a s e H P - B u t y l甲基苯基7 一 基，苯基丁基Mi t s u b i s h i Ka s e i GEHe a l t h c a r eMCI GEL HI C醚基( E t h e 0 ， 丁基，苯基聚合物， 7 l t m , 9 0 0 A聚合 物，7 l tm , 1 0 0 0 A硅胶,

133、 5 h m , 3 0 0聚合物， 1 0 P r o聚合物， 1 0 l u n聚合物， 1 0 h m， 大孔径P h e n y l S u p e r o s eP h e n y l琼脂糖, 1 3 h mA l k y l S u p e r o s e新戊基困e o p e n t y l )S h o waDe n k oS h o d e x HI CP h e n y S i g m a S u p e l c oS y n C h r o mT OS OHAASYMCS i g m a C h r o m H I C - P h e n y l S u p e l c

134、o s i l L C - H I N T S y n C h r o p a k E t h e r 5 P W P h e n y l 5 P W B u t y l - N P R YMC - P a c k - HI C 苯基 二醇( D i o l ) 丙基，轻丙基，戊基 寡聚乙二醇 苯基 丁基含丙基配体的交联聚酞胺琼脂糖, 1 3 h m聚经甲基丙烯酸醋，大孔( P o l y h y d r o o x y m e t h y l a c ry l a t e )交 联 多 聚 糖 , 1 2 - 1 5 1 tm硅胶， 5 l t m , 1 0 0 人硅胶 ， 6 1 tm

135、,3 0 0 A聚合 物， 1 0 , 1 3 ,2 0 p m , 1 0 0 0 A聚合物， 1 0 , 1 3 ,2 0 g m , 1 0 0 0 A2.51m， 非多孔硅胶瓜5 h m ,3 0 0 AC 、新型分离 介质Mi l l i p o r e Me mS e pC h r o m a t o g r a p h y再生纤维素的连续网络，衍射， 1 . 2 g m贯穿孔P o r o s PHA p p l i e dB i o s y s t e mP o r o s P E聚苯乙 烯二乙 烯基苯， 覆盖交联聚经基化聚合物， 大贯穿孔P o r o s BUPo r o

136、s ET 苯基苯 基醚 ( P h e n y l e t h e r ) 丁基 醚基表面积有关，可以用下式来表示:A G 二 ， = - A A a m + C o n s t a n tA A 为结合和未结合状态下暴露在溶剂中的配体和蛋白 质面积差， 即蛋白 质与配疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折受复 性的探索体结合的分子接触面积。 m为盐的 摩尔浓度， 口为不同 盐的 特征常数即 摩尔表面张力增量( 表面张力系数) 。 仃与体系表面张力密切相关: Y = ), 0 十 喇， Yo 为 纯 水 的 表 面 张 力 疏水作用层析过程中， 低盐 浓度下蛋白 质的结合能力由 于盐导致的 静

137、电 作用而减弱， 因而容量因子k 有所下降: 高盐浓度下随盐浓度提高疏水作用显著增强， k 增大。此时k 与盐浓度的关系可以 用下式表示: l o g k = A A a m十 C 因 此盐对疏水作用层析保留的影响主要在于盐的 摩尔浓度和表面张力系数。 盐 浓度的提高和采用高表面张力系数的盐均可增强蛋白质在疏水作用层析上的保留。 表1 .2为不同 类型盐的表面张力系数122 1 1 表1 . 2几种盐的表面张力系数T a b l e 1 .2 Mo l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e me n t o f v a r i o u s s a

138、l t sS a l t6 x 1 0 3 ( d y n .g l c m .m o l ) K C 1 0 4 1 . 4 Na C l 1 .6 4N a 2 H P 0 4 2 . 0 2NAM 2 . 12 . 1 62 . 5 82 . 7 33 . 1 6 S t a b y 和 M o ll e r u p (2 2 3 1 在 上 述 理 论 的 基 础 上 扩 展 了 盐 浓 度 的 范 围 ， 建 立 了 容 量 因 子k 与溶液和固定相中蛋白 质活度系数的函数关系:In k = In k a * In 井 7 0一 In 匕+ In 二Y o V ol( In 砚 为

139、离 子 强 度 为 零 的 容 量 因 子 ， In 井为 溶 液 中 一 定 离 子 强 度 下 与 离 子 强 Y a度 为 零 时 蛋 白 质 活 度 系 数 的 比 值 ， In 井 为 固 定 相 中 一 定 离 子 强 度 下 与 离 子 强 度 为 零 Y 0献综时 溶 液 中 蛋 白 质 活 度 系 ” 的 比 值 ， In V=VQ 为 一 定 离 子 强 度 下 和 “ 子 强 度 “ ” 时 “ 动 相的偏摩尔体积比。In 癸可 以 用 D e b y e - H iic k e l方 程 表 示 : Yo1 .5 打a 1 + 1 .6 打+ 0 . 1 5 1 , 1

140、 为离子强度，a 为依赖与流动相p H 值的常数 y o y表示盐析效应或减少溶液中溶质的化学势， 7 o Y 表示盐溶效应或增加溶液中溶 质的 化学 势。 在离 子强 度为 零的 情况下， 容量因 子 k 为 流 动相 p H 值的 函 数， 而 与固定相配基无关。1 . 5 .3 . 2水化模型和优先作用理论 水化模型(2 2 4 1 考虑了蛋白 质与盐优先的作用以 及盐对蛋白 质溶解度的影响， 指出一 些盐 ( 如M 9 C 12 ) 尽管可以 提高 表 面张力， 但由 于 它 们可以 提高蛋白 质的 溶解 性所以并不促进其疏水吸附; 而N a 2 S 0 4 和N a 2 H P O

141、; 由于蛋白 质的优先水化而被蛋白 质的表面区 域所排斥【2 2 5 1 ， 这类盐的 存在提高了 体系的自 由能且随着蛋白 质疏水表面成比 例的增加， 蛋白 质与配体的疏水结合减少了蛋白 质与溶液系统的接触面积因而降低自由能， 所以这类盐有助于蛋白 质的吸附。 R o e tt g e r 3将 疏 水 吸 附 同 盐 与 蛋白 质 或 配 基 的 优 先 作 用 相 联 系， 认 为 非 离 液 剂 不易和蛋白 质或配体优先作用， 因而促使蛋白 质在疏水配基上吸附， 而离液剂可以和蛋白质优先作用从而促进其解吸。1 . 5 .3 . 3构象变化 模型 J e n n i s s e n 2

142、2 7 1 指出 蛋白 质在疏水作用介质上的吸附是个多步过程， 其限 速步骤并非碰撞速率而是蛋白 质在疏水作用介质表面缓慢的构象变化。 O s c a r s s o n J2 2 8 1 认为盐对蛋白 质疏水吸附的影响并非简单地来自 于表面张力的变化， 蛋白 质在疏水柱上吸附时会连续改变其构象， 不同类型的吸附剂、 盐种类及浓度会促使蛋白 质某些作用位点暴露， 形成有利于吸附的特定构象， 当这些构象与固定相的表面互补的话，就可以导致其吸附。疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索1 5 . 3 .4计量置换模型 C i e n g 2 2 9 提出 蛋白 质 在 疏 水 作 用 介

143、质 上的 吸附 伴随 着 蛋白 质 与 疏 水 配 基 界 面 之间的水分子释放到溶液中， 盐作为稀释剂改变水的摩尔浓度， 并影响蛋白 质的构象、 疏水作用和水化的蛋白质分子表面的水分子数。1 .5 3 . 5顺序结合模型 L i n 等 2 3 0 1 认为蛋白 质在疏水作 用介质的 结合 可分 成5 个顺序步骤。 ( 1 ) 蛋白 质的 脱水或去离子化; ( ) 吸附剂的脱水或去离子化: ( 3 ) 蛋白 质与疏水作用介质间的 疏水作用; ( 4 ) 蛋白 质的 结构变 化和重 排; ( S ) 溶液中 被 排斥水 和离子的 重 排。 根据此假设， 配基链长以 及配基密度对疏水作用层析的影

144、响与吸附剂和蛋白 质的脱水过程有关，配基密度增加导致的吸附嫡提高可能是由于脱水过程促使的嫡增效应。 而在一定的配基类型和密度下， 吸附嫡随吸附蛋白 质量的增加而提高是由 于蛋白质之间的相互作用以及其内在特性的结果。1 . 5 .4 影响疏水作用层析的因 素1 . 5 .4 . 1固定相 疏水作用层析固定相随 配基类型、 密度和基质类型而不同， 相同的蛋白 质在不同的固定相上保留值呈现较大的差异。 ( 1 ) 配基类型 最常用的疏水配基为脂肪烃和芳香烃。在相同配基密度下，脂肪烃的链长增加，介质 疏水 性增强， 但选择性可能降 低。 短链脂 肪烃 ( 如 B u t y l ) 主 要表 现为 吸

145、附 作 用， 而长 链脂肪烃除了 吸附 作用外， 可能 还 存在分配作用， 因 而导 致更高的 吸附 治 2 3 1 1芳香 烃 配基除了 疏水作 用外可能 还形成 7 C - 7 C 共辘 作 用 1 9 0 ,2 3 2 1 经典 的 脂肪 烃和芳 香 烃疏水配基可能促使某些蛋白 质特别是强疏水蛋白 质的不可逆吸附， 其洗脱需要剧烈的条件如变 性剂、 有机溶剂或 表面活 性剂 等， 这样往往导 致蛋白 质的 变性 2 3 3 -2 3 5 1 双水相分配系统是一种利用疏水作用差异分离蛋白质、细胞碎片等成份的手段2 3 6 1 。 常 用的 双 水 相 系 统由 两 种 聚 合 物 ( 如聚

146、 丙 稀 一 葡 聚 糖、 聚乙 二 醉 一 葡 聚 糖系 绷或 聚合物和盐 ( 如 聚乙 二醇 - M g S O 4 系 统) 组成， 尽管 上述聚 合物具 有良 好的 水溶性， 然而从其热力 学参数 如表面张力 系 数) 分析， 它们可能 具有 一定的 疏水性 ( 图1 . 1 1 ) ， 和 烷 烃相1文献综述比它们可以看成是温和的疏水配基。 常用的聚醚类聚合物疏水性随重复单元的C 原子数的 增加而提高， 几种经典的聚醚类化合物的 疏水性顺序为:P E G( 聚乙 二醇)P E G - P P G ( 聚丙 稀醇 ) 共聚物 P P G P T M G ( 聚亚 丁 基醇 2 3 7

147、1 。 将双水 相分 配中 聚合 物相固 定到层析介质上，可以 制备温和的疏水作用介质2 3 8 丙】 夕 川 y r e n eP EGsP VAr VP. k x l r a nY s v一 I S - 2 8 m J / m 2Y s v3 2 m J / m 2Y s v 4 2 - 4 G mJ / m 2味 q A l k a n e sCHARAC T E RY S ，一， 0 m J / m 2S u r r mt l o n ( Y a v 1 图1 . 1 1基于表面张力 差异的聚合物疏水性示意图F i g . 1 . 1 1 . S c h e m a t i c h y

148、 d ro p h o h i c i t y s c a l e b as e d o n s u r f a c e t e n s i o n o f v a r i o u s c h e m i c a l s . 祸联方法的不同也会产生不同类型的配基。一些藕联方法可能会引进带电 基团，如滨化氰活化法2 3 9 祸联的 疏水作用介质会产生带正电的 烷基钱，层析过程因 而具有疏水 作用和离 子交 换的 混合 特点 2 1 4 。 采用 缩水 甘油 醚祸联技术可以 得到中 性的 疏 水配基 2 19 。 采用1 ,4 一 丁二醇二 缩水 甘油 醚2 4 0 和 Y 一 缩 水甘油 醚轻丙

149、基 三甲 基 硅 氧 烷份 g lu c y d o x y p r o p y ltr i m e t h o x y s i la n e ) 2 4 1,2 4 2 1祸 联 可以 制 备 含 空 间 手 臂 的 疏 水 配 基 ， 这 样有利于蛋白质的疏水表面靠近。 在高盐条件下许多层析介质基质本身如纤维素、 葡聚糖、 琼脂糖、 有机聚合物或改性硅胶等均表现出 疏水作用特性， 可称之为盐析层析 1 9 1 ( 2 ) 配基密度 配基密度对疏水作用介质吸附容量和疏水结合强度有重要影响。 疏水作用介质的蛋白结合量随配基取代密度的提高而增大， 当密度足够高时， 表观结合容量达到饱和值， 而结

150、合强度随密度增加而进一步提高， 这种情况往往形成多位点吸附使得结合的蛋白 质难以 洗脱2 4 3 ,2 4 4 。 配基密度可以 采用核磁共振、 气相色谱、 元素分析以 及衍生紫 外 光 谱 等 方 法 进 行 测 定 2 4 3 ,2 4 5 商 业 化的 O c t y l 和 P h e n y l S e p h a r o s e 介 质 配 基 密 度 约疏水作用层析及其相关 技术辅助蛋白 质折叠复性的探索为 4 0 R m o lt m l 柱 床， 相当 于 每摩 尔 半 乳 糖取 代 0 .2 m o t 疏 水 配 基， 每 m l 上 述 介 质 吸附 1 5 - 2 0

151、 m g 人 血 清白 蛋白 和 3 - 5 m g 乳 球蛋白 2 4 6 1 ( 3 ) 基质类型 采 用 相同 的 疏水 配 基， 不同 的 基 质 类 型也 可 能 会 导 致 选择 性 差 异 19 0 ,19 火1 .5 .4 .2流动相 ( 1 ) 盐种类的影响 盐 对疏水作用层析的 影晌符合蛋白 质在水 溶 液中 沉淀的 规律， 即 H o fi n e is t e r ( 离液 )序 列 2 2 1 ,2 2 2 1 . 斗 一 一， U R A f r 一 一阴 离 子 : P 时 ， S O 4 2 , C H 3 C O O C l , B r -, N O 3 ,

152、C 10 4 -, I -, S C N -阳 离 子 :N H 4 + , R b + ,K + ,N a + ,L i ,M g 2 + ,C a 2 + ,B a 2 + - O M A N一 10 序列起始端的盐提高水的表面张力促使水分子结构化， 从而加强疏水作用而促使蛋白 质沉淀， 被称为非离液剂; 序列末端的盐降 低水的表面张力使水分子去结构化从而减弱疏水作用。 通常硫酸钠、 硫酸钾或硫酸按由于高盐析效果能有效 地促进蛋白 质在疏水作用介质上的吸附， 然而硫酸镁或氯化镁尽管能提高水的表面张力却不会促进疏水结合作用， 这可能是由于蛋白质和离子之间存在特异性的相互作用。 盐种类的变化不

153、仅会改变蛋白质在疏水柱上的保留值而且还有可能改变分离的选择性2 4 飞 ( 2 ) 盐浓度的影响 蛋白 质采用疏水作用层析分离时， 通常在高盐浓度下吸附低盐浓度下洗脱。 蛋白质在疏水作用层析柱上的吸附量随盐浓度的提高 而增加， 在高盐浓度下甚至以 指数方式提高。 蛋白 质吸附 所需的盐浓度可能随盐种类的不同 而差异较大， 但过高的 盐浓度会促使蛋白 质沉淀p 9 o z 1 1 1 盐 浓度对蛋白 质洗脱的选择性有重要影响， 且依赖于固定相和采用的缓冲盐的种类 2 4 8 1 ( 3 ) p H 值的影响 流 动相 p H 值也 是 影响 蛋白 质 保留 值的 重 要因 素。 通常 p li

154、值提高 会改 变 蛋白 质的1文献综述电 荷而导致其亲水性增加， 从而消弱蛋白 质与配基间的疏水作用， p H 值降低疏水作用 增强 2 1 3 1 . H j e rt e n等发 现许多蛋白 质 在 p H 小于 5 或 p H 大于8 . 5 时 保留 值的 变化比 p H5 - 8 .5 之间 更为剧烈 2 4 0 1 。 由 于 不同 的 蛋白 质在 不同 p H 值下 行为各异， 因 此 疏水作 用层析 分离蛋白 质时需 要对 p H 值进 行优 化。 ( 4 ) 添加剂的影响 一些添加剂可以 用于促进蛋白 质从疏水柱上洗脱， 它们包括与水混溶性醇类( 如乙 醇、异丙醇和乙二醇)

155、、表面活性剂以 及离液剂， 前二者通过与配基竞争疏水配基达到置换结合蛋白 质的效果2 13 ， 后者主要通过改变水分子的有序结构或者蛋白 质的构象， 达到洗脱蛋白质的目的， 然而这往往导致蛋白质的变性， 此方法主要用于疏水作用层析柱的清洗。1 5 .4 . 3温度的影响 均e rt e n 指出 蛋白 质在疏水柱上的结 合是一个嫡驱动的 过程， 根据自 由 能方程:4 G = 4 H一 T d S ，由于相对于嫡变而盐，焙变较小，A G主要取决于正的嫡变因而随温度升高而增大2 4 9 1 。 又由于 容量因 子与自 由 能存在如下关系2 5 0 In k = 1n ， 一 器 ， ， “ 相

156、比 因此， 蛋白质在疏水柱上的保留值随温度升高而增大， 而温度降低疏水结合减弱。然 而也有 相反的 报道 2 5 1 ， 这 表明 温度影响的复 杂 性， 它可能 与温 度变化引 起蛋白 质构象与溶解性的改变有关。 在疏水作用层析分离蛋白质的过程中在不引起蛋白 质变性的前提下适当改变温度可能有助于蛋白 质的洗脱和提高分离效果。 有人尝试了采用低温法来洗脱结合的蛋白 质2 1 3 11 5 ， 5疏水作用层析的应用1 .5 .5 1 生物大分子的分离纯化 疏水作用层析采用了与其它层析不同的分离机理， 是一种与其它方式互补而强有力的分离手段， 它可以与盐析沉淀、 离子交换或凝胶过滤分别组合， 用于

157、多种目 标蛋白 质的 纯化， 包括 血清蛋白 质2 2 0 ,2 5 2 1 、 膜蛋白 2 5 3 1 、 核蛋白 2 5 4 、 受 体 【2 5 5 1 以 及重 组蛋白2 5 6 等0疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索此外它能 用于细胞 2 5 7 1 和核酸2 5 8 ,2 5 9 1 的 分 离。1 .5 .5 .2蛋白 质的折叠复性 变性蛋白 质由 于具有暴露的 疏水表面可以 和疏水配基相结合， 因而将疏水作用层析用于蛋白质复性可能有助于抑制聚集。 耿信笃等将溶菌酶和牛血清白 蛋白 上至高盐 缓冲液平衡的带疏水末端P E G祸联的高效疏水柱上， 采用盐梯度梯度洗脱，

158、 发现保留 值与天然蛋白 质一致， 采用此方法得到的复性核糖核酸酶紫外光谱和圆二色谱和天然蛋白 质一致而与变性蛋白 质显著不同， 这 表明 疏水 作用层析 对蛋白 质有复 性作 用2 6 0 1 。 采 用同 样方 法分 离重组 人Y 一 干扰素工程菌的盐酸弧直接提取液发现， 丫 一 干扰素的活性回收率为稀释法的2 .8 倍， 而且纯度大于 8 5%，显示疏水作用层析具有复性和纯化某些重组蛋白 质的双重功效2 6 0 1 。 白 泉 等 2 6 ” 和 郭 立 安 2 6 2 1采 用 疏 水 作 用 层 析 还 分 别 复 性了 还 原 型 牛 胰岛 素 和 重 组人C H扰素。 刘彤等2

159、5 3 研制了 一种多功能蛋白 增活器， 能同时除变性剂， 分离 杂蛋白以及复性目 标蛋白 质， 实验显示它能完全复性盐酸肌变性的溶菌酶和核糖核酸酶， 当它 用于重 组粒细胞集落 刺激因 子 ( G - G S F ) 的 复 性时， 复性 产物生 物活性 大于常 规 方法3 倍。 采用装填祸联P E G疏水 作用介 质的上 述层 析柱 大规 模复 性重组人Y 一 干 扰 素，复 性 产 物 纯 度 达 到9 5 ， 比 活 为8 .7 x 1 0 7 1 U I m g ， 总 活 性 收 率 比 粗 提 液 提 高 了6 2 倍，显 著 优于 稀释法和其它 层析复 性方法 2 6 4 1

160、耿信笃 等。 5 9 ,2 6 5 1 认为 在高 浓度盐 作 用下的 疏水作 用 可以 推动 变性蛋白 质 吸附 到 疏水作用介质上， 使多数疏水残基与疏水配基接触， 而多数亲水残基朝向流动相， 因而在特异性的接触区疏水作用促使蛋白 质形成局部构象， 在盐梯度洗脱过程中 这种局部构象可以成为折叠起始的 “ 种子” ，它可以发生连续的结构变化，直至离开疏水配基表面而进入流动相。 疏水配基也可能和蛋白质不正确的疏水部位结合而形成错误的折叠“ 种子” ，由 于它是热力学不稳定的， 可以 在层析过程中发生结构变化直至 形成正确的结构。 疏水配基和流动相组成的不断改变不仅提供蛋白 质折叠的能 量还提供

161、蛋白质寻求正确“ 种子” 的机会， 因而疏水作用层析可以 用来促进蛋白 质的 折叠。 另一 方面， 由于复性过程中的聚集主要是源于不正确折叠中间体疏水基团暴露而导致的相互结合， 疏水界面的存在无疑会抑制聚集现象， 从而提高复性效率。 他们将这一方法称为 疏水 作 用一 折叠层析法( h y d o p h o b i c i n t e r a c t i o n - r e f o l d i n g c h r o m a t o g r a p h y ) ， 并 且 认为 疏献综水作用层析复性与人工伴侣法复性蛋白 质有相似的特点:P E G修饰的疏水配基与蛋白 质分子作用形成络合物，

162、然后通过加入化学试剂或改变环境使蛋白质释放并折叠( 2 6 5 1 然而疏水作用层析对蛋白 质的吸附作用和蛋白质的折叠过程是两个相互矛盾的过程。 蛋白质折叠的主要驱动力在于疏水基团的自 发内埋， 疏水界面与蛋白 质的作用无疑减缓了 这种趋势， 从而减少了 折叠复 性的自 由能， 此时蛋白 质的热力学稳定状态应由蛋白 质和层析柱疏水作用的 综合效应决定， 蛋白 质的优势构型不一定是天然活性状态， 采用常规疏水作用层析复性很可能形成错误结构。 疏水作用层析用于蛋白 质复性的前提条件是介质与蛋白质的疏水作用不应强于蛋白 质自身折叠的驱动力， 变性蛋白 质疏水核心的正确形成是折叠成功的关 键。 原理上

163、蛋白 质采用弱疏水作用介质复性的效果可能比强疏水作用介 质好， 文献报道的能复性蛋白 质的疏水作用层析介 质大都采用了温和的疏水配基。 为了避免蛋白质在疏水柱上折叠时形成错误的疏水核心， 有时 在上 柱之前 需要将其 进行预 折叠 1 2 6 2 1 。 当 采用常 规疏水 柱用于蛋白 质复 性时， 可能需要在折叠过程中逐渐减弱基质表面的疏水性和加强蛋白质折叠的趋势。1 .5 .5 .3其它应用 疏水作用层析可用于酶的可逆性固定化， 制备可以循环使用的固定化酶反应器生产目 标 产物(2 6 6 1 ， 此外 还可 用于 脂质体的固 定 化126 7 1 蛋白 质折叠过程中可能形成不同构象的中间

164、体或错误折叠结构， 它们与天然蛋白质相比 通常用于更多的暴露疏水基团，因而可以采用疏水作用层析进行分析和分离1 2 1 1 , 1 6 1 11 .6蛋白 质折叠复性的 检测手段 从事蛋白 质折叠机理的 研究需要了解折叠途径上各个阶段蛋白 质的结构特征。 对于蛋白 质折叠复性的应用研究而言， 选择快速、 灵敏、 准确的分析方法是是优化复性条件和寻找新方法的可靠保证。 因此， 建立准确有效的分析方法和检测手段是 研究蛋白 质折叠复性的 重要条件。 复性蛋白 质的分析和检测主要包括三方面的内 容:二级和三级结构， 结合状态，生 物学功能， 蛋白 质折叠复性的分析手段主要包括生物学方法， 光谱分析、

165、 色谱分 析、疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索电 泳分析等 1 3 0 1 .6 . 1 生 物学 功能 检测 1 3 0 由于蛋白 质的结构和功能紧密相关， 因此判断复性过程是否形成天然结构， 最直接的办法是测定复性蛋白 质的生物学功能。 要了解蛋白酶的折叠过程和复性效果可以测定酶促反应的各个参数并和天然蛋白比 较。由 于许多 酶 促反 应灵 敏而迅速， 因此 许多酶 如溶菌酶5 1 ,9 4 和 碳酸醉 酶2 6 8 1 等被用作蛋白 质折叠机理和复性方法研究的模型蛋白 质。 对于复杂而难以检测的酶促反应可以直接利用蛋白质反应底物或拟似配体考察复性产物的结合能力， 如果复性

166、蛋白 质形成了 天然活性中 心应与天然蛋白 质一样能与天然底物或拟似物结合。 如果能得到某一蛋白 质的 抗体， 可以 采用酶联免疫 ( E L I S A ) 技术 测定天 然结 构的形成，使用的前提是使用的抗体必须能区分天然结构和错误结构。 对于细胞因子等一些重组蛋白 质的复性研究可以 采用细胞培养的方法测定复性产物的 活性， 它们有的具有促使细胞增殖功能， 如生长激素; 有的能抑制细胞生长或病毒扩增，如千扰素。 生物学功能的测定可以定量而直观地反应蛋白 质复性的程度和效率， 然而测定过程中蛋白 质的结构可能发生进一步变化， 特别当微量蛋白加入大量测定缓冲液中时，复性过程可以 继续。 因 此

167、测定过程可能会影响结果的真实性， 尤其是在作复性动力学研究的情况时。为了 去除测定过程的千扰，需要尽可能地避免结构发生 进一步变化，常 用的 方法有 ( 1 ) 采用 低p H缓 冲 液， 如溶菌 酶的 测定 采用p H 6 .2 ， 可以 有效地防 止其进 一 步 复 性 1 0 5 1 : ( 2 ) 测 定 前 将 复 性 蛋白 质限 制 性 酶 解， 使 变 性 蛋白 质 和 折 叠 中 间 体 水解而折叠的天然结构得以 保留，关键步骤是寻 求蛋白 酶的最佳使用浓度 2 6 9 1 6 .2光谱分析 对于无法进行生物学功能测定的蛋白 质， 光谱是鉴定天然蛋白 质、 折叠中间体和变性蛋白

168、质最灵敏和可靠的测定方法。 荧光光谱可以 用于分析很低浓度的蛋白 质。 由 蛋白 质自 身所含的酪氨酸或色氨酸而产生的荧光称为内源性荧光， 由蛋白质和疏水染料结合产生的荧光称为外源性荧光文献综述2 7 0 1 。蛋白 质不同的折叠结构可以 使酪氨酸或色氨酸所处的微环境发生变化，因 而影响内源性荧光的光密度和最大发射波长。 变性蛋白 质和天然蛋白质的荧光密度和最大发 射波长通常具有显著的 差异 1 3 0 1 。 有些蛋白 质可能含有特殊的荧光发射团， 如绿色荧光蛋白 ( G F P ) ， 它们可以 象生物学测定一样用来定量地研究复性过程和收率 【2 7 1 1荧光染 料如a n i l i

169、n o n a p h t h a l e n c e s u l p h o n a t e ( A N S ) 可以 和具 有局部 疏水 性的 蛋白 质( 如 折叠中间体) 结合产生 特定波长的荧光2 7 0 1 ， 而天然蛋白 质和变性蛋白 质一般不与A N S结合，因此外源性荧光是鉴定折叠中间体的有利手段。 园 二 色 ( C D ) 也 可以 用于 复 性 蛋白 质 的 结 构 分 析 1 3 0 1 。 芳 香 基团 附 近的 局 部 改 变 会导致近紫外C D的变化， 近紫外C D可以用来测定三级结构， 可以分辨天然蛋白 质和错误折叠蛋白质。远紫外C D则可以反应折叠过程中二级结

170、构的变化。 核磁共振( N M R ) 是测定溶液状态蛋白 质结构的 有力工具， 它能获得 X 一 射线晶 体衍射的高分辨率。 氢交换和多 位核磁共振波谱( N M R ) 相结合能检测不同 折叠阶段的单个氢键的 位置和稳定性，因 而可以 用来进行折叠动力学研究 2 7 2 1 电 喷 雾一 离子 化质谱 ( E S I - M S ) 技术 可以 精 确测定 蛋白 质的 分子量。 通 过H - D脉冲标记，E S I - MS 可以将天然结构、折叠中间体和变性蛋白 质分开;具有二硫键的蛋白 质， E S I - M S 可以 鉴定含不同 数量 二 硫 键的 结 构 1 2 7 3 1 某些波

171、长如3 4 0 n m .4 5 0 n m或6 0 0 n m的 光吸收可以 反应复性产物的 浊度， 它可以反 应折叠过程中聚集的 情况6 6 1 另 外， 有时 紫外光 谱2 5 9 1 和红 外 光谱 2 7 1 】 也可以 用于蛋白 质 折叠复 性的 研究。1 .6 .3色谱分析 光谱测定一般反映的是折叠蛋白质的总体结构， 它不能区分天然结构、 折叠中间体和变性蛋白 相对数量的差别及其变化， 色谱技术既 可以 用来定量地分析不同 结 构的含量也可以定性地分析折叠蛋白 质的某些特性。 由于色谱过程可能带来结构变化， 因此使用时需要进行控制实验以及采用标准对照。 常用于蛋白质折叠复性研究的

172、色谱方法有反 相色谱、 凝 胶过滤、 离子交 换色 谱以 及 疏水色谱( 1 3 0 1 反相色谱在所有色谱方法中分辨率是最高的，可以分离相差数个氨基酸的蛋白质， 也是蛋白质折叠复性研究应用最广泛的色谱技术。 它的原理是基于疏水性不同的蛋白 质在反相色谱柱上保留值的差异。 同其它色谱相比， 由于反相色谱常采用酸性条疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索件下的离子对色谱， 因而可以 抑制二硫键的形成， 从而避免有些蛋白 质在色谱分离过程中进一步折叠。 在能得到标准天然蛋白质的情况下， 它可以定量地分析复性蛋白质中天然结构的含量。 因此， 在不易找到有效的 测活方法或测活过程复杂的情况下

173、， 反相色谱 可 用作活性测定的 替 代方 法 1 3 9 1 。 蛋白 质折 叠过 程一般伴随 着疏水基团 的 内 埋，因而其表面疏水性逐步减小， 天然蛋白 质一般含最少的暴露疏水表面， 因而在反相色谱柱保留 最弱， 而折叠中间体往往比 变性蛋白 质先洗脱， 所以反相色谱可以 用于折叠动力学的 研究。 对于含二硫键的蛋白 质， 错配的二硫键通常会导致反相行为的改变，将疏基封闭技术和反相色谱相结合可以 有效地探知折叠过程中二硫键的 配对情况。 疏水色谱同反相色谱相似也是基于蛋白 质表面疏水性差异的色谱分离方法， 所不同的是它采用水一盐系统， 其介质疏水性较反相色谱弱， 由于不需要采用有机洗脱剂

174、因而有利于蛋白 质活性的保持。 但疏水色谱分辨率通常低于反相， 而且高盐浓度下蛋白 质的结构可能发生变化，因此它可视为反相色谱的补充手段。 凝胶过滤是基于蛋白质的动力学体积差异的色谱技术， 可以用来分离不同分子量的蛋白 质， 它是检测复性过程中可溶性聚集体的 有力手段， 也可用于研究寡聚蛋白 质亚 基的 结 合情况。 B a t a s 等 。 6 3 1 发 现蛋白 质 在凝 胶过滤 柱上折叠复 性时 动力 学 体 积 有显著的差异， 通常天然蛋白 质具有最紧密的空间结构， 因 而在凝胶过滤柱上的分 配系数最大， 而变性蛋白 质分配系数最小， 折叠中间体的 分配系数基于天然和变性蛋白 质之间

175、。 采用高分辨率的高效液相凝胶过滤色谱可以 用于分析复性产物的天然蛋白 质、 变性蛋白 质以 及稳定中间体的相对含量。李明 等2 7 4 1 采用凝胶过滤方法对复性组分 进行了 分离和鉴定。 另外凝胶过滤技术和多角度激光散色技术结合可以 在线精确测定折叠产物的分子量或动力学体积2 7 5 1 离子交换色谱是基于蛋白 质表面电荷差异的一种分离技术， 如果不同结构的复性产物表面电 荷分布存在差异， 离子交换色谱不乏为快速而廉价的分析手段， 同 需要高压泵的反相色谱相比常压离子交换也具有良 好的分辨率。1 .6 .4电 泳分析 N a t i v e 电泳也可以用于分析复性产物， 不同动力学体积的稳

176、定折叠蛋白质在一定孔径的 凝胶中 可能具有不同的 迁移率而得到分离。非 还原型 S D S - P A G E可以 用来判断 分子间 二 硫键的 形成， 甚至 可以 反 应二 硫键错配导致的结构 变化。 新 近发 展 起来的I文献综述毛细管电泳技术特别是毛细管胶束电泳以及毛细管质谱联用技术既可以快速灵敏地分析不同复性产物中二硫键的数目 甚至混合二硫键，也可以用于折叠中间体的鉴别可溶性蛋白的测定一 般情况下天然蛋白质比聚集体、 折叠中间体或错误折叠蛋白质具有更高的溶解性， 通过离心去除沉淀测得的可溶性蛋白含量一定程度上可以作为反应天然结构含量的指标。由于其快速简便， 此方法可以用于复性方法的快速

177、筛选。 但需考虑到有些错误折叠的蛋白 质以及寡聚体也具有很好的溶解性， 因此还需要采用其他方法分析可溶性成份中天然结构的含量 1 3 0 11 .7文献小结 文献调研显示， 蛋白 质折叠复性的 研究主要包括两个领域和方向， 一个是分子生物学前沿领域的蛋白质折叠机理的揭示， 另一个是生物化学工程领域的蛋白质复性方法的探索。 随着分析技术的发展， 蛋白 质折叠机理的研究取得了初步成果。 已 经揭示了蛋白质从无规则卷曲的伸展状态到有序的空间结构的折叠过程本质上是由疏水作用主导，构象嫡、 氢键、 盐键以 及内聚倾向力( 聚合物的内在特性) 综合作用的肤链坍塌过程。比 较公认的蛋白 质折叠理论一能图漏斗

178、理论一方面指出了蛋白 质折叠途径的多样性，另一方面也暗示了错误折叠的可能性。 细胞内蛋白质折叠的大量辅助因子的存在提示人们， 尽管蛋白质一级结构决定高级结构的理论从热力学上提供了蛋白质折叠的可能性和方向， 然而动力学上的能垒可能导致某些蛋白 质折叠的失败， 一些蛋白质需要分子伴侣和折叠酶的辅助才能成功折叠。 总之， 蛋白质的折叠是一个由 热力学趋使的复杂而多样的动力学过程。目 前折叠机理的研究还仅局限于少数几种模型蛋白 质， 得到的结论还比较片面、 孤立而粗略， 采用高时间分辨率的分析技术而获得连续而详细的单分子折叠过程图谱是折叠机理研究的方向。 蛋白 质体外复性方法的研究是蛋白 质折叠机理在

179、生物技术领域的实际应用， 旨 在提高蛋白 质的正确折叠率， 减少由于聚集和错误折叠导致的目 标蛋白 质损失。 传统的复性方法主要采用液相复性为手段， 通过降 低变性剂去除的 速率、 添加助溶剂的 方式疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复 性的 探索提高了某些模型蛋白 质的复性收率， 提供了 一些成功的 经验， 如添加精氨酸能显著减少许多蛋白质复性时的聚集沉淀。 然而文献报道的传统复性方法大都是基于实验优化的经验性结论， 缺乏系统的研究和理论上的探索， 因此它们具有很大的局限性和蛋白质特异性， 尤其是对于一些多结构区的重组包涵体蛋白质难以奏效。 寻找广泛有效的复性方法的关键在于对蛋自质折叠

180、理论的深入理解和灵活运用。 最近蛋白 质复性方法的研究呈现两大热点， 一是体内折叠体系的体外应用及过程模拟，二是层析复性。 众多的研究显示， 分子伴侣和折叠酶能在体外非特性地催化许多蛋白质特别是复杂蛋白 质的正 确折叠， 它们作用的 特点在于抑制了 蛋白 质折叠时分子间疏水结合的趋势， 同时又能促进折叠过程的延续。 但是天然分子伴侣辅助的蛋白质折叠是一个需要多种辅助因子参与的复杂过程， 显然不利于产业化的应用， 因此模拟分子伴侣和折叠酶的作用机制寻找人工分子伴侣具有极大的 应用潜力。 一些学者采用人工分子伴侣复性模型蛋白 质已 获得了 初步的成功， 但还未见人工分子伴侣大规模用于 成功复性包涵

181、体蛋自 质的报道。因此， 对人工分子伴侣作用机制的深入探讨是其成功应用的 关键。 层析技术用于蛋白 质复性有其内在的 优点， 采用层析技术成功复性蛋白 质的关键在于对层析过程和蛋白质折叠机理的深入了 解， 并将两者有机地结合。 目 前文献报道较多的层析方法是凝胶过滤和金属鳌合层析。 凝胶过滤层析技术由于不涉及基质对蛋白 质的外在作用力， 因此基本上不影响蛋白质自 身的折叠过程， 其缺点是较低的载样量和流速， 不适宜规模化生产。 金属鳌合层析由 于是基于在目 标蛋白 质上附加的组氨酸尾巴与配体的相互作用， 因此基本上也不干扰蛋白 质的折叠， 但过高的 配体密度可能增加了 临 近吸附蛋白 质聚集的

182、 可能性。 离子交换层析利用介质的静电 作用吸附蛋白质， 由 于不干扰作为折叠主要驱动力的疏水作用， 因此蛋白 质在离子交换柱上的 折叠行为可能也是自 发的， 但不排除过强的静电吸附千扰折叠过程中的可能， 另外配基密度也可能促使临近蛋白 质的聚集。 尽管已 经有些文献用离子交换层析成功地复性了 某些蛋白 质， 但未见对其折叠过程及机理深入研究的报道。 蛋白 质采用疏水作用层析复性时其折叠过程不完全取决于自 身的疏水特性， 蛋白 质和介质配基的疏水 作用可能会干扰蛋白 质的复性过程。 有学者采用疏水作用层析成功地复性了 某些蛋白 质， 并且对其机理作了初步探讨， 表明疏水作用层析用于蛋白 质复性

183、的可行性。 然而鲜见其它实1文献综述验室采用商业化疏水作用介质复性蛋白 质的文献报道， 暗示了 这一方法的局限性和复杂性。 综合深入地分析疏水作用层析复性蛋白 质时的各种作用力并揭示其作用机理是将其作为实用的蛋白质复性工具的前提。 总之，蛋白 质折叠过程的复杂性和多样性决定了复性方法的多样性，同时也暗示了它们应用范围的局限性。 建立应用范围广泛、 性能可靠的复性方法， 关键在于对复性方法的机理进行深入研究， 为寻求新的方法提供理论依据。 将人工分子伴侣和层析技术相结合，使其得以规模化应用是今后复性方法的研究重点所在。1 . 8立题依据及实验设计 尽管A n fi s e n的理论指出 变性蛋白

184、 质在体外复性具有自 发折叠形成天然结构的趋势，然而由于蛋白质折叠途径的多样性使得蛋白质体外复性的产物除了天然结构外，还有聚集体和众多的错误折叠体， 而有些多结构域的大分子蛋白质在体外无法形成天然结构， 这表明蛋白质在体外的自由 折叠复性是低效率的. 蛋白质在细胞内的折叠复性效率显著高于体外复性， 表现为不受细胞内高蛋白 浓度的影响， 聚集体和错误折叠结构的避免。 蛋白 质在细胞内复性成功的原因主要在于分子伴侣的广泛存在， 这说明分子伴侣辅助的折叠复性可能在动力学上能帮助蛋白 质进入正确的 折叠途径。 分子伴侣具有特定的区域能通过疏水作用结合变性蛋白 质或折叠中间体 ( 如G r o E L

185、) ，从而防止它们的聚集，而后通过辅助因子 ( 如G r o E S的结合和A T P的水解) 形成亲水环境， 从而促使蛋白质折叠， 这种从疏水结合到亲水释放的过程可能使得蛋白 质经历了一个结构重组的过程， 可能有助于避开折叠途径上的能量陷阱， 这与蛋白 质体外复性的随机疏水坍塌显著不同。 人工分子伴侣的发明为高效的分子伴侣复性方法的大规模应用提供了 广阔的前景。 经典的 人工分子伴侣可以 模拟天然分子伴侣的 疏水结合和亲水释放过程， 然而经典的人工分子伴侣对目 标蛋白 质的捕捉和释放是在开放体系中( b u l k ) 进行的， 这一过程可能依旧 面临聚集的 危险， 所以 文献报道的人工分子

186、伴侣仅适用于少数几种模型蛋白 质，而且得到的复性产物蛋白浓度普遍较低。 层析介质由于具有可以容纳蛋白质分子的大孔， 因而其提供了可以隔离蛋白质分子封闭的环境。 众多的层析复性研究结果显示， 通过层析柱的累积效应可以获得高浓度的复性产物和满意的活性收率， 其效果明显优于溶液复性体系。 然而在非疏水作用的经典层析复性过程中， 变性蛋白质的疏水坍塌也是一个随机过程， 象溶液系统一样疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索也容易导致错误折叠结构的生成。 因此将人工分子伴侣和层析方法相结合用于蛋白 质折叠复性，既有助于得到高浓度的复性产物，又有助于避免错误折叠。 在诸多层析模式中，除反相层析外

187、( 其过高的疏水密度会抑制正常折叠) 疏水作用层析具有能与蛋白质分子暴露疏水表面结合的疏水位点， 因而与分子伴侣一样可能捕捉变性蛋白 质和折叠中间体从而抑制聚集形成， 因而可能具有潜在的人工分子伴侣功能。 本课题首先拟采用疏水作用层析和人工分子伴侣技术相结合复性蛋白 质。 商业化的疏水作用介质由于其容易得到而成为首选对象， 但商业化疏水作用介质通常从分离效率出发而采用了相对较高密度的疏水配基，它们不具有分子伴侣的结构可变性，即 无法通过改变自 身的疏水性来释放蛋白 质和促进其折叠， 因 此蛋白 质和介质的 疏水作用可能阻 碍其正常的 折叠过程， 从而导致错误折叠结构。 本课题拟采用渗透质来改变

188、商业化疏水作用介质表面特性， 使蛋白 质在疏水环境下吸附然后释放至亲水环境中进行折叠复性， 而且由于渗透质具有促进蛋白质水化的功能， 因而其潜在地能加强蛋白 质折叠的 趋势， 从而促进天然结构的形成。 本课题还拟将具有短暂结合蛋白 质折叠中间体功能的P E G分子固定到层析介质上合成一种 “ 温和”的疏水作用介质， 使其在高盐状态下表现为疏水性， 在低盐状态下表现为亲水性， 从而避免商业化疏水作用介质抑制蛋白 质折叠的缺陷。 此外， 本课题拟将人工分子伴侣固定到层析介质上， 从而实现高蛋白浓度和高活性收率的复性。 人工分子伴侣通常由表面活性剂和环糊精两种成份组成， 本课题拟分别将此两种物质作为

189、层析固定性配体。 本课题尝试合成可溶性0 -环糊精聚合物，旨在提高蛋白 质从与表面活性剂形成复合物中 释放的能力， 而且由于此聚合物本身具有柔韧性， 因而可能进一步减少蛋白 质分子相互靠近的机会。 鉴于经典人工分子伴侣的捕捉过程受表面活性剂种类的局限性， 本课题将表面活性剂固定到层析介质上， 合成一种兼具疏水作用层析和分子伴侣特性的新型层析， 使目 标蛋白 质用疏水作用层析的方式吸附到柱上，然后采用环糊精类化合物洗脱。2甘油介导的疏水层析复性溶菌酶2甘油介导的疏水作用层析复性溶菌酶 鸡卵清溶菌酶 ( 简称溶菌酶， l y s o z y m e ) 是一种含1 2 9 个氨基酸的 碱性蛋白 质

190、， 分子 量 为1 4 3 0 0 ， 等电 点 为1 0 .51 1 ， 含 有四 对 二 硫 键， 稳 定 性 较高 2 7 7 1 。 溶 菌 酶由 a 和 p两个折叠区域组成， 前者主要以 a 螺旋为主，后者主要含p 折叠。 溶菌酶能 破坏原核细胞的 细胞壁 2 7 8 1 ， 因 此医 学上可 用于 抗菌 消炎 药 2 7 9 1 。 而在生 物学 研究中， 它也常 用于细胞破碎。 溶菌酶是研究蛋白质折叠复性的一种重要的模型蛋白 质。 溶菌酶折叠涉及两条平行的 途径， 3 0 % 的分子可以 快速形成近天然状态， 含稳定的 a 区和p 区的 折叠中间体，而7 0 % 的 分 子 先

191、形 成 较 稳 定 的 a 区 而 缺 乏 稳 定 的 p 区 结 构 2 8 0 。 复 性 动 力 学 研 究 显 示 ，折叠与聚集的竞争是导致溶菌酶复性收率低的原因， 它随起始蛋白 浓度和复性终蛋白浓度的提高而显著下降2 8 11 溶菌酶的折叠速率显著低于聚集速率， 其活性恢复半数期为4 . 5 m i n ,而聚集反 应1 m i n 内 则 基本完 成2 8 2 溶菌酶被广泛用于探索复性新方法， 许多新建立的复性系统都采用溶菌酶作为研究对象。 成功地复性溶菌酶的复性新方法有连续流加9 4 1 、 切向 过滤2 8 3 、固 定化分子伴侣 13 3 1 、 人工 分子伴侣 1 4 2

192、, 1 4 4 1凝 胶过 滤 1 6 3 , 1 6 8 、 离 子交换层析 1 7 5 1 以 及固 定 化脂 质体层 析 12 7 等 。 原则上疏水作用介质和分子伴侣一样能捕捉具有暴露疏水部位的变性蛋白质和折叠中间体从而抑制聚集发生， 因而其潜在地可以用于蛋白 质的复性。 有学者采用带聚乙二醇长链的疏水作用介质尝 试复性了 干扰素2 5 9 1 ， 然而还未见文献报道用商业化疏水作用介质复性蛋白 质， 这可能是由 于商业化普通疏水作用介质出于蛋白 质分离的需要 往往采用较高密度的配基， 因而它与蛋白 质可能 会产生多 位点 疏水作用从而抑制蛋白 质的正常折叠过程。 商业化疏水作用介质不

193、具有分子伴侣的结构可变性， 即无法通过改变自 身的疏水性来释放蛋白质和促使其折叠， 而且蛋白质在商业化疏水作用层析柱上洗脱复性过程中， 可能有重新变性的 危险1 1 9 0 渗透质能促进蛋白 质的水化而提高 蛋白 质的 稳定 性1 0 0 , 1 0 1 ，同时 它能 促使蛋白 质的 变性态去稳定 化1 1 0 2 - 1 0 4 1 因 而 也具有 促进 折叠的 效果 1 0 5 . 11 0 ， 然而它本身 并不 能 抑制 聚集。 可以 设 想， 如果 将 疏水 作 用层析和渗透质相结合， 使蛋白质在折叠早期的中间体和疏水配基相互作用， 抑制分子疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性

194、的探索间聚集; 而随着折叠过程进行引入渗透质逐渐增强环境的亲水性， 一方面加强蛋白 质的疏水坍塌趋势促使蛋白 质表面的水化， 另一方面将蛋白 质包裹在亲水环境中 避免疏水配基对蛋白 质的 变性作 用就有可能同 时达到抑制聚集和促进折叠的效果。 本实验采用溶菌酶作为模型蛋白质， 考察疏水作用层析对复性过程的影响， 然后设法引入一种渗透质一 甘油来改变疏水作用介质表面特性， 使蛋白质在疏水环境下吸附然后释放至亲水环境中进行折叠， 从而建立一种甘油与商业化疏水作用层析相结合的复 性系统， 并对影响此复性系统的因素进行考察， 最后对此系统的作用机理作了 初步探讨。2 . 1实验材料 溶 菌酶购于B i

195、 o z y m e 公司， M . ly s o d e i k t i c u s ( 微黄球菌) 、 二 硫苏糖醇 ( D T T ) 购 于S i g m a 公司， P o r o s P E 灌注 疏水作用介 质购于A p p l i e d B i o s y s t e m公司， H i t r a p P h e n y lS e p h a r o s e H P ( I m l ) , H i t r a p B u t y l S e p h a r o s e F F ( I m l ) a n d H i t r a p O c t y l F F ( I m l

196、) , S u p e r d e x7 5 c o l u m n ( 1 0 x 3 0 0 m m内 径 ( i .d ) ) ， A K T A p u r i f i e r 1 0 , u l tr o s p e c t 2 0 0 0可 见紫 外分 光光度计均为G E H e a lt h c a r e 公司产品其他试剂均为分析纯。2 . 2实验方法2 .2 . 1溶菌酶的还原变性 5 0 m g 溶菌 酶用1 m l 变性剂 ( 6 M盐 酸 肌( G d n - H C I ) , 1 0 0 m M T r i s - H C I , 1 m ME D T A , 1

197、5 0 m M D 代 州8 .5 ) 溶 解， 于3 7 0 C 温 育3 h r ， 通 过 活 性 测 定 确 保其 充 分 变 性 ，然后用上述变性剂稀释至不同 浓度。2 .2 .2稀释复性 将 上 述2 0 闪不同 浓 度的 变性 溶 菌酶 与I m l 的 复 性 缓 冲 液 ( 1 0 0 m M T r i s - H C I , 1m m E D T A , 0 .0 1 %P - r1 t 基乙 醇( (3 - m e c a p to e th a n o l , - M E ) ( v / v ) , p H 8 .5 ) 在e p p e n d o f 管中迅速混合

198、， 过夜后测定复性产物的活性， 同时测定相同 浓度下变性前溶菌酶的活性，前 者 与 后 者 的比 值即 为复 性收 率。 将 复 性蛋白 于1 2 0 0 0 r p m离 心1 0 m in , 测 定 上 清蛋白 含量， 用其去除复性产物活性即得比 活。 上清蛋白 含量与变性前蛋白 含量的比值即为蛋白收率或质量收率。 在上述复性缓冲液中 添加甘油至不同终浓度， 然后按上述步骤复性。2甘油介导的疏水层析复性溶菌酶2 .2 .3疏水作用层析穿过复性 将1 0 0 1r 1 的1 0 m g / m l 变性 溶菌酶分别 上 至 用复 性缓 冲液 平衡( 1 0 0 m M T r i s -

199、H C I ,1 m M E D T A , 0 . 0 1 % R - M E ( v / v ) , p H 8 . 5 ) 的P o r o s P E ( l m l ) , H i t r a p B u t y l S e p h a r o s eF F ( l m l ) , H i t r a p O c t y l S e p h a r o s e F F ( l m l ) , H i t r a p P h e n y l S e p h a r o s e H P ( l m l ) 疏水柱以0 . 2m l / m i n 流 速洗 脱， 最后用8 M脉， 5 0

200、 m M T r i s , p H 8 . 5 再生 上述 层析柱。 收 集洗 脱峰，测定其活性和蛋白含量，并计算其比活。 上述过程在P o r o s P E 疏水柱( 1 2 8 x 1 0 m m 内 径( i .d .) , 1 0 m l ) 上进行，然后在洗脱峰中加入甘油至不同终浓度。另外在复性缓冲液中加入不同浓度的甘油重复上述过程。2 .2 .4疏水作用层析吸附一洗脱复性 P o r o s P E 柱( 1 2 8 x 1 0 m m i .d ., 1 0 m l ) 先 用高 盐 缓冲 液A ( 3 .6 M困H 4 ) 2 S O 4 , 5 0 m mT r i s

201、- H C I , ( m M E D T A , 3 m M G S H ,0 .3 m M G S S G p H 8 . 5 ) 平衡， 然后运行A 一变性剂( B : 8 M u r e a , 5 0 m M T r i s - H C I , 1 m M E D T A , 3 m M G S H , 0 .3 m M G S S G p H 8 . 5 ) 2 m l 梯度， 在柱上端建立一个从变性剂到高盐的小体积梯度， 从而避免变性蛋白 质被疏水柱吸附 前在高 盐环境下发 生沉淀， 然后 进样1 0 0 闪变性 溶菌 酶， 并用A冲 洗1 个 柱体积 ( C V ) 以 除 去

202、 变性剂并 促使 变 性蛋白 质完 全吸附。 洗脱时， 先用复 性缓冲 液C ( 1 0 0 M MT r i s - H C I , 1 m M E D T A , 0 .4 M ( N H 4 ) 2 S O 4 , 0 .0 1 %p - M E , p H 8 .5 ) 冲 洗层析柱降 低盐 浓度，接着运行4 m l C - B 和B - C脉梯度解吸结合的蛋白 质， 然后用C继续洗脱， 使解吸的蛋白 质在洗脱过程中的变性剂梯度环境下逐渐折叠复性。 分别改变变性溶菌酶的浓度、上样体积、 c中硫酸钱浓度以 及c至B的服梯度体积，进行上述操作。 在复性缓冲液c和洗脱峰中分别加入甘油至不同终

203、浓度，进行上述操作。2 .2 .5溶菌酶活性的测定 按 照 文 献 (2 8 4 1 中F A T 法， 稍作 改 进。 用工作 缓冲液( 6 0 m M K 2 P 0 4 - H 3 P O 4 , p H 6 . 2 ) 悬 浮微黄球菌， 过 滤后 用缓 冲液 将菌液在4 5 0 n m的吸收值调至0 .6 5 0 .6 7 ， 取3 m l 菌液加入L e m比 色皿中， 记录4 5 0n m的 吸 光度E l ， 然后往菌液中 加入1 0 川用工作缓 冲液预 稀释至 约5 0 p g / m l 的 样品，迅速混合， 2 m i n 后读取吸光值E 2 。按如下公式计算活性:疏水作用

204、层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索1 0 0 x ( E l - E 2 ) - F y P . 一 U l m2 x 0 . 0 0 1 底物溶液的吸光度 2分钟后反应液的吸光度El班2电式0, 0 0I . -1 0 1 ) 为了确保复性完全夜后测活。 反应时间 ( 分钟) I F .工 卫一 使吸光度降低0 . 0 0 1 i m l 溶液中 含1 0 0 个1 0 川除进行复 性动力学研究外， 所有复性样品均在室温放置过2 2 石蛋白浓度测定 参考B r a d f o r d 法 2 9 5 1 进 行。 ( 1 ) 工作 液的 配制: 称取1 0 0 m g 考马 斯 亮蓝

205、G 2 5 0 , 溶于5 0 m l 9 5 % 乙 醇溶液中，待完 全溶解后加入1 0 0 m l 8 5 % 磷酸， 用蒸馏水定容到1 0 0 0 m l ，置暗处存过夜， 用滤纸过滤后备用. ( 2 ) 蛋白 质浓 度的 测定: 用。 . 1 5 M N a C l 配制0 . 1 , 0 .2 . 0 .3 , 0 .4 , 0 . 5 m g / m l 的 标准溶 菌酶溶 液， 各 取1 0 0 闪加入 至3 m l 上 述工作 液中， 振荡 混匀， 放置5 m i n 后以 工作液为对照于1 h 内 测定5 9 5 n m处吸光度， 每一浓度做3 个重复样，取平均值。 将吸光度

206、对浓度回归得标准曲 线方程。 用同样的方法， 采用样品中 所含缓冲液为对照测5 9 5 n m光密度值，用回归方程算出蛋白质的浓度。2 .2 .7凝胶过滤分析 取5 0 w 1 复 性 溶菌酶上至 用 流动 相( 4 M u r e a , 2 0 m M N a 2 H P 0 4 , p H 7 . 0 , 0 . 1 6 MN a C l ) 平衡的S u p e r d e x 7 5 ( I O x 3 0 0 m m i .d .) 柱，以0 . 5 m l/ m i n 洗脱。2 .3实验结果及讨论2 .3 . 1疏水作用层析介质对溶菌酶复性过程的影响 如 表2 . 1 所示，

207、当 在1 0 m g / m起始 浓度 和2 0 0 g / m l 终 浓 度条件下 采用 稀 释复 性溶菌酶时，发现有大量沉淀生成，其总活性收率仅为2 6 . 8 ，将稀释复性产物离心，2甘油介导的疏水层析复性溶菌酶其上清为可溶性蛋白， 回收率仅为3 2 .6 。 这表明稀释复性时折叠和聚集是一个竞争性过程，在高蛋白浓度下 大部分蛋白质发生聚集沉淀，聚集沉淀导致活性收率降低这一点与文献报道是一致的。另一方面，复性得到的可溶性溶菌酶比活回收率却有8 2 . 2 %， 说明大部分可溶性蛋自形成活性结构， 同时也表明稀释复性的溶菌酶结果要么正确折叠，要么聚集沉浪，而不会形成活性较低稳定的折叠中间

208、体。 表21疏水作用介质类型对溶菌酶复性效果的影响T a b l e 2 . 1 E ff e c ts o f H I C me d i a t y p e s o n r e f o l d in g e f fi c ie n c y o f ly s o z y me复性方式活性收率可溶性蛋白回收率比活回收率 Di l u t i o nPo r o s P E c o l u mnB u ty l F F c o l u m nO c ty l F F c o l u m nP h e n y l I I I ? c o l u mn_(% )26.8_(% )32.6_( )8 2

209、 .26 977 4 . 755 . 77 9 . 5:.:8 1 . 2: : 然 而将1 0 0 川变性 溶菌 酶上 至用复 性 缓冲液 平 衡的 不同 类型I M I 疏水 作用 层析柱上，再用复性缓冲液洗脱， 得到的溶菌酶洗脱峰活性回收率、 蛋白回收率以及比活回收 率与 稀 释复性 截然 不同。 在 其蛋白 终 浓 度高于 稀释复 性 样 ( 大 于3 0 0 卿m l ) 的情况下， 疏水作用层析得到的复性溶菌酶峰液是澄清的， 且总蛋白回收率均显著高于稀释 复 性， P o r o s P E ( 1 m 1) , H i t r a p B u ty l F F ( 1 m 1 )

210、 , H it r a p O c t y l F F ( I m l) R H i tr a pP h e n y l H P ( 1 m l) 的蛋白 回 收率 依次为6 9 . 7 % 、 7 9 .5 % 、 8 1 . 2 0l o , 8 9 .2 ， 这 说明 疏水作用层析可以抑制溶菌酶复性过程中的聚集沉淀。 为了推测上述疏水柱疏水强度的差异， 将 天然 溶菌酶 在高 盐缓冲 液A ( 5 0 m M T r i s , l m M E D T A , 1 . 6 M ( N H 4 ) 2 S 0 4 ,P H S . 5 )下吸 附到 疏水 柱上， 用5 C V A - B

211、( 5 0 n 1 M T r i s , I m M E D T A , p H 8 . 5 )的 梯 度洗 脱， 分 别得到的色谱图如图2 . 1 所示。由 天然溶菌酶的保留值可知， 保留值越大的介质疏水性越强，所以上述层析介质的疏水强度依次为P o r o s P E B u t y l F F O c t y l F F P h e n y l H P .从而表明疏水作用介质基质聚集沉淀的能力随疏水强度的增大而提高。 但是疏水作用层析复性溶菌酶的活性收率却呈现无规律的变化，从 P o ros P E到P h e n y l H P 的活性回收率依次为5 2 %, 5 5 .7 % ,

212、5 9 . 3 % 和5 5 . 9 %,而其比活依次为疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索夕簇才1 2 3 4 5 R e t e n t i o n v o lu m e 咬 ml) 图2 . 1天然溶菌酶在不同疏水柱上的洗脱色谱图F i g . 2 . l E l u t i o n p r o f i l e s o f n a t i v e l y s o z y me i n d i ff e r e n t H I C c o l u mn s . 1 0 0 1 1 1 n a t i v e l y s o z y m e o f1 0 m g l m l w

213、a s in j e c t e d i n t o c o l u mn s p r e - e q u i l ib r a t e d b y Al ( 5 0 mM T r i s , 1 mM E D T A , 1 . 6 M( N H 4 ) 2 S O 4 ,p H 8 .5 ) a n d t h e n w a s e l u t e d b y g r a d ie n t o f 5 c o l u m n v o lu m e ( C V ) f r o m A 1 t o B 1 ( 5 0 m MT r is , l mM E D T A， p H 8 .5 )

214、o n A K T A P u r if i e r . T h e fl o w r a t e w as 0 .2 m l / m i n . 1 , 2 , 3 ,4 i n d i c a t e d P o ro s P E5 0 ( l m l) , H i t r a p B u ty l S e p h a r o s e F F ( 1 m 1 ) , H i t r a p O c t y l S e p h a r o s e F F ( l m l) a n d H i t r a p P h e n y lS e p h a r o s e H P ( I ml) r

215、 e s p e c t iv e l y .7 4 . 7 % , 7 0 %, 6 9 . 8 % 和6 2 . 7 %， 显然随介质疏 水性的 增加比 活降 低。由 于比 活高低直接反应了溶菌酶结构的正确程度， 因而可以推测随介质疏水性增强复性溶菌酶的正确折叠越困难，而且上述疏水作用层析复性的溶菌酶比活收率均显著低于稀释复性，说明疏水 作用层析尽管可以抑制聚 集沉淀， 却导致溶菌酶错误折叠。 折叠中间体由于具有 含有暴露 疏水 基团 而具有强烈的聚集倾向， 和许多 助溶剂相似， 疏水作用层析介质可以 通过疏水作用结合折叠中间体， 而且层析介质的网 状结 构具有空间阻隔效果， 减少了中间体

216、相互靠近的机会， 从而能抑制聚集产生。然而蛋白质折叠是一个由自由能驱动的疏水坍塌过程， 介质与蛋白质间的疏水结合作用可能改变蛋白质折叠过程的自由能，从而导致错误折叠。2 .3 . 2 ) O 梯度解吸甘油介导下洗脱的疏水作用层析复性溶菌酶 上述结 果表明 商业 化疏水作 用层析可以 有效地抑制蛋白 质复性过程中的聚 集， 然而却无法实 现天 然结构的恢复。 解决疏水作用层析抑制聚集和错误折叠矛盾的关 键在于在折叠过程中逐渐提高环境的亲水性。 渗透质由于能促进蛋白质表面的水化从而能稳定天然蛋白 质【 1 0 0 ,1 0 11 ， 在折叠过程中引 入渗透质， 它可能同 样具有加强蛋白 质水化，2

217、甘油介导的疏水层析复性溶菌酶入方式的复性结果。 当甘油加入至疏水洗脱峰时，活性回收率随甘油浓度的增加而仅有轻微的提高，在4 0 %甘油条件下，活性回收率从5 0 .9 % 提高到5 8 .8 ，表明甘油能一定程度上提高洗脱复性溶菌酶的活性， 但无法使其恢复天然结构。 这可能是由 于柱后复性峰可能己 经形成较稳定的错误疏水核心， 添加甘油不能使其发生结构重排， 仅能增加局部结构的紧密度。 甘油作为复性缓冲液的添加剂时， 活性回收率随复性缓冲液中甘油浓度的增大而显著提高，在5 0 % 甘油时，活性回收率达到8 6 .3 ，复性溶菌酶达到了天然比活。 这说明甘油可能需要参与疏水作用层析辅助的蛋白 质

218、整个折叠过程。 在脉梯度解吸的过程中JR浓度逐渐降低， 甘油浓度逐渐升高， 蛋白质逐渐折叠。 在低浓度甘油条件下， 随着脉浓度降低蛋白 质处于介质疏水作用较强的 环境中开始折叠， 因而还可能形成部分错误结构，而高浓度甘油在脉梯度变化过程中建立了一个快速的亲水环境，有利于解吸的蛋白质随着服浓度的降低进行正确折叠， 而且折叠后期高浓度的甘油既可以进一步促进疏水基团内埋，还可以有效地将复性中的蛋白质相互隔离。/oo90eo不二一 一 - =. 一。706050钓302010 (艺Ple一卜者之书t o加3 0 4 0 s oG ly c e r o l c o n c e n t r a t i o

219、 n ( % ( V M) 图2 .4 . 甘油不同添加方式对疏水作用层析复性溶菌酶效果的影响F ig .2 .4 . E ff e c t s o f v a r i o u s g l y c e ro l a d d i t i o n w a y s o n r e f o l d i n g y i e l d o f l y s o z y m e b y H I C . a , g l y c e r o lw a s a d d e d i n t o e l u e n t ; b , g l y c e r o l w a s a d d e d i n t o p o o

220、 l e d fr a c t i o n .疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索R 日 . 已 团， 目 u n .侧 忿 图2 . 5不同甘油浓度下疏水作用层析复性溶菌酶凝胶过滤分析F i g . 2 . 5 S E C a n a l y s i o f re f o l d e d l y s o z y m e w i t h H C a t d i ff e r e n t g l y c e r o l c o n c e n t r a t i o n s .w i t h o u t g l y c e r o l ; ( b ) s a m p l e w i

221、t h 2 0 % ( V / V ) g l y c e r o l ; ( c ) s a m p l e w i t h 5 0 % g l y c e r o l . *ly s o y z m e .( a ) s a m p l e， r e f o l d e d 图2 . 5 为在洗脱液中添加不同浓度甘油疏水作用层析复性的溶菌酶凝胶过滤分析图谱。为了防止折叠中间体在层析分离过程中 聚集沉淀，流动相加入4 M脉。在无甘油情况下， 疏水作用层析复性的溶菌酶有少量可溶性聚集体存在， 说明疏水作用层析导致的错误折叠倾向于形成可溶性聚集体。当2 0% 甘油添加时，可溶性聚集体显著减少，

222、5 0 % 甘油条件下聚集体消失。2 .3 . 5复性缓冲液离子强度对复性的影响 在经典的 疏水作用层析分离过程中， 硫酸钱可以 促进蛋白 质的吸附 1 9 0 1 ， 它也用作稀释复性的添加剂2 8 6 1 。 在甘油介导的吸附一 洗脱流水作用层析复性模式中，复 性缓冲液中硫酸钱的浓度对活性回收率有显著性影响。 如图2 .6 所示， 随洗脱液中硫酸钱浓度的提高活性收率逐渐增大， 0 .4 M硫酸按时活性回收率最高，而过高浓度硫酸钱降低活性收率。 而不同浓度的硫酸按下， 复性溶菌酶在疏水柱上保留值无明显差异。 硫酸钱在此处的作用与疏水作用层析分离的机理显然不同， 硫酸钱的添加提高了溶液的表面张

223、力， 从而可以加速变性蛋白质的疏水坍塌， 同时它可以使折叠蛋白质表面的离子化， 从而促进其水化。 而过高浓度的硫酸钱可能破坏离子化层， 使蛋白质脱水而导致错误折叠。2 .3 .6起始蛋白浓度和上样量对复性效果的影响 为了考察甘油介导脉梯度洗脱疏水作用层析方法的复性能力， 以判断其大规模放大的应用潜力， 有必要研究起始蛋白 浓度和上样量对复性效果的影响。 如图2 .7 所示，2甘油介导的疏水层析复性溶菌酶叫 ，/一:厂0 1 0我2 0 . e n 月0 . 9 A m m o n i a S u l f a t e C o n c e n t r a t i o n ( M ) 图2 . 6硫

224、酸铁浓度对甘油介导疏水作用层析复 性溶菌酶的影响F i g .2 . 6 E f f e c t o f a m m o n i a s u l f a t e o n a c t i v it y y ie l d o f r e f o l d e d l y s o z y m e b y H I C稀释复性活性回收率随起始浓度提高 迅速下降， 与 文献报道的一级折叠反应和高 级聚集反应的结论是一致的。 而在1 0 0 川上样体积的条件下， 疏水作用层析复性溶菌酶的活性回收率基本不受起始蛋白 浓度影响， 这表明聚集反应被成功地抑制。 同时也暗示了 可以 采用高 浓度样品进样来提高复性规模

225、。:i 执 :一 又o， 心2 0 3 0 4 e朋i n i t i a l p r o t e i n c o n c o n t r a t i o n ( mg l m l ) 图2 . 7起始蛋白 浓度对甘油介导疏水作用层析复性溶菌酶的影响F i g .2 . 7 E f f e c t o f i n i t i a l p r o t e i n c o n c e n t r a ti o n s o n a c t i v i t y y i e l d o f r e f o l d e d l y s o z y m e 妙d i l u t io n a n d b y

226、g l y c e r o l - a s i s t e d H I C . a , G l y c e r o l - H I C - a s s i s t e d r e f o l d i n g a t v a r i o u s i n i t i a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s ; b ,2 0 u l u n f o l d e d ly s o z y m e o f d i ff e r e n t c o n c e n t r a t i o n s w a s a d d e d i n t o I m l

227、 r e f o l d i n g b u ff e r ( 1 0 0 m MT r i s - H C l , I m M E D T A , 3 m M G S H , 0 . 3 m M G S S G , p H 8 . 5 )呸 些些 ; 星 折 及 其 相 盖 技 术 辅 助 蛋 白 质 折 叠 复 性 的 探 索 图2 . 8为 在5 0 m g / m l 起始 浓度下， 不同 上样体积导 致不同 上样量对活性回 收 率的 影响。 在1 m g 溶菌酶 l m l 介质 上 样量内 ， 活 性回 收率 变 化不大。 从图2 . 9 可以 看出 ，上样量增大时， 复性色谱图洗

228、脱峰体积变化不大， 而峰高增加明显， 这说明高上样量可以 得到高 浓度的复性蛋白 质。 在1 m g / m l 上样量条件下，活性回收率为8 5 % ， 洗脱峰 蛋白 浓度达到1 .2 m g / m l ， 说明 本复 性 方法不失为 制 备复 性 溶菌酶的 有力工 具。然而当 上 样量大于2 m g 溶菌 酶 I m l 介质时， 活性回 收率显 著下降 ( 图2 . 8 ) ， 在2 .5 m g / m l上样量时， 高盐吸附的穿过峰突然急剧升高， 分析发现有蛋白穿过， 且有大量沉淀出现， 而其洗脱峰面积没有显著增加， 这表明疏水作用层析柱发生过载。 过高的上样量导 致蛋白 质在疏水

229、柱上的高密度分布， 这样无疑增加了 蛋白 质相互聚集的 机会， 从而降低了正确折叠率。0090叻7060的40加功 怒叼T。叫熟卜护卜叫。Vtoal o a d i n g m a s s ( m g p r o t e i n / m l s u p p o r t )图2 . 8上样量对甘油介导疏水作用层析复性溶菌酶效果的影响F i g ,2 . 8 E f f e c t o f l o a d i n g m a s s o n a c t i v i t y y ie l d o f l y s o z y m e re f o l d i n g b y g l y c e r o

230、 l - as s i s t e d H I C .R e f o l d i n g w as c a r r i e d o u t a t d i ff e r e n t l o a d i n g m as s w i t h t h e p r o c e s s d e s c r i b e d i n F i g .2 . 6 . 1 0 0 p l , 2 0 0 p i ,4 0 0 p 1 a n d 5 0 0 1 il u n f o ld e d l y s o z y m e o f f i f t y m i l l i g r a m p e r m i

231、l l i l it e r w a s i n j e c t e d i n t o c o l u m nr e s p e c t iv e ly .2 .3 . 7 甘油介导服梯度疏水作用层析复性溶菌酶作用机理的探讨2 . 3 .7 . 1甘油介 导下吸附一 洗脱模式的 疏水作用层析的人工分子伴侣角色 为了 探讨甘油介导下服梯度洗脱的疏水作用层析复性溶菌酶的 机理， 我们还考察了 溶菌酶在甘油介导下的直接稀释复性和在疏水柱上穿过复性的情况。 如图2 . 1 0 ( l )2甘油介导的疏水层析复性溶菌酶- e - - o .s m gy w p s c id n p s-1 M 酬 I

232、 N P 司 in g s之5 M W m i P a e k i n g s村纵川剧卿黝潮撇瀚姗姗伽。 冬E嗜咤Oi s 湘加只 翻. 川 。 “ 帕. 呱州 川 . 目 1 图2 .9不同上样最对甘油介导疏水作用层析复性溶菌酶的洗脱图谱F i g . 2 ,9 C h r o m a t o g r a m s f o r l y s o z y m e r e f o l d i n g o n P o r o s P E H I C ( 1 2 8 m m x l O m m I . D ., 1 O m l ) a s s i s t e db y g l y c e r o l a

233、 t d i ff e r e n t lo a d i n g m a s s . 1 0 0 , 2 0 0 a n d 5 0 0 1 1 d e n a t u re d l y s o z y m e o f 5 0 m g / m l w a s i n j e c t e dre s p e c t i v e l y , 气b r e a k - t h ro u g h p e a k s , * + , e l u t e d a n d re f o l d e d p e a k s o f l y s o z y m e二万 幽.翻叨争七，。“巴考，一名.。三u色哪

234、- . -w 喊 咨阮刁 1 目 C份 心一口 恤们 、 、 一r ，国承七皇。e.二巨 心鑫一 一 一 一 一 朴 钾 朴 浮 盛艺勺下东力名是一 幽 一勿a 6 5 c a c b t *m w wy- 卜t v i E s 叫盆 即 曰 Y.越肠扣. t i a -自 映 0 x n 渊咐犯肠翻毋脚口 N c a , c e m目a n t 州叫 ) 图2 扔甘油对稀释复性和穿过 疏水作用层析复性溶菌酶的影响F i g .2 . 1 0 E ff e c t o f g ly c e ro l a d d it io n o n r e f o l d i n g e f f i c i

235、 e n c y o f ly s o z y m e妙 d i l u t i o n a n d b yp a s s i n g - t h r o u g h H I C . ( 1 ) A c t iv i t y y i e l d可 r e f o l d i n g妙 d i l u t i o n a n d b y p a s s i n g - t h r o u g h H I C ; ( 2 )S p e c i f ic a c t i v i t y r e c o v e ry a n d m a s s re c o v e r y f o r p a s s

236、 i n g - t h ro u g h H I C .所示， 甘油作为 稀释复 性添加剂时，当 甘油 浓度低于2 0% 时， 活性回收率随甘油 浓度的 增加而提高， 2 0 % 甘油浓度下活性收率为3 2 .9 %;当 甘油浓度大于2 0 % 时， 活性回收率随甘油浓度提高而下降。此外甘油介导的稀释复性过程中仍有大量沉锭生疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索成， 这表明甘油不是聚集抑制剂， 它可能是一种折叠促进剂， 通过加强变性蛋白质的疏水坍塌趋势而促进溶菌酶的正确折叠。 而过高的甘油浓度由于具有很高的粘度， 可能限 制了 肚链的自由 运动， 而且可能提高疏基的p K a值，

237、从而不利于二 硫键的正确配对p o s h 当甘油作为复性缓冲液的添加剂穿过复性溶菌酶时， 活性回收率随甘油浓度的变化出现多相特征:当甘油浓度低于2 0%时，随甘油浓度提高其活性收率下降，而在2 5% 甘油时，活性回收率又提高到5 9 .7%， 甘油浓度进一步提高时活性回收率又开始缓慢下降， 显然采用穿过模式的甘油介导疏水作用层析的复性收率显著低于吸附洗脱模式。蛋白定量发现，其蛋白回收率随甘油浓度的变化的趋势呈 “ V ”字形，低于2 0 % 甘油时，蛋白回收率随甘油浓度增加而减小，高于 2 0%甘油时， 蛋白回收率随甘油浓度增加而提高。 其比活回收率随甘油浓度的变化出现极大值， 2 0 %

238、甘油下复性的溶菌酶达到天然比活， 甘油浓度的降 低和提高都使比 活回收率下降( 图2 . 1 0 ( 2 ) ) 。 这种现象表明， 穿过疏水模式可能与稀释方式相似， 变性溶菌酶在层析柱中以自由坍塌的方式进行折叠， 外在疏水配基的存在可能通过疏水作用短暂地结合中间体， 因而可以 抑制聚集， 但同时也阻碍了天然结构的恢复。 随着甘油浓度的提高， 介质的疏水配基被逐渐掩盖， 蛋白质正确折叠的倾向增加， 另一方面疏水作用层析抑制聚集的效果同时也逐渐减弱， 导致蛋白回收率降低而比活逐渐提高。 高浓度甘油由于具有较高的粘度， 因而减缓了 肤链相互靠近的倾向， 因而可以部分抑制聚集， 但它可能同时也妨碍了

239、 肤链的自由 运动而不利于自 发形成正确的疏水核心。 而如前所述当采用吸附一 洗脱模式时， 活性收率随甘油浓度增大而单调增加， 显然此种方式的复性机理与穿过方式截然不同。 在吸附洗脱模式下， 变性蛋白 质在高盐下吸附到疏水柱上， 而后脉梯度释放结合蛋白质， 释放的蛋白质在从脉到适当浓度的甘油环境中形成正确的疏水核心， 随着甘油浓度的提高， 其折叠趋势愈加明显。 就本质而言， 变性蛋白质的吸附过程相当于分子伴侣对目 标蛋白 质( 新生肤或折叠中间体)的 捕捉过程; 服梯度从疏水柱上解吸结合蛋白 质的 过程与G r o E L / G r o E S系统中 伴随A T P水解的G r o E S吸

240、附导致蛋白 质的释放过程类似;甘油介导形成的亲水环境相当于分子伴侣结构变化后形成的亲水环境。 因此， 甘油介导下的服梯度洗脱疏水作用层析是将甘油促进折叠的能力和疏水作用层析抑制聚集的能力加以综合， 从而模拟了分2甘油介导的疏水层析复性溶菌酶子伴侣复性蛋白 质的过程，因而显著提高复性回收率。2 .3 .7 . 2甘油介导下吸附一洗脱模式的疏水作用层析复性溶菌酶的折叠途径 如图2 . 1 1 ( a ) 所 示， 变性溶菌 酶在 复 性缓 冲液 平衡的 疏水柱上穿 过洗脱时， 很明显u i 以 观察到 两个洗脱峰，其保留时间的 差异说明二者表面疏水性不同。 从2 8 0。和2 5 4 ru n 的

241、紫外吸收曲线可以看出，第一峰2 8 0 m n吸收大于2 5 4 n m符合天然蛋白质的特征，而第二峰却相反，说明它与天然结构差异较大。图2 . 1 2的曲线a l 和 a 2分别为 第 一 峰 和第二峰柱后活性变化的动力学。 起始阶段第一峰和第二峰活性回收率分别为2 2 % 和3 0 %， 说明洗脱峰下柱时已形成部分活性结构。二者活性恢复旱 现两相:前1 0 m i n内活性增加很快，而后长时间内活性仅缓慢地稍有增加 第二峰最终活性收率稍高于第一峰。几 _ 烹.- 一 . 刃 ， ，二 甲 诊晰F七俪口四四如皿 夕扭硬娜心胭如翻 一，居一.刃才02门6吕1 口1 之 扔价心R妞旧，d ” 叫

242、间 图2 . 1 1溶菌酶在疏水柱上采用穿过以及吸附一洗脱模式的复性色谱图F i g . 2 . 1 1 C u r v e s f o r l y s o z y m e t o b e r e f o ld e d 妙H I C t h r o u g h p a s s i n g a n t i a d s o r p t i o n - e l u t i o n w a y . S o l i dc u rv e s r e p r e s e n t a b s o r b a n c e a t 2 8 0 n m , a n d d o t t e d c m n -e s

243、a t 2 5 4 n m . ( 司R e f o l d i n g 妙p a s s i n g t h ro u g hH I C c o l u m n ; ( b ) R e f o l d i n g b y a d s o r p t i o n - e l u t i o n w a y w i t h H I C c o l u m n a s s i s t e d b y g l y c e r o l. ( )r e f o l d e d l y s o z y m e p e a k 文献报道， 溶菌酶稀释复性主要包括两条折叠途径: 条是形成同时含有。 区 和P

244、区近天然态的中间体的 快速途径， 另 外一条是形成只含有。 区中间体的慢速途径I z a o 1疏水 作用层 析穿 过复性的 溶菌 酶出 现的 两个峰 可能分 别与稀释 复性的 两 种中 间体一致， 这可以 用下列情况来解释: 由 于蛋白 质的 疏水坍塌速度很快， 变性蛋白 进样至复性缓冲液平衡的疏水柱土， 随着变性剂的稀释， 变性蛋白质在扩散至疏水配基附疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索近之前己发生早期折叠， 疏水配基而后可能与中间体发生可逆结合导致其保留时间差异， 第一峰可能是快速途径上的近天然态中间体， 它拥有更多的折叠结构， 从而暴露的疏水基团相对较少， 因而保留值稍小，

245、 第二峰可能是慢速途径的中间体， 山于其折叠程度低于快速中间体， 因而表面疏水基团相对较多， 保留值稍大， 并且吸收光谱与前者也存在差异。 溶菌酶的两种折叠中间体在疏水柱上的分离暗示疏水作用层析可能是一种潜在的研究蛋白 质折叠过程的工具。 活性测定表明疏水柱上的穿过复性产物可能是动力学控制的， 因而具有微弱的 起始活性， 由于在整个折叠过程始终在疏水环境下进行，因此两种中间体均难以恢复天然结构。另外， 两个峰的活性差异暗示了慢折叠途径可能更有利于活性结构的恢复，快速折叠可能更容易导致错配。1:/ /b: 一尹 行 牙二 二，丝 _ _ _ - 石 一 一 嚣 了(%)P工.一老一1翻。哎r e

246、s r es T es 甲 州一 -甲产 -自匆们即助， 加1 知嗯 门， 的， 叻石 因i n wb a t lo n t lm e ( m i n ) 图2 . 1 2不同模式下疏水作用层析洗脱溶菌酶的复性动力学F i g . 2 . 1 2 K i n e t i c c u r v e s o f r e a c t i v a t i o n f o r e l u t e d l y s o z y m e f r o m H I C c o l u m n w i t h d i ff e r e n t m e t h o d s . a l :t h e f i r s t

247、e l u t e d p e a k o b t a i n e d w i t h t h e s t e p s d e s c r i b e d in F i g .2 . 1 1 ( a ) ; a 2 : t h e s e c o n d p e a k e l u t e d a sa b o v e ; b : t h e p e a k o b t a i n e d w i t h t h e s t e p d e s c r i b e d i n F i g .2 . 1 1 ( b ) . 图2 . 1 1 ( b ) 为5 0 % 甘油介导的 吸附一 洗脱模式

248、 下， 溶菌酶在疏水作 用层 析柱上 的复性色谱图， 与穿过复性截然不同的是仅有一个洗脱峰， 其2 8 0 t u n 的吸收值大于2 5 4D M， 与正常的蛋白 峰接近， 暗示具有均匀疏水性的单一中间体形成。 如图2 . 1 2 ( b ) 所示， 此洗脱峰柱后的复性动力学与穿过复性显著不同， 下柱洗脱峰的起始活性回收率只有2 %， 但它在室温放置过程中， 活性回收率却持续增长， 1 0 h 后活性回 收率提高到8 6 .3 ， 这表明采用甘油介导的吸附一洗脱模式得到的溶菌酶其复性过程比穿过模式慢得多，这种方法可能形成了一种最终能恢复天然结构的正确折叠途径上的中间2甘油介导的疏水层析复性溶

249、菌酶体。 在这一模式中， 可能采取了与稀释复性不同的单一折叠途径， 而且这一中间体形成的过程可能是热力学所控制， 其活性结构形成较为缓慢， 但却不影响天然结构的最终形成。2 .4本章小结 ( 1 ) 采用几种商 业化疏 水作用 层析柱尝 试 直 接复性 溶菌酶， 发 现蛋白 回 收 率显著 高于稀释复性， 但比活收率低于稀释复性的可溶性产物， 且随着疏水强度的增加而下降，表明 商业化疏水作用层析能抑制蛋白 质折叠过程中的 聚集沉淀，但促使其错误折叠。 ( 2 ) 将变性溶菌酶在高盐下吸附到P o r o s P E 疏水作用层析柱上， 采用服梯度解吸5 0% 甘油介导洗脱，活性回收率达到8 6

250、 .3 %，蛋白 收率为8 5 %，比 活回收率为1 0 1 %，复 性蛋白 浓度能达到1 .2 m gf m l ， 说明 采用甘油介导的疏水作用层析复性蛋白 质时既能抑制聚集又能正确促进折叠， 且具有应用潜力。 ( 3 ) 甘油介导脉梯度洗脱模式的 疏水 作用层析复 性蛋白 质的 过程可能模拟了 分子伴侣的捕捉一 一 - 释放作用机理。 它可能改变了溶菌酶的折叠途径， 形成一种在正确折叠途径上的中间体，其折叠速度较慢， 但能最终恢复天然结构。3甘油介导的疏水层析复 性重组a - 2 b 干扰素3甘油介导的疏水作用层析复性重组a - 2 b 干扰素 甘油介导的商业化疏水作用层析模拟了 人工分

251、子伴侣的作用机理， 成功地复性了模型蛋白 质 溶菌酶， 高浓度复性产物和高活性收率的 获得显示了 其潜在的 应用前景。 鉴于复性方法建立的主要目的是为了 有效复性包涵体蛋白质， 因此本章欲考察上述方法对包涵体蛋白 质的复性效果，从而评价其实用性。 1 9 5 7 年， I s a a c ， 和L i n d e m n a n n 利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感于扰现象发现， 病毒感染的细胞能产生一种M-子， 作用其它细胞干扰病毒感染的复制， 他们将这种物质称 之 为“ 干 扰 素” ( I n t e r f e r o n , I F N ) 2 8 8 。 在 这以 后 先 后 发 现 了

252、 来自 于 不 同 种 属 不 同 细胞体系的一系列I F N . I F N的细胞来源因动物种类、 细胞类型、 诱生剂的性质和诱生条 件而异， 可分为 来自 白 细胞的 a - I F N ， 来自 纤维 母细 胞的p - I F N ， 和来自 淋巴 细胞的y - I F N ， 其中 a ,- I F N和p - I F N合 称为I 型I F N , y 一 称为I I 型I F N或免 疫I F N . I 型I F N能 耐热耐酸， 5 6 0 C , 3 0 m i n 不 被 灭活， p H 2 - 1 0 很 稳定， 1 1 型I F N不耐 酸。目 前己 知超 过2 5 个

253、亚 类的 a - I F N . 2 个亚 类的 p - I F N以 及单一的 y - I F N . I F N具 有广 谱 抗病毒、抗 增殖和免 疫调节功能， 其中I 型I F N 抗病 毒活性 远大于1 1 型I F N 2 a 伙 a - 2 b I F N由1 6 5 个氨基酸组成， 分子量约为1 9 k D a ， 分子内 含有4 个半肌氨酸，C y s l - 9 9 ,C y s 2 9 - 1 3 9 之间 形 成 两 个 分 子内 二 硫 键 2 8 9 ， 其 结 构 含 有5 个 a .螺 旋 ， 其 中 四个形成上一 上一 下一 下拓扑 学结构的 左 手螺 旋束，

254、其 三维 结构如图1 所示 2 9 0 1 0 a - 2 bI F N临 床上 广泛 用于治 疗慢 性肝炎和肿 瘤2 9 1 1 。 基因 重组 技术 使得 。 2 b I F N的 大 规 模生 产成为可能。 采用大肠杆菌表达a - 2 b I F N具有发 酵过程简单， 营养要求低， 便于 放大等优点， 但其过量表达通常形成不溶的无活性的 包涵体，需要溶解变性后进行复性。目 前生产上复性a - 2 b I F N主 要采用直接稀释法，蛋白 收率和终浓度均很 低 2 9 2 1 本实验拟采用甘油介导的疏水作用层析复性重组a - 2 b I F N， 考察了介质类型、 甘油 添加等关键因素对

255、复性效果的影响， 并与 稀释复性效果进行比 较， 旨 在建立高 效而实用的复性方法。3 1 实验材料 人a - 2 b I F N重 组 大肠杆菌p o p 2 1 3 6 ; W a t e r s 6 0 0 H P L C 购自W a t e r s 公司 ; V y d a c 2 1 4疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索在复性缓冲液中加入不同浓度的甘油，重复上述步骤。3 .2 .7疏水作用层析吸附一洗脱模式复性 将P o r o s E T 层析柱( 8 . 8 x l .2 c m i .d ., 1 0 m l ) 用高盐缓冲液E ( 3 M ( N H 4 )

256、2 S O 4 , 2 0 M MN a 2 H P 0 4 , p H 8 . 5 ) 平衡， 上5 0 p 1 上述 变性 。 - 2 b I F N ， 为 防 止蛋白 质在进入介质 之前发生 折叠而 沉 淀， 进样前后分 别 注入1 0 0 川上 述变性 剂， 用E 冲洗上 样后的 层析柱 1 C V以 除去变性剂并促使变性蛋白 质吸附， 接着用含不同 浓度甘油的复性缓冲液F ( 2 0 m MN a 2 H P C 7 4 , p H 8 .5 , 0 .0 1 0%- M E ) 冲 洗2 C V降 低盐 浓度以 在柱中建立 利用复 性的 溶液环境， 然后运行0 .4 C V盐酸K

257、梯度F - G ( 6 M G d n - H C I , 5 0 m M T r i s ,0 .0 1 % o (3 - M E , p H 8 . 5 )和 0 .4 C V梯度G -F 用于解吸吸附的蛋白质， 然后持续用F 洗脱， 使解吸的a - 2 b I F N在洗 脱过程中 逐 渐折叠复 性。 层析过 程在A K T A p u r i f i e r 上 进行， 流速。 5 m l / m i n . 然 后 换P o r o s E T层 析 柱 ( 8 .8 x l .2 c m i .d ., 1 0 m l ) 和P o r o s P E 2 0 疏 水 柱 ( 4

258、.5 x l .2 c mi .d . ,5 m l) 按上述方法进行实 验， 洗脱梯度体积分别为0 . 8 C V F - G和0 A C V G - F ， 对两种方法的复性进行分析比较。3 .2 . 8反 相高 效液相色谱( R P - H P L C ) 分析 在W a t e r 6 0 0 高 效 液 相 色 谱 仪上， 用H 液 ( 0 . 1 %三氟乙 酸( T F A ) ) 平 衡V y d a c 2 1 4 T P5 4 C 4 反 相柱( 2 5 0 x 4 .6 tu rn i .d ) ， 进样后用3 5 m l 梯度: 4 0 0I o l ( 0 . 1 0l

259、 o T F A ， 乙 P ,j ) - 5 5 %I 洗脱c c- 2 b I F N峰，流速 1 m l / m i n .3 .2 .9活 性测定 参照细胞病变抑制法 ( C P E ) 2 9 3 . 铺板: 将生长 状态良 好的W I S H细 胞用完 全培养 液( 添加1 0 % 牛血 清的M E M培养 液 ) 将 其 稀 释 成2 .5 x 1 0 $ - 3 .5 x I 护个 细 胞 / M l 的 悬 浮 液， 将 其 接 种 于%孔细 胞 培 养 板，每 孔1 0 0 u 1 , 然后培养4 - - 6 小时。 加 样: 往%孔板的 每孔中 加入1 5 0 碑测定 培

260、养液( 添加7 % 牛 血清的M E M培养液 ) ， 在A 6 . A 7 孔中， 加入5 0 川标准品， 在A 2 - A l l 各孔中 每孔加入5 0闪各 待测样品 溶液，自A行取5 0 闪至H行作4 倍稀释， 每个样品 取两个复 孔留1 5 0 闪余 液。A l - H l 和A 1 2 - H 1 2 两列孔不加样品， 作为 对照。 然后取出 接种细胞的%孔培养板，轻轻甩去其中的培养液， 将上述蛋白 溶液加入相应的 孔中， 每孔1 0 0 川 ， 培养1 & - 2 43甘油介导的 疏水层析复 性重组。 - 2 b 干扰素小时。 攻毒: 将V S V病毒用 攻 毒培养 液 ( 添

261、加3 % 牛 血清的M E M培 养液 ) 稀 释至 工 作浓度， 攻毒剂量为1 0 0 T C I D s o , 取出 加样后的%孔板， 轻轻甩去培养液， 往每孔中 加入1 0 0川攻毒液， 留出E l - H l 和E 1 2 - H i 2 作为 细胞 对照 ， 放入培养 箱中 培 养 ， 连续 观察( 镜检 标 准溶液的5 0 % 病 变在D行 或E 行 ). 染色:当观察到D行或E 行有5 0 % 病变时从培养箱中取出细胞培养板， 弃去上清， 每孔 加入5 0 R l 染色液 ( 0 .0 5 0l o ( w / v ) 结晶 紫， 2 0 0% Z , 醇 ) ， 室 温放置3

262、 0 分 钟。 脱色: 流 水小 心 冲去染 色液， 吸 干残留 水 分.每孔 加入1 0 0 川脱 色液( 5 0 % 乙 醇，0 . 1 % Z r 酸) ， 室温放置3 - 5 分钟。 比 色测定:将细胞培养板放入酶标仪，将波长设定为测定波长 5 7 0 n m ， 参照波长6 3 O n m , 记 录 测定结 果。 结果计算:待检样品效价二标准品效价x待检样品 预稀释倍数标准品预稀释倍数待检样品半效稀释倍数x 孺雨涵骊葡森半效稀释倍数为从样品溶液至相当于标准品5 0 %最大效应点的稀释倍数。3 3结果及讨论3 . 3 . 1 稀释复 性 如图3 .2 所示，当 将变性a - 2 b

263、I F N直接稀释复性时， 蛋白 浓度增加，复性产物浊度几乎线性提高， 这表明a - 2 b I F N稀释复性时容易产生聚集， 且随蛋白 浓度增加聚集体生成更加显著， 这是因为 分子间的聚集比 分子内 的 折叠反应级数更高。 将复 性溶液离心去除 沉淀后测定 上清中的 蛋白 含 量， 结 果发 现即 使在低至5 0 L g l m l 的 复 性终 浓度时， 其可溶性蛋白收率也只有5 9 % . 为了 判断稀释复性的可溶性成份是否正确折叠， 将稀释复性蛋白 溶液离心后得到的 上清采用反相色谱进行了 分析。 反 相高 效液相色谱可以 按照蛋白 质疏水性的 差异进行分离， 不同 折叠程度结构其表

264、面疏水性不同， 一般而言， 天然构型的由 于其折叠 程度较高， 疏水性较弱， 往往保留时间较短。 如图3 . 3 所示， 稀释复性上清中， 有4 个cx - 2 b I F N洗脱峰。 第一峰保留时间( R t 约3 2 m in ) 与 纯化的 活性a - 2 b I F N一 致， 可能为丛小 作 用层 析 及 其 相 关 技术 辅 助蛋白 质 折 叠 复 性的 探 索遗憾的是， 疏水作用层析介质辅助分批稀释复性a - 2 b I F N并不能减少错误折叠结构含量， 其反相色谱图与直接稀释复性没有明显差异( 图3 .4 ( b ) 和( c ) ) =1几、八曰曰曰呻一呻 夕已占咬砂妙呻妙

265、 夕已妻2_ _ 二几 _了、 一 洲 、 恐知.卜。闰。叫。扫日山。T习，10叨H I C m e d i c s t y p e s目 创 栩u a n 二 喇 d. ， 图3 .4疏水作用介质类型对辅助分批复性a - 2 6 I F N效果的影响F i g .3 ,4 E ff e c t s o f v a r i o u s h y d r o p h o b i c m e d i a o n b a tc h - r e f o l d i n g e ff i c i e n c y o f a - 2 6 I F N . H I C m e d i a sw e r e P

266、h e n y l S e p h a ro s e F F , O c t y l S e p h a r o s e F F , B u t y l S e p h a r o s e F F , P o r e s P E , P o r o s E T f r o m t h e l e f tt o t h e r i g h t , r e s p e c t i v e l y . T h e c o n t r o l e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d b y d i l u t i o n i n t h e a b s

267、e n c e o f m e d i a . ( a )S o l u b l e p r o t e i n r e c o v e r y i n t h e p re s e n c e o f v a r i o u s H I C m e d i a . T h e c h r o m a t o g r a m s o f R P - H P L C o n t h er i g h t w e r e c o r r e s p o n d i n g t o P o r o s E T ( b ) a n d P o r o s P E ( b ) H I C r e s p

268、 e c t i v e l y . , a - 2 6 I F N p e a k s3 .3 .3疏水作用层析柱上复性3 . 3 .3 . 1 疏水作用层析对a - 2 b I F N穿过复性的 影响 如图3 . 5所示， 当 变性a - 2 b I F N上至用复性缓冲液平衡的疏水柱， 然后用相同缓冲液洗脱时，不同类型疏水柱其可溶性蛋白回收率表现出较大的差异。 . 疏水性强的P h e n y l F F和O c t y l F F 柱的 可溶性蛋白 回 收率 几乎为 零， 而B u t y l 和P o r o s P E 柱也分别只有6 % 和2 2 .5 %的蛋白回收率， 而疏水性

269、最弱的P o r o s E T柱的蛋白回收率最高，为5 9 .4 %， 上述数据均显著低于溶液分批复性结果。 这表明相对于溶液分批复性而言，疏水作用介质在柱层析模式下蛋白 质与配基间的疏水作用对折叠的抑制作用更为显著。 对于强疏水作用介质而言， 蛋白 质在柱中 洗脱过程中， 始终与疏水配基相互作用，其自 身 疏水坍塌趋势不足以克服这种作用力， 导致可能形成的 疏水核心重新暴露从而抑制折叠过程， 这种作用的累积最终导致绝大部分蛋白 质被吸附。 因此强疏水作用层3甘油介导的疏水层析复性重组a - 2 b 干扰素析不适宜用于a - 2 b I F N的复性。 对于弱疏水作用介质， 由于蛋白质与配体

270、间疏水作用较弱， 随着折叠进行， 疏水基团逐渐内埋而不被吸附， 但即使是暂时的疏水结合也促使部分蛋白质的一些疏水基团暴露在外而被吸附。looq0朋70印加4030即比。9抓卜。卜。卜u叫。祠。妇。Tq。10仍_MP h e n y l F Fe c t y l F F HI C B u t y l F Fm e di a . 图3 . 5不同类型疏水柱对(x - 2 b I F N复性可溶性蛋白收率的影响F i g . 3 . 5 . E ff e c t s o f v a r i o u s H I C c o l u m n s o n s o l u b l e p r o t e i

271、 n s re c o v e ry o f r e f o l d i n g o f a - 2 6 I F N . 1 0 0 p 1u n f o l d e d a - 2 6 I F N o f 3 4 m g / m l w a s a p p l i e d t o H I C c o l u m n s ( 4 . 5 x 1 .2 c m I .D) e q u i l i b r a t e d b y r e f o l d i n gb u ff e r ( 5 0 m M T r i s , p H 8 . 5 ) a n d t h e n w as e l u

272、t e d w i t h t h e b u ff e r a t 0 . S m l / m i n . H I C m e d i c s w e r e P h e n y lS e p h a r o s e F F , P o r o s H P , O c t y l S e p h a r o s e F F , B u t y l S e p h a r o s e F F , P o r o s P E , P o r o s E T fr o m t h e l e ft t ot h e r i g h t , r e s p e c t i v e l y . 从复

273、性 色谱图 可以 看出， P o r o s E T ( 图3 . 6 a ) 和P o r o s P E( 图3 .6 b ) 疏 水作 用 层析复性a - 2 b I F N得到多个峰，这暗示a - 2 b I F N在疏水作用层析柱上穿过复性时，可能存在多种折叠途径， 少数蛋白 质分子可能由 于快速折叠使得疏水基团暴露较少， 因而保留值较小， 而大多数分子可能经过中间体过程， 具有一定量的暴露疏水基团， 保留值增大。 而且随着介质疏水性增强， 洗脱峰保留 值增大。 反相色谱分析 显示， 保留 时间短的洗脱复性峰 ( 图3 . 6 c ) 天然结构含量高于保留时间长的洗脱复性峰 ( 图3

274、 .6 d ) ,这说明在疏水作用层析柱上停留时间越长，越不利于活性结构形成。3 . 3 . 3 .2盐酸肌解吸甘油介导洗脱的P o r o s E T疏水作用层析复性 上面实 验结果指出， 疏水作用层析能抑制a - 2 b I F N复性过程中的聚集， 然而却不利于其折叠， 特别是强疏水作用介质更会导致变性a - 2 b I F N的不可逆吸附。 根据溶菌呸 爽 作 用 层 析 及 其 相 关 技 术 辅 助 蛋白 质 折 叠 复 性 的 探 索蝴700柳咖咖翻翔仰 夕任r逞寸_， 0_tm咖700咖枷咖30020010D 一争一七E吞矿。捆枷 R e t e n t io n v o l

275、u m e 回R e t e n t i o n u m e m l 川 图3 .6 P o r o s E T ( a ) 和P o r o s P E ( b ) 穿 过 复 性 a - 2 b I F N色 谱图 及 反相 色 谱 分 析F i g .3 .6 T h e c h r o m a t o g r a m s o f re f o l d i n g a - 2 b I F N妙g o i n g - t h ro u g h P o r o s E T H I C c o l u m n ( a ) a n dP o r o s P E H I C c o l u m n

276、 伪 ) r e s p e c t i v e l y a n d R P - H P L C a n a l y s i s o f p o o l e d f r a c t i o n s o f v a r i o u s re t e n t i o n s( b y S o u r c e 5 r p c c o l u m n ( 1 5 0 x 4 .6 m m i . d . ) ) 的t h e f r a c t i o n o f s m a l l r e t e n t i o n ; ( d ) t h e f r a c t i o n o f l a r g

277、 er e t e n t i o n . * ， c o r r e c t l y r e f o l d e d a - 2 b I F N .酶的实验结果， 在此我们引入渗透质一甘油设法促使a - 2 b I F N在疏水作用层析柱中正确折叠。变性( x - 2 b I F N在高盐条件下进样至P o r o s E T 疏水柱上，穿过峰中未发现蛋白 质， 表明 它 被 完全吸附。当 用 含2 0 % ( v / v ) 甘油的 复 性缓冲 液冲洗 层析柱时， 随 着盐浓度的降 低却未见蛋白 洗脱， 说明尽管P o r o s E T是一弱疏水作用介质， 然而变性蛋白 在高盐作用下却形

278、成了 多位点的强疏水吸附， 这一情况与溶菌酶相似。 与 疏水作用层析复性溶菌酶不同的是， 脉梯度的采用并不能有效解吸结合的a - 2 b I F N ， 说明此蛋白 可能与介质疏水作用更强烈， 于是采用盐酸肌梯度用于解吸， 结果洗脱出目 的蛋白 峰。 图3 .7 ( a ) 为 a-213 I F N在P o r o s E T 疏水 柱上的 复性 色谱图 。 图3 .7 ( b ) 为P o r o s E T 复 性产物的 反 相色 谱分析图， 与前 面稀释复 性 相比， 显 然第一峰明 显增大， 积分显示正确折叠峰面积为2 9 % ， 而稀释复 性仅为1 2 %， 表明 本方法有助于a

279、- 2 b I F N的正确折叠。 表3 . 1 为采用本方法与稀释法复性结果的比 较。 当上 样量 为2 m g蛋白 /m1 介 质时， 洗脱得到的复 性a - 2 b I F N浓度达到I . l M g / M l , 蛋白3甘油介导的疏水层析复性重组“ - 2 b 干扰素回 收 率 为8 4 ， 比 活 为3 .0 x l O 8 I U lm g 。 可 见 采 用 本 方 法复 性 o t- 2 b I F N与 稀 释 法 相比具有显著的优越性， 而且具有潜在的应用价值。*几洲曰日日口，下J胜!tlll妇月洲什ul，.1吸加。砷绷砷砂咖呻呵 一急且jZ苗。勺色后。uo。10不PO

280、.八日曰翔.队以卫一 - n _“ “ i50n-IH ig h s a l t c o n cen t r a t i o nR 司 o ld in g b u ff e r_一 _一、;.、Gdn Grade .- - 夕日惬，哎火o t o 匆闰幻f3 F i N 叭钓tu r n 州 9 I翻 x x a z a 加发 9 1 岛劝们4叼踢 , 5 0 3 7 R e t e d o n t i n 州耐川 图3 .7 甘油介 导P o r e s E T 疏水柱复 性a - 2 b I F N洗脱图 谱( a ) 及其反相色 谱分析 ( b )F i g . 3 .7 T h e c

281、 h r o m a t o g r a m o f r e f o l d i n g o , a - 2 b I F N b y P o r o s E T H I C ( 8 . 8 x 1 . 2 c m i .d ., I O m l ) t h r o u g hr e l e a s e w it h G d n - H C I a n d e l u t i o n w it h g l y c e r o l a n d R P - H P L C o f p o o l e d f r a c t i o n ( b ) . ( * ) a - 2 b I F N表3 .

282、1 a - 2 b千扰紊稀释复性和甘油介导疏水作用层析复性效果的比 较T a b l e 3 . 1 C o m p a r i s o n o f r e f o l d i n g e f f i c i e n c y o f a - 2 6 I F N b y d i l u t i o n a n d b y g l y c e r o l - a s s is t e d H I C复性蛋白浓度蛋白回收率正确折叠含量复性方法( %)( %) 比活( x I O $ 1 U l m g )04划勺山八，它.2八，Jq户工R稀释P o r o s ET HI C3 .3 .3 .3甘油

283、的影响 表3 .2 为甘油对稀释法和盐酸肌解吸的疏水作用层析复性(x - 2 .b I F N结果的比 较。当 复性缓冲液中无甘油时， 盐酸肌梯度解吸可以 得到4 3 %的 a - 2 b I F N ，而甘油添加明显提高蛋白回收率， 2 0 % 和5 0 %的甘油蛋白回收率分别为8 4 % 和%， 说明甘油的 添加能显著提高蛋白 回收率。 为了 考察甘油加入的作用原理， 在对照实验中 添加相应浓度的甘油进行稀释复性。 结果显示， 甘油添加并不能有效提高稀释复性蛋白 回收率。 因此， 甘油本身不能作为聚集抑制剂。 甘油提高疏水作用层析复性的蛋白 回收率，可能在于结合蛋白 质解吸过程中逐渐掩盖疏

284、水配基， 从而有利于折叠过程的正常进疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索行。 反相色谱分析显示， c t - 2 b I F N稀释复性时， 甘油添加抑制正 确折叠， 随甘油 浓度的提高正确折叠结构含量下降， 这与溶菌酶不同， 后者在2 0% 甘油时比 活最大; 而疏水作用层析复性，2 0%甘油添加促进折叠，5 0% 甘油却抑制折叠，这一情况也与溶菌酶存在显著差异， 后者随甘油浓度的提高比活相应增加。 a - 2 b I F N与溶菌酶复性行为的差异可能是由 于前者比后者拥有更多的结构从而增加了正确折叠的难度， 稀释复性时 a - 2 b I F N以 随机状态进行折叠， 甘油的存

285、在可能 会阻碍肤链的自由 运动， 从而影响了正确结构形成; 而对于疏水作用层析复性， 蛋白 质经历了一个从疏水结合态到释放的过程， 这期间有助于结构重组， 低浓度甘油的存在可以 掩盖介质表面的疏水配基， 创造一个利于折叠的亲水环境， 而过高浓度的甘油， 由于较大的粘度限制肤链的运动，因而可能导致错误折叠结构。表3 .2甘油对P o r o s E T 疏水作用层析和稀释法复性( x - 2 b I F N的影响T a b l e 3 . 2 E f f e c t o f g ly c e r o l o n r e f o l d i n g o f ( x - 2 b I F N b y

286、d i l u t i o n a n d b y P o r o s E T H I C蛋白回收率正确结构含量复性方式添加剂( %)( %)n，苦加29价5515695324384%稀释法稀释法2 0 1 0甘油5 0 % 甘油P o r o s ETHI CP o r o s E T HI CP o r o s E T HI C2 0 % 甘油5 0 % 甘油 图3 .8为不同甘油浓度介导下P o r e s E T 疏水作用层析复性、 纯化和变性。 2 b I F N的荧光光谱。 纯化的活性a - 2 b I F N最大发射波长为3 4 8 .6 n m， 变性样品发射波长显著增大， 为

287、3 6 5 .6 n r n o 疏水作用层析复性样品中， 2 0 % 甘油介导复性样品的最大发射波长与活性样品最接近， 为3 4 8 . 4 nn,暗示近天然结构的形成; 而无甘油介导复性样品荧光光谱发生红移， 向 变性样品方向 靠近， 最大发射波长为3 5 7 r u n ， 暗示接近变性态;5 0 % 甘油介导下复性样品的荧光光谱却显著蓝移， 最大发射波长为3 3 4 .4 n m， 暗示可3甘油介导的疏水层析复性重Ma - 2 b千扰素能形成错误折叠的紧密结构。老1.u.p.”亡.on一么一wa r e崎 ” 中叫m n l 图3 . 8 甘油介导P o r o s E T 柱复性a

288、- 2 6 I F N的荧光分析F i g . 3 . 8 F l u o r e s c e n c e s p e c t r a o f r e f o l d e d a - 2 b I F N b y P o r o s E T H I C as s is t e d b y g l y c e r o l o f v a r io u sg l y c e r o l . a , p u r i fi e d a c t i v e a - 2 6 I F N ; b , u n f o l d e d a - 2 b I F N; c , re f o ld in g i n t

289、 h e p r e s e n c e o f 2 0%g l y c e r o l ; d , r e f o l d i n g i n t h e p re s e n c e o f 5 0 % g ly c e ro l ; e , re f o l d i n g i n t h e a b s e n c e o f g l y c e r o l3 . 3 .3 .4介质类型对甘油介导的 疏水作用层析复 性a - 2 b I F N效果的影响 为了考察介质疏水性对甘油介导的疏水作用层析吸附一洗脱模式复性效果的影响，样品P o r o s P E柱按上述方法进行复性。如图3

290、9所示，无甘油介导P o r o s P E柱复性的反相色谱分析显示 R t 3 2 m i n的天然结构峰很小，而出现两个明显峰 ( R t 分别为3 6 m i n和4 0 m i n ) , R t3 6 m i n出现的新峰表明此条件导致更多的错误折叠中间体;2 0 % 甘油添加下， R t 3 6 m i n 中间体峰减小， 而R t 4 0 m i n 中间体峰却增大; 5 0 % 甘油时其正 确折叠峰相对面积仅稍有增加。 因 此与P o ro s E T 相比， 疏水 性更强的P o ro s P E柱严重阻 碍了 天然结构形成， 反而导致更多的 错误折叠结构。 甘油浓度的增大

291、可以 部分抑制这一趋势， 然而无 法有效促进正确折叠 图3 . 1 0 为 采用P o r o s P E 疏水 作用 层析不同 甘 油浓度 一 复 性。 - 2 b I F N的 荧光 光谱图 . 无 甘油 介导时 最大发 射波长为3 5 4 . 6 n m ， 与P o r o s E T 相 似， 显著 偏离 活性 。 2 6 T F N而靠近变性蛋白 质; 2 0 % 甘油介导时 最大发射波长为3 4 3 .2 n m , 偏离活性样品以 及2 0 %甘油介导P o r o s E T 复性样品 位置而蓝移; 5 0 % 甘油介导下得到的复 性产物最大发射波长为3 3 7 ru n ，

292、 与5 0 % 甘油介导P o r o s E T 复 性样品 位置也发生蓝移。 而且其荧光谱图疏水作用 层析及 其相关技术 辅助蛋白 质 折叠复 性的探 索份曰”11枷伽瞰呻种恻、诊r加 划攫纂夕里.绍咤夕三摇哎脸a x , a 班b故 b岛翅旬4 之 “u铭协乞口幻 一 ，耳， ，了， 一了 ， 尸 了， ，气， 尸 丫， 刊 户丫 矛 a加岛澎幻 a叹 s e a s 们(M心妈只 川 e V o o li m e 咤 m i n )功触月坛 .ti . 州mi n i 一、姐绷柳抑 夕，飞经魂 图3 . 9 甘油介导P o r o s P E 疏水柱复性a - 2 b I F N的反相

293、色谱分析F ig .3 .9 . R P F I P L C p r o fi l e s o f r e f o ld e d c c- 2 b I F N w ith P o r o s P E as s i s t e d b y g ly c e r o l o f v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n s . ( a ) w i t h o u t g l y c e r o l ; ( b ) 2 0 0/ o g l y c e r o l ; ( c ) 5 0 % g ly c e r o l . , a - 2 b I F N p e

294、 a k s .不如前者圆滑， 暗示可能有较多的结构存在。 上述结果说明当 介质疏水性增强时， 甘油的水化能力显著减弱，因而P o r o s P E疏水作用层析复性效果较P o ro s E T差，甚至促进错误折叠.3 .4本章小结 ( I ) 采用商业化疏水作用介质溶液分批辅助复性重组a - 2 b I F N ，可以 抑制沉淀生成， 然而随着介质疏水性提高可溶性蛋白 回收率显著下降， 而采用疏水作用层析直接穿 过复性时进一步降低蛋白 回收率， 表明重组a - 2 b I F N在疏水环境下复性时， 正 确折叠过程可能受到抑制，从而导致不可逆吸附. ( 2 ) 将重组a - 2 b I F

295、 N 在高盐下吸附到P o r o s E T 疏水作 用层析柱上， 采用 盐酸 肌解吸2 0 % 甘油 介导 洗 脱， 蛋白 回 收 率 达到8 4 % , 复 性 产 物比 活 为3.N I O s I U f m g ， 复 性3甘油介导的疏水层析复性重组 a - 2 6 干扰素 、卜者丽占山。巴.。协.。n曰山3 1 0 3 二 G3 3 03 峨3 5 口另3 7 0洲) 3 田屯幻N 翻 .I 洲 m略 图3 . 1 0 甘油介导P o r o s P E 疏水柱复性。 2 b I F N的荧光分析F i g . 3 . 1 0 . F l u o r e s c e n c e

296、s p e c t r a o f r e f o l d e d a - 2 b I F N w i t h P o r o s P E a s s i s t e d b y g l y c e r o l o f v a r i o u sc o n c e n t r a t io n s . ( a ) p u r i f i e d n a t i v e s a m p l e ;( b ) u n f o l d e d s a m p le ; ( c ) w i t h o u t g l y c e r o l ; ( d ) 2 0 % g ly c e r o l ;

297、( e ) 5 0 % g ly c e r o l蛋白 浓度达到了1 . 1 M g / M I , 复 性 效率 显著 高 于直接 稀释和无甘油介导 下疏 水作 用 层析的复性方法， 结果表明 采用弱疏水作用介质和适宜 浓度的甘油洗脱相结合既可以 抑制聚集又可以 促进正确折叠。疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索4 .2 .3 E F - G包涵体的纯化和变性 将I程菌 用缓冲 液 ( 1 0 0 m M T r i s , 1 m M E D T A , l p g / m l D n a s e , l m M苯甲 磺酞氟( P M S F ) p H 8 . 0 ) 悬

298、浮， 在冰 浴中 用F re n c h p r e s s 破碎3次， 破碎液于1 7 0 0 0 r p m离 心3 0 m i n ， 收集包涵体沉淀。 将所得包涵体用洗涤液( 1 % T r it o n X - 1 0 0 , 5 0 m M T r is , 1 m ME D T A , p H 8 .5 ) 悬浮， 搅拌至沉淀散开， 再于1 7 0 0 0 r p m离 心3 0 m i n ， 重复 洗 涤两次。洗涤后包涵体用变性剂( 6 M 盐酸肌( G d n - H C I ) ， 5 0 m M T r i s , 1 m M E D T A , 1 5 0 m MD

299、T T , p H 8 .7 ) 溶解， 室温搅拌3 h 后，于1 7 0 0 0 r p m离心3 0 m i n ， 然后收集上清，即为变性E F - G， 分装后于一 7 0 0 C保存，以备后用。 变性E F - G用S D S - P A G E检测， 其纯度在 9 0 %以上。4 .2 .4可溶性E F - G的制备 收 集菌体 破碎液上 清， 进样至 用缓 冲 液A ( 2 0 m M T r i s , 0 .5 M N a C l , 5 m M咪哇，p H 7 .5 ) 平衡的H i s t r a p N i 一 金属鳌合柱( 5 m 1 ) ， 分别用A和B ( 含5

300、0 m M咪哇的A 液 ) 冲洗5 C V 以 除 去 未吸附的 杂蛋白 ， 再 用C ( 含0 .2 M咪哇的A 液 ) 洗脱结 合的 可 溶性E F - G ,再 将其上H i l o a d s u p e r d e x 2 0 0 H R 1 6 / 6 0柱， 以 缓冲 液D ( 5 0 m M T r i s , 0 . 1 5 M N a C l , p H7 .5 ) 为 流动相洗 脱， 流 速1 m l / m i n ， 最后 得到电 泳纯产品， 用于后面的 对照 分析。4 .2 .5固定化P E G疏水作用层析介质的 制备 取1 0 0 g 湿重的A l l y l S

301、 e p h a r o s e H P 介质 放 入 5 0 0 m l 烧瓶中， 加入4 0 0 m l 水 和0 . 1 M 醋酸钠， 然后在搅拌下逐滴加入溟至介质变成稳定的黄色， 然后在烧结玻璃漏斗中用水冲洗得到的澳取代介质至白 色。 将上述介质用4 0 m 水悬浮并转移至圆底烧瓶中， 加入2 5 g P E G 2 0 K , 1 0 0 r p m下搅拌一小时， 然后加入9 .3 g N a O H和 0 .2 gN a B H 4 ， 然后3 0 0 C反 应过夜。 次日 用1 M醋酸 将p H值调至6 - 7 ， 最 后 将祸联的 介质用 I O L水冲洗。4 .2 .6稀释复

302、性 5 0闪的2 4 m g / m l 变性E F - G在搅 拌下逐渐滴加至5 m l 复 性缓冲 液( 5 0 m MT r i s , p H 8 .6 , 5 m M G S H , 0 . 5 m M G S S G ) 中 。 在复 性缓冲液中 分别加入2 MM 和0 . 5 M精氨酸，重复上述过程。4塑d 鱼 通鱼 丛 噢 丝 丝鱼 Q j* 茵 翻 译 延 长 因 子 G ( E F -G )4 .2 . 7疏水柱吸附服脉冲洗脱复 性 将P E G 2 0 K S e p h a r o s e H P 疏水 作 用层 析柱 1 0 0 x 1 0 m m i . d .,

303、8 m 1 ) 用缓冲 液 E ( 2 0m M T r i s , 3 M ( N H 4 ) Z S Q 4 , p H 8 .2 ) 平衡， 然后上2 4 m g / m l 变性E F - G 1 0 0 p 1 ，为防止蛋白 质在 进入柱前 沉淀 在管 道中， 上 样 前后 注入1 0 0 w 1 变 性剂。 然后用E和F 液 ( 2 0m M T r is , 5 m M j3 - M E , p H 8 .6 ) 先 后 冲洗 层析 柱 1 C V和 2 C V 。 再在柱上加 入2 m l G( 8 M u r e a , 5 0 m M T r i s , p H 8 . 匀

304、解吸结合的E F - G , 然后再用B持续洗脱至出 峰完全。所有层析过程在 F P L C洗脱上进行，流速。 S m U m i n , 洗脱峰室温放置过夜后分析。 分 别 用B u t y l S e p h a r o s e F F , P h e n y l F F 以 及固 定化T r i t o n X - 1 0 0 代替 上 述固 定 化P E G介质，按上述过程复性E F - G e 改变G液中脉浓度，重复P E G疏水作用介质的脉脉冲洗脱复性过程。 对于2 M服,直接在B 液中添加并持续洗脱。将上样后的P E G疏水柱和上述缓冲液置于冰浴中， 但不采用G液脉冲 洗脱， 直

305、F 液洗脱。用含0 . 1 % T F A的乙醇、乙二醇、B e r o l 1 8 5 代替G液中的8 m服， 按上述方法用行接进4 .2 . 8疏水柱穿过复性 将不同 类型 疏水柱 用复性 缓 冲液 ( 5 0 m M T r i s , 5 m M G S H , 0 .5 m M G S S Q p H 8 句平衡， 在管道中 注入1 0 0 h l 变性剂 ( 6 M G d n - H C 1 , 5 0 m M T r i s , 1 m M E D T A , p H 8 .7 ) 后，取1 0 0 闪的2 4 m g t m l 变 性E F - G上 柱， 然 后以0 .5

306、 m l l m i n 的流 速用复 性缓 冲液 洗脱。4 .2 . 4 R P - H P L C分析 取5 0 0川复 性 样品 及 纯化的 可溶 性E F - G分别上至 用H液( 0 . 1 %T F A ) 平 衡的g R P C C 2 / C I 8 _ S T 乡6 / 1 0 0 反 相 色谱 柱， A冲洗 色谱 柱I C v 后， 运行 2 C V的A 一 3 5%I ( 乙 睛 ， 0.1% T F A ) 的 梯度洗 脱杂 质峰， 然后用1 0 c v的3 5 % 1 t o 7 0 % 1 的 梯 度洗脱不同 结 构的E F - G峰， 色 谱过 程在A K T A

307、 e x p l o r e r 1 0 上 进行，流 速0 .5 m l / m i n a4 .2 . 1 0凝 胶过滤 ( S E C ) 分析 1 0 0 w 1 样品 上至用流动相( 2 M u r e a , 5 0 m M N a 2 H P 0 4 , 0 . 1 5 M N a C l , p H & .4 ) 平衡 的S u p e r d e x 2 0 0 H R 1 0 / 3 0柱， 然 后以0 .5 m l / m i n在A K T A e x p l o r e r 1 0 上 洗脱。疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索4 .3 . 1 1浊度的

308、测定将复性样品装入 1 c m长比色皿中，以复性缓冲液为对照，测定3 4 0 n m的光吸收值。4 . 3 . 实验结果及讨论4 . 3 . 1稀释复性 如表4 . 1 所示，当变性E F - G在无助溶剂的复性缓冲液中 1 0 0倍直接稀释到2 4 0p g / m l 时， 有大量 沉淀生 成， 3 4 0 n m浊度吸 收 值为0 . 3 7 ， 将复性混 浊液于1 7 0 0 0 r p m离心3 0 m i n 除去沉淀后，发现上清蛋白 回收率只有4 9%，这表明此条件下复性和聚集是一个竞争性过程。将所得上清用R P - H P L C分析，同时以纯化的可溶性E F - G和变性E

309、F - G为对照，结果发现主要有三个峰含有 E F - G ,说明直接稀释复性导致多种折叠结 构 生 成( 图4 .2 a ) ， 其中 保留 体 积约为1 0 . 1 4 m l 的 第一峰与可溶 性E F - G 一 致，说明其为正确折叠峰，在1 3 m l 附近的第三峰保留体积与变性E F - G一致，说明它可能是未折叠的E F - G ，而保留体积在1 1 m l 附近的峰则可能为折叠中间体，因为其疏水性介于正确折叠结构和变性结构之间。 复性样品在较长时间的放置过程中， 第二峰没有自 发地转变成第一峰， 说明折叠中间体可能为正确折叠途径外的错误结构。 而且第三峰始终存在，暗示E F -

310、 G不能完全自 发折叠。 将反相色谱的三个E F - G峰积分，得到第一峰的含量仅为4 6 %。 上述数据说明， 直接稀释复性的E F - G ， 除了生成聚集沉淀还有大量错误折叠结构存在。 表4 . 1不同添加剂下稀释复性E F - G的结果比 较T a b l e 4 . 1 E f f e c t s o f a d d i t i v e s o n p r o t e i n r e c o v e r y a n d a c t i v e p r o t e i n r e c o v e r y o f d i l u t i o n r e f o l d i n g理论终浓

311、度实际终浓度蛋白收率正确结构含量添加剂浊度( !r 留 m l ) ( W 岁 M l )( %)( %)JOJino42CJ498091120190220240240240Z M 服0 . 5 M 精氨酸0 . 3 7O M0 . 0 0 8丝丝业 夔 乙 二 醉 丛 水 层 折 复 性 金 黄 色 葡 萄 球 菌 翻 译 延 长 因 子G ( E F - G ) 低浓度变性剂是常用的聚集抑制剂。如表4 . 1 所示，当在复性缓冲液中添加2 M脉时，无明显沉淀生成， 浊度吸收只有0 .0 2 ,随蛋白浓度的提高，变化不明显，甚至在毫克级的复性终浓度时， 也未见明显沉淀， 这表明低浓度脉能有效

312、地抑制聚集。 然而反相色谱分析显示， 2 M脉辅助的稀释复性导致4 种折叠结构生成， 除了上述的三种结构，出现一种新的折叠中间体， 其保留体积在1 2 m l 附近，暗示其折叠程度低于正确折叠结构和前一种中间体 ( 图4 .2 b )，其正确折叠结构含量仅为2 1 %。这说明尽管低浓度脉可以抑制聚集，但却阻碍了正确折叠。当在复性缓冲液添加 0 .5 M 精氨酸时，浊度吸收降到了0 .0 0 8 ，复性样品离心得到的上清蛋白回收率为9 1 %，这表明精氨酸能显著抑制复性过程中的聚集。 反相色谱分析显示， 保留体积约1 1 m l 的折叠中间体显著少于无精氨酸复性的样品，正确折叠结构峰含量提高到了

313、5 8%，说明精氨酸能部分促进正确折叠。 但它不能消除错误折叠中间体， 同时也不能有效地促使所有变性蛋白 质自 发折叠。因此E F - G是一种采用稀释法难以 有效复性的蛋白质， 原因可能在于多结构域的存在和大分子量使得难以形成正确的疏水核心。 图4 .2不同添加剂下稀释复性E F - G的反相色谱分析F ig . 4 . 2 R P H P L C c h r o m a t o g r a m s o f r e f o l d e d E F - G b y d i l u t i o n w i t h v a r i o u s a d d i t i v e s . ( a ) w

314、 i t h o u ta d d i t i v e s ; ( b ) w i t h t h e a d d i t i o n o f 2 M u re a ; ( c ) w i t h t h e a d d i t i o n o f 0 .5 M a r g i n i n e ; ( d ) p u r i f i e d E F - Go f s o l u b le e x p r e s s i o n . ( * ) C o r r e c t s t r u c t u r e ; ( # ) m i s f o l d e d o r u n f o l d e

315、d s t r u c t u r e s .疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索4 . 3 .2高盐吸附服脉冲洗脱的固定化P E G疏水作用层析促进E F - G正确折叠 如图4 . 3 所示， 当变性E F - G上至高盐缓冲液平衡的P E G疏水柱上后完全被吸附，高盐冲洗的穿过峰中不含E F - G ， 用复性缓冲液冲洗层析柱至基线，所得峰证明 仅含极少 量的E F - G ， 然后在柱上加入2 m l 腺缓冲液 ( 8 M u r e a , 5 0 m M T r i s , p H 8 .6 ) 再 用复性缓冲液持续洗脱得到一个高峰，其蛋白回收率为8 8%，表明 采用所

316、谓脉脉冲洗脱法可以有效地释放吸附的变性蛋白 质。反相色谱分析显示，脉脉冲洗脱峰的天然E F - G含量接近8 0 ， 说明此法可以 促使释放的E F - G正 确折叠( 图4 . 4 ) 。 其复性结果如表4 .2所示， 本方法采用的变性蛋白 浓度较高， 表明吸附过程可能受起始浓度影响较小， 而且 洗脱得到的 复性E F - G 蛋白 含量 达到了5 8 0 g g l m l ， 显 著高 于 稀释复 性 样，显示本方法具有潜在的应用价值。肆dl.，q口左.，曰飞。刀芝口名.一.已:一BA erA Butter e- -八 帕的朗40 1 s s o a eR e t e n t i o n

317、 v o l u ma f ml i 图4 .3 E F - G采用P E G疏水柱洗脱复性色谱图F i g .4 .3 P r o f i l e o f E F - G r e f o l d in g b y e l u t i o n f r o m P E G H I C c o l u m n a f t e r i t s a d s o 印 t i o n .B u f f e r A , ( 2 0m M T r is , 3 M ( N H 4 ) Z S O 4 , p H 8 . 2 ) ; B u ff e r B , ( 2 0 m M T r i s , 5 m

318、M R - M E , p H , 8 .6 ) ; B u ff e r C , ( 8 M u r e a ,5 0 m M T r i s , p H 8 . 5 ) . 气 E F - G p e a k 表4 . 2高盐吸附服脉冲洗脱P E G疏水作用层析复性E F - G的结果T a b l e 4 .2 T h e r e s u l t f o r r e f o l d i n g E F - G b y P E G H I C t h r o u g h p u l s e e l u t i o n w i t h u r e a f o l l o w i n ga d

319、 s o r p t i o n起始浓度装样量洗脱峰浓度蛋白回收率三 确折叠结构伽留m 1 )( m g / m , 介向( %)含量( % )2 4 0 . 3 5 8 0 8 8 8 04固定 化聚乙 二 醇疏水层 析复 性金 黄色葡萄 球菌 翻译延长因 子G ( E F - G ) 气 又、熟曰IJ!1产 ，八、健飞合咬口.倪 助， ， 盆， 匀 R e t e rti c n-1 . 旧佃 n勺 4， 3 图4 . 4 腺脉冲洗脱固定化P E G疏水柱复性E F - G的反相色谱分析F i g .4 .4 R P - H P L C c h r o m a t o g r a m o

320、f r e f o l d e d E F - G b y p u l s e e l u t i o n w i t h u r e a a ft e r a d s o r p t i o n a t h i g hs a l t c o n c e n t r a t i o n f r o m i mmo b i l i z e d P E G H I C .4 .3 3洗脱方式对P E G疏水作用层析复性效果的影响 图4 . 5 是采用不同方法释放吸附变性E F - G复性蛋白 收率的比较。当直接采用复性缓冲液冲洗层析柱时， 随离 子强 度降 低的 仅洗脱得到极少量的E F - G

321、( 约1 0 01 0 ) ， 这表明 变性E F - G在P E G柱上也形成多 位点的 疏水作用吸附， 大部分蛋白 质不能通过降低盐 浓度被洗脱。 在经典的 疏水作用层析分离过程中， 乙 二醇常用于洗脱在疏水柱上结 合较强的蛋白。 然而它却无法有效解吸结合到疏水柱上的 变性E F - G ， 即 使近1 0 0 01 0的浓度仅能 洗脱出5 % 的蛋白。 奇怪的是， 作为一种常用的反相色谱洗脱剂， 含0 . 1 %三氟乙酸的乙 醇也不能释放疏水结合的变性蛋白质。而表面活性剂-B e r o l 1 8 5 洗脱峰的蛋白 回收率也只有1 5 %。 这说明变性E F - G和介质间的疏水作用难

322、以 被添加剂的竞争性疏水作用所克服， 这可能是由于结合的疏水部位可能被掩盖而难以靠近。 由于疏水 作 用具 有强烈的 温度依赖性 2 i ， 降 低环 境 温度 可以 改 变体系热力学 平衡， 有可能削弱疏水作用强度。 将变性E F - G在室温下吸附到P E G疏水柱上后， 让层析柱和缓冲液置于冰浴中冷却， 然后用复性缓冲液洗脱， 结果发现此方法能洗脱出2 1 .7 % 的结合蛋白 质， 显著高于室温作用的 情况， 也由于上述的添加剂洗脱法， 暗示降温洗脱法可能成为疏水作用层析分离蛋白 质而维持生物活性潜在的有效方法。 遗憾的是， 反相色谱分析显示，低温洗脱峰只含有 1 8%的正确折叠结构，

323、表明低温虽有助于解吸变性E F - G ， 但却不利于其正确折叠。 而相比 之下脉脉冲洗脱的E F - G ，其蛋白 收率显著高K* 作 用层析及 其相关技 术辅助蛋白 质 折叠复 性的 探索于其他方法。 因此， 可以猜测服可以通过与吸附蛋白 质形成氢键而达到消弱蛋白 质和介质间疏水作用的目的。 而且， 它同时也增加了肤链的柔韧性， 从而有助于折叠过程所需的结构变化。一r w 一ethanol; b, ethylene glycot;c,B ero t 185; d, low才 -n p e r a i u r e ; e ， . 州卜U八U201人浮tl_二 _二 L矍 _ 0八曰0 8介n

324、4(%亡。毫之叨5.昌曲b cEl u t i o ndewa y s 图4 .5不同洗脱方法对固定化P E G疏水柱复性E F - G蛋白收率的影响F i g .4 . 5 C o m p a r i s o n o f m a s s r e c o v e ry o f E F - G r e f o l d i n g w i t h v a r i o u s e l u t i o n w a y s o n P E G H I C c o l u m n .D e n o t a t io n : m a s s r e c o v e ry o f r e f o ld i n

325、 g b y e lu t io n w ith B e r o l 1 8 5 is o b ta in e d u p o n S E C a n a ly s i s o fe l u t e d p e a k a d o p t i n g s o l u b l e E F - G a s r e f e r e n c e d p r o t e i n b e c a u s e it i n t e r f e r e w i t h p ro t e i n a s s a y b yB r a d f o r d me t h o d4 .3 .4洗脱剂中 脉浓度的影响

326、脉由于能改变结合蛋白 质周围水分子的有序结构而在疏水作用层析过程中 用作较强 疏水结合蛋白 质的 洗脱添加剂 1 9 0 ) 。 而高 浓 度变 性剂 常 用于 再生疏 水作 用层 析柱，通常清洗得到的蛋白质往往发生失活。 在蛋白质折叠复性过程中， 低浓度IN常用作助溶剂， 许多蛋白 质 在低浓度脉下 稀释 复 性时 复 性收率 显著提高 7 3 。 但E F - G在2 M脉中稀释复性时不能进行有效地折叠，暗示脉的添加可能抑制正确折叠。然而当变性E F - G吸附到疏水柱上后， 少量高浓度变性剂却反而能释放结合蛋白 质并且能促进其正确折叠， 这暗示脉在稀释复性和疏水作用层析复性过 程中的机理

327、可能迥然不同。 为了 探讨疏水作用层析上服脉冲洗脱复性E F - G的 机理， 在复性缓冲液中添加不同 浓度脉，考察服浓度对E F - G在P E G疏水柱上复性效率的影响，结果如图4 .b 所示。组 豹 迷 里 生望 遍担登噢鱼夔迫鱼 萄 球 菌 脚 译 延 长 因 子 G ( E F - G )J户左。长的目石一e澄 图4 . 6洗脱液中服浓度对固定化P E G疏水柱复性E F - G效率的影响F i g A . 6 E ff e c t o f u r e a c o n c e n t r a t i o n i n e l u e n t o n r e f o l d i n g

328、e f f i c i e n c y o f E F - G b y P E G H I C c o l u m n . F o rt h e c as e o f 0 M a n d 2 M u r e a , re f o l d i n g b u ff e r ( 2 0 m M T r i s , 5 m Mp - M E , p H 8 .6 ) c o n t i n u o u s l y a c t e d ast h e e l u e n t w it h o r w i t h o u t t h e a d d i t i o n o f u r e a . F o

329、 r t h e c as e o f 4 M , 6 M a n d 8 M , 2 m l b u ff e r ( 5 0 m M T r is ,p H 8 .6 ) c o n t a i n i n g v a r i o u s u r e a c o n c e n t r a t i o n i s a p p l i e d t o P E G c o u p l e d H I C c o l u m n t h a t b i n d su n f o l d e d E F - G u n d e r h i 沙s a lt c o n c e n t r a t i

330、 o n f o l l o w e d b y c o n t i n u o u s e l u t i o n w i t h re f o l d i n g b u ff e r . L e ftb a r s d e n o t e m as s r e c o v e r y o f re f o l d i n g ; r i g h t b a r s r e p re s e n t a c t i v e E F - G c o n t e n t a c c o r d i n g t o R P Ca n a l y s i s 如前所述，当直接采用不含服的复性缓冲液

331、洗脱时，盐浓度的降低仅导致 1 0 %的蛋白洗脱，暗示E F - G的吸附过程可能伴随结构变化，一部分蛋白质可能迅速发生疏水坍塌而减少了暴露的疏水表面从而使其能在低盐缓冲液中洗脱，R P - H P L C分析显示， 低盐浓度洗脱的E F - G其正确折叠结构含量仅为1 3 . 5 %， 说明这部分早期疏水坍塌的结构大部分形成错误折叠。当采用2 M脉脉冲方式洗脱时，不能解吸结合的变性E F - G 。 但用含2 M脉的复性缓冲液持续 洗脱时， 洗脱峰蛋白 回收率为1 5 % ， 其中正确折叠结构含量为2 3 %。当采用4 M腮缓冲液脉冲洗脱时，蛋白回收率提高到7 2 % , 洗脱峰中正确折叠结

332、 构含量只有8 % 。 当 用6 M脉缓冲液脉冲洗脱时， 蛋白 回收率达到8 5 % ，表明 在6 M脉条件下变性蛋白 质与介质的疏水作用可以 被克 服，有意思的是其正确折叠结构含量也只有 1 1 %。 这暗示中 浓度脉可能导致变性蛋白 质在释放的同时形成错误折叠中间体，它在疏水作用层析过程中难以 恢复正确折叠结构。而 8 M脉脉冲洗脱峰却能正确折叠，高浓度脉解吸时形成局部错误结构的可能性显著降低，它基本上在疏水作用层析过程中形成正确折叠结构。疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索4 .3 . 5高盐吸附脉脉冲洗脱不同疏水作用介质对复性效果的影响 图4 . 7 和图4 . 8 分别

333、为不同强度疏水作用介质采用高盐吸附脉脉冲洗脱复性E F - G的色谱图和复性结果。Ej 图4 . 7不同疏水柱采用脉脉冲洗脱复 性E F - G谱图比 较F i g ,4 . 7 C o m p a r i s o n o f p ro f i l e s o f re f o l d i n g E F - G b y v a r i o u s H I C c o l u m n s a d o p t i n g p u ls e e l u t i o n w it h 8M u r e a a ft e r i t s a d s o r p t i o n . ( a ) T r

334、i t o n X - 1 0 0 H I C c o l u m n ; ( b ) P h e n y l S e p h a r o s e 6 F F ( l o w s u b ) H I Cc o l u m n ; ( c ) B u ty l S e p h a r o s e 4 F F H I C c o l u m n ; ( d ) P E G 2 0 K H I C c o l u m n T r i t o n X - 1 0 0 是一种带P E G长链亲水末端和辛基苯疏水末端的表面活性剂， 当其亲水端化学键合到层析介质上表现为一种强疏水作用介质。 当 变性E F

335、- G吸附到高盐缓冲液平衡的T r it o n X - 1 0 0疏水作用层析柱上， 盐浓度降低不能洗脱出任何蛋白， 而采用8 M脉脉冲洗脱时， 得到一较小峰， 其蛋白回收率只有5 6 ， 这表明变性E F - G能被强疏水作用介质吸附而且难以有效地洗脱。 反相色谱分析显示服脉冲洗脱峰只含2 0 % 正确折叠结构，将其乘以蛋白回收率得到的正确折叠结构总回收率只有1 1 .2 %,说明T r i t o n X - 1 0 0 疏水柱不利于活 性结 构形成。 当P h e n y l 6 F F ( l o w s u b ) 疏水 柱吸附 变性E F - G后，盐浓度下降可以 洗脱得到极少量

336、蛋白，8 M脉脉冲洗脱时，得到2 个相连的 洗脱峰，暗示可能产生不同的折叠结构，总蛋白 收率为6 4%。反相色谱分析显4固定化聚乙 二醇疏水层析复性金黄色葡萄球菌翻译延长因子G ( E F - G )示前一峰正确折叠结构约为5 0%，而后一峰不含正确折叠结构，总活性结构收率为2 3 % 。 B u t y l 疏水作用层析按上述方法复性E F - G时， 脉脉冲洗脱得到三个峰，总蛋白收率提高到7 7 .5 %。 其中第一峰主要是正确折叠结构峰， 变性蛋白质和中间体含量很少，而第二和第三峰仅含极少量活性结构，总活性结构收率为3 0%。而采用弱疏水性的此可见，P E G疏水柱复性E F - G时，

337、蛋白收率为8 8 ， 正确折叠结构含量为8 0 。由介质疏水性对变性蛋白质的释放和正确折叠具有重要影响， 随介质疏水性减弱蛋白收率和正确折叠率显著提高。1 2 01 00一圈Ma s s r e c o v e r y ( % ) 口C o r r e c t s t r u c t u r e c o n t e n t ( %)朋创钊攀Pla补胭侣P工OJ遗T r i t o n P h e n y l B u t y l HI C me d i a typ e sPEG 图4 . 8不同疏水柱采用吸附后服脉冲洗脱复性E F - G效果比较F i g .4 .8 C o m p a r i

338、 s o n o f r e f o l d i n g e f f i c i e n c y w i t h v a r i o u s H I C c o l u m n s a d o p t i n g p u l s e e l u t i o n w i t h 8M u r e a a ft e r it s a d s o r p t i o n . M a s s r e c o v e ry d e s c r i b e d i n l e ft b a r s i n d i c a t e s t h e r a t i o o f m a s s o f e l

339、u t e dE F - G t o m a s s o f l o a d e d s a m p l e . A c t i v e E F - G c o n t e n t i n r i g h t b a r d e n o t e s r a t i o o f a c t i v e E F - G p e a k a r e at o t o t a l E F - G p e a k a r e a .4 . 3 . 6疏水作用层析穿过复性 上面的实验是将变性E F - G在高盐下吸附到疏水作用层析柱上， 然后采用脉脉冲洗脱复性。 在此欲将变性蛋白质直接穿过缓冲液平衡的疏水

340、柱， 对比两种方式的复性效果。图4 .9 为不同疏水柱穿过复性E F - G的色谱图，表4 .3 所示为不同疏水色谱穿过复性结果比较。 E F - G穿过T r i t o n X - 1 0 0 疏水柱时，复性缓冲液洗脱得到一个峰， 保留值约为7 .7m l ，接近于柱体积。 尽管此峰紫外吸收较高， 但其蛋白收率仅为7 . 5 %，而脉再生时疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复 性的 探索( a )( b )2八一咖魄、， 了1了了、，几百11/!1107昭05以D.10.04 .14 .2目1勺乙.c)今2瓦 二 二6(d )厂|.扮临以舫妇叭仙创、 l 飞厂 气 、 刀尹了亡亡11

341、!1;IIJ.J 、 一 一厂|仁一004咖哑州帅 夕任记史级。0024日1 0， 20 2 A日1 0 1 2R 翻 创 宙翻v o W mfi t 闹1R 创 翻 比 曲V O W想王 时， 图4 . 9不同 疏水柱穿过复 性E F - G色谱图F i g - 4 .9 P r o f i l e s f o r r e f o l d in g E F - G b y g o i n g t h r o u g h v a r i o u s H I C s . a , T r i t o n X - 1 0 0 H I C ; b , P h e n y l 6 F FH I C ;

342、。 ， B u t y l 4 F F ; d : P E G 2 0 K H I C .得到一明 显峰， 这表明 绝大部分变性蛋白 质不可逆吸附 到将疏水性的T r i t o n X - 1 0 0 疏水柱上，暗示蛋白质和介质间的强疏水作用可能阻止了蛋白 质自 身的自由 疏水坍塌。当 变 性E F - G在p h e n y l 疏 水柱上穿 过时， 得到两 个峰， 第一峰保留 体积约为3 m 1 , 蛋白 收率为4 .8 %, 第二峰保留体积与T r i t o n X - 1 0 0 疏水柱复性色谱图一致，其蛋白回收 率为6 2 % ， 8 m服再生 得到少 量蛋白 质。 B u t

343、y l 疏水柱穿过复 性E F - G 。 也 得 到 保留 值与P h e n y l 柱相 近的 两个峰。 第一 个峰的 蛋白 回 收 率 提高到了1 8 % ， 第二 峰为7 9% ， 表明绝大部分变性蛋白 都不被吸附。 这表明， 随介质疏水性减弱蛋白自 身 折叠的趋势逐渐增强， 而蛋白 质和介质间的不可逆疏水结合作用显著减弱， 从而使穿过峰的蛋白 回收率逐渐提高。 而疏水性最弱的P E G疏水作用层析穿过复性E F - G ， 第一峰面积明显大于其他层析柱， 其蛋白回收率大于6 3 %，第二峰则反而降低至1 5 %。上述4 W 定 化 聚乙 二 醇 疏 水 层 析 复 性 金 黄 色

344、葡 萄 球 菌 翻 译 延 长因 子G ( E F - G )结果提示， 第一峰蛋白收率随疏水性减弱而提高， 第二峰蛋白收率降低。 奇怪的是各疏水柱得到的第一洗脱峰澄清，而第二峰稍见混浊， 暗示后者可能有聚集现象。 反相色谱分析发现， 穿过复性峰中天然结构含量随介质疏水性减弱而提高， 然而均显著低于脉脉冲洗脱模式，表明采用穿过法疏水作用层析不能使E F - G正确折叠，吸附一洗脱模式可能是由于模拟了分子伴侣的捕捉一 释放过程， 从而促使变性蛋白 质在这一过程中发生结构重组而有利于正确疏水核心形成。 表4 . 3不同疏水作用层析穿过复性E F - G效果的比 较 f a b l e 4 .3 c

345、 o m p a r i s o n o f r e f o l d i n g e f f i c i e n c y o f E F - G b y g o i n g t h r o u g h v a r i o u s H I C s蛋白得率总蛋白收率正确结构含量正确结构总含量介质类型峰序号( % )( % )( % )( % )OC户07.5划T r i t o n X- 1 0 0P h e n y l F F0 . 9 71.5l3放187963司.几月1B u t y l F FP E G1 41 5 7 8 1 42 1 5 3 04 .3 . 7凝胶过滤分析复性E F -

346、 G B a t a s 等 1 6 3 1 发现蛋白 质 在凝胶过 滤柱上 折叠复 性时动力 学体积 有显著的 差异，李明 等 1 2 7 4 1 采用 凝胶过 滤方法对复性组 分进行了 分离 和鉴定。 在此凝胶 过滤用 于 分 析复性产物的动力学半径差异， 为了防止折叠中间体在柱中聚集而在流动相中 加入2 M脉。 图4 . 1 0 为穿过和脉脉冲洗脱法P E G疏水作用层析复性E F - G的凝胶过滤分析色谱图。显然采用19脉冲洗脱的复性 E F - G只有一个峰，其保留体积与纯化的可溶性E F - G一 致， 说明 此 法复 性的 样品 动力 学半径比 较均一 ( 图4 . 1 0 伪

347、) 。 而穿 过复 性得到的 两 个组分 ( 图4 .9 d ) 凝胶过 滤分析图 谱与 正 确折叠结 构显 著不同， 第一 个穿 过 组分疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索R e te n t ion v o l u te 叫 tenR e ten t io n v o l u te 例 mq 图4 . 1 0穿过法和服脉冲洗脱法P E G疏水柱复性E F - G的凝胶过滤分析F i g . 4 A 0 S E C a n a l y s i s o f r e f o l d e d E F 一w i t h P E G H I C b y g o i n g t h r o

348、 u g h w a y a n d a d s o r p t i o n - e l u t i o n . ( a )p u r i f i e d s o l u b l e E F - G ; ( b ) r e f o l d e d E F - G b y p u l s e e l u t i o n w i t h 8 M u re a ; ( c ) t h e f i r s t p e a k o b t a i n e d b yg o i n g t h r o u g h P E G c o l u m n ; ( d ) t h e s e c o n d p

349、e a k o b t a i n e d b y g o i n g t h r o u g h P E G c o l u m n . T h e p r o f i l e so n t h e u p p e r l e ft o f F i g c a n d d a r e f o r R P C o f re s p o n d i n g s a m p l e s .在凝胶过滤柱上出 现明显的两个峰， 第一峰与正确折叠结构保留体积一致， 第二峰洗脱体 积显 著大于正 确折叠结 构( 图4 . 1 0 ( c ) ) ， 由 此可以 推断穿 过复性 会导致不同 动力 学半径的折

350、叠结构生成。图4 . 1 0 ( c ) 左上角为第一组分的反相色谱图， 其中主含第二折叠中间体 ( 疏水性强于直接稀释复性的第一中间体) 和变性结构。 对比反相色 谱和凝胶过滤色谱图， 可以 推测凝胶过滤分析的 第二峰可能为反相色谱图分析中的 折叠中间体峰和变性蛋白峰。 上述结果与文献报道有出入， 因为正确折叠结构保留值小于中间体和变性结构， 这可能是由于后两者可能呈松散的长棒状结构， 便于蛋白通过肤链的运动而穿过凝胶中孔隙。 事实上， E F - G 在变性条件下凝胶过滤的保留体积约为8 . 7 7 m l ( 文中没有给出图谱) ，正好位于穿过复性第一组分的两峰之间，与上面的设想基本一致

351、。 穿过复性第二组分稍有混浊， 离心后将其用凝胶过滤分析显示一个峰， 但其保留体积明显大于正确折叠结构，说明它可能是聚集体，表明P E G疏水色谱穿过复性4 堕鱼些鳗到壑呸曼些鳖叁 丝鱼 萝 球 菌 翻 译 延 长 因 子 G ( E F -G )不能有效抑制聚集。 因此， 凝胶过滤分析也显示腺脉冲洗脱有助于E F - G正确折叠结构形成，而穿过复性会抑制正确折叠结构形成。 图4 . 1 1 是采用服脉冲法不同疏水作用介质复性E F - G( 所取样品为最高复性峰)的凝胶过滤分析图谱。与P E G疏水柱相比，显然图中所采用的疏水作用介质导致更多的折叠结构。其中疏水性最强的T r it o n

352、X - 1 0 0 取代的介质复性产物折叠结构数目 最多， 其第二峰与穿过复性第一组分的 第二峰保留体积一致， 可能为与之相似的中间体( 图4 . 1 1 a ) ， 在其之后出 现 一 保留 体 积 约为1 2 m l 的高峰。 疏水性 更弱的p h e n y l 柱复性E F - G的凝胶过滤色谱图中， 其第一峰和第二峰面积增大，而第三峰则减少，暗示 正 确折叠 结 构比 例的 提高。 显 然疏 水 性最弱的B 吻1 疏水 柱复性的E F - G的正 确折叠结构含量明显高于前两种疏水柱。 所以 从凝胶过滤色谱分析也可以 看出， 随介质疏水性增强，正确折叠难度增加，错误折叠结构增多。八卜一

353、 吸叭执曰扮1 一司1叫J.刘上叫 一趁占雳咤 八1一勺 众八八曰 夕健一春才11曰jl日琦tl、了一1广 J了了1 红认门书 3、 _ _ _3 d 6日怕1 2林， 全 a 4 备 石 7 妞 ， 协 朽 1 2币 J协 俗盆感.性刃住M】 仙州 a n 刚- 祠 图4 . 1 l不同疏水作用介质眠脉冲洗脱复性E F - G的凝胶过滤色谱分析F ig . 4 . 1 1 S E C a n a l y s i s o f re f o l d e d E F - G w i t h v a r io u s H I C m e d i a 勿p u l s e e l u t io n w

354、 i t h u r e a . ( a ) W i t hT r i t o n X - 1 0 0 H I C ; ( b ) Wi t h P h e n y l H I C ( l o w s u b ) ; ( a ) Wi t h B u t y l H I C4 .4 本章小结 ( 1 ) E F - G稀 释复 性形成多 种 错 误折叠 中间 体。 将变性E F - G在高 盐下 吸附 到固 定 化P E G疏水柱上后， 采用8 M服脉冲洗脱复性， 蛋白回收率高达8 8 %，正确折叠结构含 量达到8 0 % ， 复 性蛋白 浓 度为5 8 0 p g t m l ， 复 性效

355、率显 著高 于稀释 法。 ( 2 ) 采用竞争性疏水作用试剂和低温方式不能促进释放蛋白 质正确折叠，表明脉脉冲解吸是释放疏水结合变性蛋白质的有效方法。疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索 ( 3 ) 采用强 疏水作用 介质和穿 过 方 式均不 能促 使E F - G正 确折叠， 表明固 定 化P E G可以 提供一个有利于蛋白 质折叠的环境， 而一种类似分子伴侣复性蛋白 质机理的吸附一释放讨程是疏水作用层析成功复性 E F - G的必要条件。固定化的聚合p -5F糊梢柱上复性E F - G5固定 化的聚 合p 一 环糊精 柱上复性E F - G 前面章节阐述了甘油介导下商业化疏水作

356、用层析以及固定化 P E G疏水作用层析在吸附一洗脱模式下能促进蛋白质正确折叠， 其原理可能是模拟了分子伴侣对底物蛋白质的捕捉一释放机理， 使得变性蛋白质经历一个疏水作用主导的结构重组过程， 从而有利于正确结构形成， 因此疏水作用层析某种意义上可视为一种固定化的人工分子伴侣。 然而上述疏水作用层析会导致变性蛋白 质的多位点吸附， 往往需要采用变性剂来解吸结合蛋白质，而变性剂的存在有可能对某些蛋白质折叠造成负街影响。 1 9 9 5 年G e l lm a n 实 验室 11 4 0 7 采 用表面 活性 剂和 环糊精 组成 人工分 子伴 侣用于 蛋白质体外复性， 第一步用表面活性剂捕捉变性蛋白

357、质， 形成表面活性剂一蛋白质的复合物; 第二步加入环糊精将表面活性剂从蛋白 质上剥离， 从而启动蛋白质折叠，这两步骤与疏水作用层析吸附一洗脱模式有类似之处， 它们也可能促使变性蛋0 质经历一个疏水作用主导的结构重组过程。 某些模型蛋白质采用上述分子伴侣分批复性， 复性收率显著高于直接稀释复性。 人工分子伴侣的出现为解决疏水作用层析解吸多位点结合蛋白质的矛盾提供了一个新的思路， 即引入对疏水配基有特异亲和力而自身又具有良好亲水性的物质， 坏糊精就具有这样的特点。 然而经典的人工伴侣复性蛋自质是在溶液系统中进行的， 蛋白质在捕捉和释放过程中可能面临类似于稀释复性存在的分了间聚集，因而不利于获得高浓

358、度的复性产物。 本章利用文献报道的人工分子伴侣作用原理与层析介质相结合， 设计一种固定化人工分子伴倡用来复性 E F - G ，使变性蛋白质在一个相对隔离的环境被捕捉和释放，从 而设法 避免 高浓 度下的 聚集。 将 p 一 环 糊精 ( P - C D ) 聚 合形成 可溶性高 分 子， 然 后 A联到琼脂糖介质上， 用于从蛋白质的复合物上剥离表面活性剂。由于琼脂糖介质内部为蛋白 质分 子可 以 进入 的大 孔， 而 机联的 聚合 p - C D又 可作 为柔 切性的 手臂， 因 而固 定化聚 合p - C D对蛋自 质 具有良 好的隔 离效 果， 可以 有 效地 防i t 结 合蛋白 质

359、释放时 的 相互聚集。 而为了抑制捕捉过程中的聚集， 设法采用表面活性剂胶束来分隔变性蛋白 质实验考察了表面活性剂种类和浓度对变性E F - G捕捉效果的影响， 设法得到高浓度的表 面活 性剂一 蛋白 质复 合物， 采用固定 化 聚合 p 一 环 糊精剥 离表面 活性剂 ， 尝试 得到高 浓度 的复 性金黄 色葡 萄球菌E F - G ( 简 称E F 句， 并 和p - C D单休、 可 溶性冬 C D聚 合疏水 作用 层析及 其相 关技术 辅 助蛋白 质折 叠复 性的探 索物、固定 化的 价 C D单体以 及未祸联介质剥离 表面活性剂的剥离效果以 及促进正确折叠的能 力进行比 较。 此外还

360、 考察了 固定化聚合p 一 环糊精穿过法的复性效果，对表面活性剂 捕捉一固定 化聚合口 一环糊精释 放的 作用机理作了探讨。5 . 1实 验材料 p 一 环 糊精( p - C D ) 购自 天津化学试剂厂， P - C D祸联S e p h a r o s e 6 B由G E H e a l t h c a r e公司提供，其它相关材料同第四章，所用化学试剂除特别说明外均为分析纯。5 .2实验方法5 . 2 . 1 E F - G 工程菌的克隆、表达、包涵体的变性和可溶性 E F - G的制备 同第四章5 .2 . 2聚合p - C D的 合成 取5 0 % ( w t v ) N a O

361、H 2 5 0 m l ， 去离子水2 5 0 m l 和 0 . 6 g N a B H 4 置于2 0 0 0 m l 圆 底烧瓶中， 然后加入2 5 0 g p - C D ，室 温机械搅拌过夜，转 速5 0 0 r p m 。 次日 清晨将温度提高到3 0 0 C，并迅速加入! 7 5 m l 环氧氯丙烷，继续 搅拌。 4 h后加入2 5 0 m l 丙酮终止反 应。持 续搅拌l h 后， 加入浓盐酸调P H至1 2 ，可以 看见溶 液分成 两层， 尽可能去除有机溶剂的上层，然后 将温度提高 到5 0 0 C ,搅 拌 6 h o 然后用盐 酸调P H至7终止反应， 即 得聚合p -

362、C D 。 将其 上S e p h a d e x G - 2 5 柱， 用水洗脱， 收集第一峰， 即为纯化的 聚合p - C D .5 .2 . 3聚合p - C D的固定化 称取 1 0 0 g湿a l l y - s e p h a r o s e H i g h P e r f o r m a n c e凝胶 放入一 个5 0 0 m 1 烧瓶中， 加入4 0 0 m l 水 和 1 0 0 m m乙 酸钠， 然后在通风橱中逐渐滴加澳水，不断搅拌至 凝胶呈持续的淡黄色。 将所得澳化凝 胶用过量 水洗涤至白 色，然后加入 1 6 5 m l 上面 纯化的聚合p - C D溶液，在1 0

363、0 r p m转速下搅拌1 h 后， 加入1 2 . 5 g N a O H和0 .2 g N a B H 4 ,在3 0 0 C下 搅拌过夜，次日 用 冰醋酸 将P H值调至6 - 7 , 最后用大量水 冲洗祸联的凝胶。5 . 2 .4 E F - G稀释复性 同第四章5固定化的聚合P 一 环糊精柱上复性E F - G5 .2 . 5表面活性剂捕捉变性E F - G 将0 .9 m l 复性缓冲液( 5 0 m M T r i s , 5 m M G S H , 0 . 5 m M G S S G p H 8 .6 ) 加入至5 0 p d2 4 m g / m l 变性E F - G与5

364、0 p 1 含1 0 %T r i t o n X - 1 0 0 , 5 0 m M T r i s , p H 8 .6 的混合液中。 分别改变表面活性剂种类、 T r i t o n X - 1 0 0 浓度按此方法操作， 并立即测定3 4 0 r u n处的吸收值随时间变化的曲 线。 另外将不同 体积的变性E F - G 2 0 倍稀释至含不同 浓度T r i t o n X - 1 0 0 的 缓冲液( 5 0m M T r i s , p H 8 .6 ) 中或者与等体积不同 浓度T r i t o n X - 1 0 0 混合后再2 0 倍稀释， 分别得到不同的终蛋白浓度和不同的

365、T r i t o n X - 1 0 0 终浓度， 测定2 0 m in 后3 4 0 n m的吸收值。5 .2 .6 p - C D单 体和聚 合p - C D溶 液分 批复 性 表面活 性剂 捕捉的E F - G 5 0 V I 2 4 m g / m l 的 变性E F - G与5 0 g l 1 0 % T r i t o n X - 1 0 0混 合， 然后分 别以2 0和5 0 倍用复 性缓冲液( 5 0 m M T r i s , 5 m M G S H , 0 . 5 m M G S S G p H 8 .6 ) 稀释， 然后加入p - C D和聚合p - C D至3 % (

366、 w / v ) 的 终浓度。5 .2 .7表面活性剂捕捉的E F - G柱上复性 将上述方法得到的表面活性剂一蛋白 质的复合物迅速上至复性缓冲液( 5 0 m MT r i s , 5 m M G S H , 0 .5 m M G S S G p H 8 .6 ) 平衡的固 定化聚合p - C D S e p h a r o s e H P 柱( 1 0 0 x 1 0 m m i .d 上， 然后以。 .5 m l / m i n 的 流 速用 上述缓冲液 洗脱。 分 别用未祸联的A l l y l S e p h a r o s e h i g h p e r f o r m a n c

367、 e ( H P ) 柱 ( 1 0 0 x 1 0 m m i .d .) 、 固 定化R C D S e p h a r o s e C L - 6 B柱 ( 1 0 0 x 1 0 m m i .d .) 按上述方法运行。5 .2 . 8柱上穿过复性 将5 0 u 1 变性E F - 。 上至复 性缓 冲液( 5 0 m M T r i s p H 8 .6 ， 5 m M G S H , 0 .5 m MG S S G ) 平衡的 聚合p - C D环糊精祸联的S e p h a r o s e H P 柱( 1 0 0 x 1 0 m m i .d . , 8 m l ) 上， 然后

368、以 0 . 5 m l / m i n的流速用上述缓冲液洗脱。为防止蛋白质在管道中聚集沉淀，上样前后注入1 0 0 闪变性剂。 上述过程在A K T A e x p l o r e 1 0 层析系统中 进行。 分别 用未祸联的A l l y l S e p h a r o s e h i g h p e r f o r m a n c e ( H P ) 柱 ( 1 0 0 x l O m m i .d .) , p C D祸联 S e p h a r o s e C L - 6 B H R 柱( 1 0 0 x I O m m i .d .) 按上 述方法运行。5 .2 .9荧光光谱分析 将

369、上面得到的捕捉和复性后的E F - G上H i t r a p D e s a l ti n g c o l u m n ( 5 m 1 ) 脱盐柱， 用疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索缓 冲 液 ( 5 0 m M T r i s , 0 . 1 5 M N a C l , p H 7 .5 ) 洗 脱， 收 集 第 一 峰。 脱盐 的 蛋白 质 和 纯 化的可溶性E F - G用相同的缓冲液稀释至约2 3 0 l t g / m l , 然后在J a s c o F P - 7 5 0荧光光谱仪上测定荧光发射光谱。 样品在2 8 0 n m波长激发， 发射光谱于3 0 0

370、 -4 0 0 n m之间监测。5 .2 . 1 0圆二色分析 将脱盐 柱分离的 样品 用上 述缓冲 液( 5 0 m M T r i s , 0 . 1 5 M N a C l , p H 7 习调至约4 1 4 L g / m l , 将 其加入1 m m长比 色皿中， 然后 在J a s c o J 8 1 0圆 二 色谱仪 ( 日 本J a s c o 公司 )上测定圆二色光谱。5 .2 . 1 1 反相高效液相色谱分析同第四章方法。5 .2 . 1 2凝胶过滤分析同第四章方法5 .3结果及讨论5 .3 . 1表面活性剂捕捉变性E F - G5 . 3 . 1 . 1表面活性剂一 E

371、F - G复合物的形成 文 献报道， 表面活性剂能 作为 稀释复 性的 助溶剂提 高复 性 收率 。 2 4 1 。 但在 人工分子伴侣复性蛋白质的过程中， 表面活性剂用于捕捉变性蛋白质， 形成一种无活性的蛋白 质一 表面 活性剂复合物 。 4 0 1 。 本实验 将1 0%T r i t o n X - 1 0 。 与等体积高 浓度的 变性E F - G混合， 然后用复性缓冲液将其2 0 倍稀释， 得到澄清溶液， 表明表面活性剂的存在能显著抑制变性蛋白质稀释时的聚集沉淀。 为了判断此溶液导致蛋白质的折叠还是形成表面活性剂一蛋白质的复合物， 我们采用下列方法对其进行了分析。 图5 . 1 为此

372、溶液的凝胶过滤和反相高效液相分析色谱图。 表面活性剂捕捉的蛋白质凝 胶过滤洗 脱峰 ( 图5 . 1 ( c ) ) 保留 体积 稍大于 天 然结构 ( 图5 . 1 ( a ) ) , 表明 其表观动 力学体积大于后者。 而反相色谱更清楚地显示， 表面活性剂浦捉的蛋白 质具有大量的折叠中间体， 而没有天然结构存在。因此可知表面活性剂添加下， 不会使E F - G折叠成天然结构而是形成一种复合物。 表面活性剂的结合使此复合物的表观动力学体积大于天然结构。5固定 化的聚合R - 环糊精 柱上复 性E F - G( a )( b ) 八日川曰ILIlill、Jeslleslll 产 一JI 0 j

373、ll/， 丁一s o- O-叮咨 厂 ，阵了 一 、 八 仁产 了 尸R e t e n t i o n volume(ml)R e t e n ti o n v o l u me ( mq 图5 . 1 表面活性剂一E F - G复合物的凝胶过滤和反相色谱分析F i g .5 . 1 S E C ( a , c ) a n d R P - H P L C ( b , d ) a n a ly s i s o f c o m p l e x o f d e t e r g e n t a n d p r o t e i n .( a ) a n d ( b ) s o l u b l eE F

374、 - G ; ( c ) a n d ( d ) c o m p l e x o f d e t e r g e n t a n d E F - G . 图5 . 2为表面活性剂一蛋白质复合物和天然 E F - G的荧光光谱。天然E F - G的最大发射波长为3 4 0 t n n ，变性E F - G的最大发射波长为3 5 5 n m，而复合物最大发射波长为3 1 9 r im，显然此复合物与天然结构和变性结构均不同。从表面活性剂一蛋白 质复合物和可溶性 E F - G的圆二色光谱图 ( 图5 .3 )可知，此复合物具有一定的二级结构， 但其含量显著低于天然态， 这表明 它可能 是一 种折叠

375、不完全的结构。5 . 3 . 1 .2表面活性剂种类的影响 表面活性剂一蛋白质复合物的形成和聚集沉淀的抑制是人工分子伴侣辅助蛋白质复性的前提条件。 在此以聚集沉淀生成的动力学为检测指标， 多种表面活性剂被尝试用于捕捉E F - G e P l u r o n i c F 1 0 8 为两个聚氧乙 烯亲水末端中间夹着疏水性的聚氧丙稀的表面活性1A 水作 用 层 析 及 其 相 关 技 术 辅 助 蛋白 质 折叠 复 性的 探 索 b2 尸一一一一、厂伙 - / 一一_一一一一 丫、 簇之jJ卞1曰14上下刁JJ习喻lr900刚加诩刘400a00咖100。 身忍.P台吕留吕从3 的3 2 03 4

376、 03 6 0w a v e I N口 卜 ( n m )3 6 0 4 0 0图5 .2 表面活性剂一蛋白质复合物和可溶性E F - G荧光光谱F i g . 5 . 2 I n t r i n s i c F l u o r e s c e n c e o f s o l u b l e E F - G a n d c a p t u r e d E F - G勿T r i t o n X - 1 0 0 . a , n a t i v e E F - G ; b ,c a p t u r e d E F - G w i t h T r i t o n X - 1 0 0 ; c , d

377、e n a t u r e d E F - G .厂- 一 一1 s 恋2 幻 口2 1 0 2 2 0 2 加2 4 0 Wa v e l e n g t h l n ml2 5 口2 6 0 图S J表面活性剂一蛋白 质复 合物和可溶性E F - G的国二色光谱F i g .5 .3 F a r - u l t r a v i o le t c ir c u l a r d i c h r o is m ( C D ) s p e c t r u m o f s o l u b l e E F - G a n d c a p t u r e d E F - G b yT r i t o n

378、 X - 1 0 0 . a . c a p t u r e d E F - G w i t h T r it o n X - 1 0 0 ; b , n a t i v e E F - G .剂， 其亲水性较强。 如图5 .4 所示， 显然P l u r o n i c F 1 0 8 不能阻止聚集生成， 几乎在变性蛋白 质稀释的同时就有大量沉淀生成， 其聚集动力学曲线与无表面活性剂存在时( 图5 . 5 a ) 相近， 说明它不能结合E F - G而抑制聚集。 而T w e e n 8 0 的存在可以 在稀释起始阶段抑制聚集，但随着时间的延长沉淀很快产生，最后形成的沉淀儿乎接近于P l u

379、 r o n i c F 1 0 8 , 说明T w e e n 8 0 只能 暂时结合E F - G , 随蛋白 质的折叠它可能很快脱落，从而 不能 有效抑 制聚 集沉淀的 生成。 而B e r o l 1 8 5 , N P 4 0 a n d T r i t o n N 1 0 1 的 加 入能 显著抑制聚集生成，它们显然和T r i t o n X - 1 0 0效果一样能和变性E F - G形成相对稳定的5固定化的 聚合 p 一 环 糊精 柱上复 性E F - G复 合物。 T r it o n X - 1 0 0 , T r i t o n N 1 0 1 , B e r o l

380、1 8 5 a n d N P 4 0 的H L B 值( 亲水一 亲 油值)分别为1 3 . 5 , 1 3 .4 , 1 3 .5 和 1 3 . 1 ， 而T w e e n 8 0和 P lu r o n i c F 1 0 8分别为1 5大于2 4 。 这表明H L B值可能对表面活性剂捕捉E F - G的能力有重要影响， H L B 值过大的表面活性剂可能不能有效结合蛋白 质，从而无法抑制聚集。一 : :A q . p p -p -o . o- 。 一。 一 。 。 _ 。 。 a 。 一 。 ， 。 一 。 一。 。 。 一 ， 。 。 。 一。 一 。 一 。 。 一 。 f

381、二 J b 一 卜 一 一 了 i夕了j-:;s if 4MA释: i8 b 将4 m g / m l 的 变性G F P 与。 . 1 g 固 定 化T r it o n X - 1 0 。 介质 混合， 加入2 . 5 m l 的 复性缓 冲液I ( 2 0 m M T r i s , p H 8 .6 ) ， 将介质 装入小 柱巾， 然后用含不同 浓度P - C D的 复性缓冲液I 洗脱。6 . 2 . 1 2凝服过滤分析复. 庄G F P 复 性G F P 上至用 流动相( Q : 5 0 m M N a 2 H P 0 4 , p H 8 .0 ) 平衡的S u p e r d e

382、x 7 5 H R 1 0 / 3 0 ，然后以。 5 m l / m i n 洗脱， 采 用2 8 0 t u n , 4 7 5 n t t r 双 波长检 测.6 .2 . 1 3复 性G F P 的 紫外光 谱分 析 复 性G F P 在H i t r a p D e s a l t i n g ( 5 m l ) 上 用缓 冲液 ( R : 5 m M T r i s , p H 8 . 0 ) 置 换后 进行 紫外扫描。6 .2 . 1 4荧光光 谱分 析 将上述脱A 样品 用 ( Q : 5 0 m M N a 2 H P O 4 , p H 8 .0 ) 稀释至约2 0 1x

383、g l m l ， 在4 7 5 n m下激发记 录4 9 0 n t n 至6 0 0 tu n 的荧光光谱。6固定化T r it o n X - 1 0 0柱上复性绿色荧光蛋白6 . 3结果及讨论6 .3 . 1可溶性G F P的稀释复性 1 8 0 C下表达的G F P 工程菌破碎液上清具有绿色荧光， 表明可溶性G F P为具有成熟荧光发射团的天然结构。为了和 G F P包涵体蛋白 质复性进行比较，在此将纯化的可溶性G F P 冻干后按包涵体的方法进行变性，于3 7 0 C温育3 h ，发现荧光消失，证明 其天然结构的 丧失。 然后将3 0 m g / m l 的 变性可溶性G F P

384、分别滴加至加入无添加剂、含0 .5 M精氨酸和含2 M脉的复性缓冲液中 进行稀释复性，终浓度为2 0 0 I t g / m l 。结果如表6 . 1 所示。 表6 . 1 变性可溶性G F P 不同添加剂存在下复性结果比 较T a b le 6 . 1 : C o m p a r i s o n o f r e f o l d i n g r e s u l t o f u n f o l d e d s o l u b l e G F P b y d i l u t i o n as s i s t e d b y v a r io u sa d d i t i v e s相对荧光密度O

385、D 4 7 5 n m天然结构含量复性条件混浊程度(% )( %)l007713ll件nU气乙11005130 天然G F P0 .5 M A r g 辅助稀释复 性无添加剂稀释复性2 M服辅助稀释复性 D e n o t io n : R e l a t i v e fl u o r e s c e n c e d e n s i t y w a s r e p r e s e n t e d b y t h e r a t i o o f fl u o r e s c e n c e o fr e f o ld e d G F P t o t h a t o f n a t i v e G

386、 F P a t t h e s a m e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . N a t iv e s t r u c tu r e c o n te n tw as r e p r e s e n t e d 妙 r e l a t i v e a r e a o f m a t u r e G F P p e a k t o t o t o a l a r e a o f a l l G F P p e a k s a t 2 8 0 n m u p o nS E C a n a l y s is . 精氨酸添加下复性产物澄清无沉淀出 现

387、， 在紫外灯下有显著荧光， 荧光扫描显示相对荧光密度为5 1%。无添加剂的直接稀释复性产物，出 现少量沉淀，相对荧光密度为3 0 。 而2 M脉复性产物澄清， 但基本无荧光。 由于具有荧光发射团的天然G F P在4 7 5 r u n 处有特征吸收， 其吸收值显著大于2 8 0 m m ，因此测定O D 4 7 5 n m 与O D 2 8 0 n m比 值可以 方便地推测复性样品中天然结构的含量。 精氨酸复性可溶性G F P 的O D 4 7 5 a m与O D 2 8 0 r m 比 值最接近与天然样品， 无 添加剂复性样品比 值为精氨酸复性样品的 一半，而2 M脉辅助复性样品的比值最低。

388、由于G F P 折叠成功后形成一结构致密的桶状结构，使得其动力学体积与折叠中间体和变性G F P有显著差异，因而可以将上述样品鲍 鑫 作 用 层 析 及 其 相 关 技 术 辅 助 蛋 白 质 折 叠 复 性 的 探 索.二八二纵践眯曰 ， 2 P 愧 加石0落， 。百 一4020 ( a )它宁盛宫0早ZJ考S1 0 I t 1 2 ， 3 1 4口，2吝峪5盛T(d )右，打1 0 ， 勺 t 2 ， J 祠一 卜 一2 的 肠 巾- 卜 一 月 了三的 爪只伙。成热打叨加.典北二二口八娜服翼一拱城尸叼朋胡加加和 众、毛丫吕.佗0.泥口，2 2 4 5肠，9 9 1 0 1 1 1 2 1

389、 3 1 40，2 0 4 5份7.1 0 1 1 1 2 ， ， 1 4R 川的目 曲 ， 。 如 . 爪时m 仆日 曰a n fl O . -I . . 州川 吸 图6 3复性的可溶性G F P 凝胶过滤色谱图F i g .6 . 3 C h r o m a t o g r a r n s f o r S E C a n a l y s is o f r e f o l d e d s o l u b l e G F P . a , p u r i f i e d s o l u b l e G F P ; b , 0 . 5 MA 心n i n e - a s s i s t e d d

390、 i l u t i o n r e f o l d i n g ; c , u n a s s i s t e d d i l u t i o n r e f o l d i n g ; d , 2 M u r e a - a s s i s t e d d i l u t i o nr e f o l d i n g . * , n a t i v e G F P离心后采用凝胶过滤法分析， 同时根据天然G F P 紫外的 特征吸收， 选择2 8 0 n o t 和4 7 5呱 双波长检测， 结果发 现不同 添加剂下的复性样品凝胶过滤色谱图有显著的差异( 图6 3 ) 。 可溶性天然G F

391、P 呈现单峰， 保留 体积约为1 1 m l ， 其中O D 4 7 5 111t1 吸收值显著高于O D 2 s N m ， 与紫外扫描数据一 致( O D 4 7 s tt111: O D 2 s o r,m 1 . 3 ) c 精氨酸复性样品凝胶过滤色 谱图 有一个 保留 值与天 然G F P 一 致的高 峰( 其 不同 波长吸收 值的比 例与天然G F P - -致) ， 但在7 .9 m l 洗脱 体积处出 现一小 峨其 不同 波长 吸收值关系为: O D 2 s O 1111r O D 4 r 5 耐可能为可溶性聚合体， 其中天然结构峰面积含量为7 7( 表6 . 1 ) 。 无添

392、加剂存在时，稀释复性上 清的凝胶过滤色谱图， 聚集体峰显著增大， 天然结构峰面积含量为2 4 % 。2 M脉辅助的稀释复性样品的 凝胶过滤色谱图显示多峰出 现， 除了 聚集体峰， 在其与活性峰之间出现了2 个峰， 可能为折叠中间体， 且聚集体峰和折叠中间体峰不同波长的比 值与前二者显著不同， 活性峰面积含量仅为1 0%。 收集凝胶过滤洗脱峰进行荧光扫描发现，只有1 t m l 处洗脱峰有荧光， 且相对荧光密度为1 0 0 % ，这说明 凝胶过滤分析可以用于精确地反应折叠产率。6固 定化T r it o n X - 1 0 0柱_ L 复 性绿色荧光蛋白 上述数据表明采用精氨酸辅助稀释复性可溶性

393、G F P ， 既能抑制聚集又能促进正确折叠， 其活性收率较高， 无添加剂直接稀释复性不仅会产生聚集沉淀， 而且不利于活性结构形成，而2 M脉尽管可以 抑制稀释复性的聚集沉淀，却会导致 G F P的不正确折叠。 我 们的实 验证明， 无添 加剂 存在 下复 性终 浓度为2 0 0 l t g t tt t l 时 稀释复 性 效率 2 4% ) 低于 文献 报道值5 0 % 1 3 04 1 ， 可能 是由 于复 性 浓度相 对较高的 缘故。 而精 氨酸 添加能显著提高复性收率。因此， 在优化条件下 ( 如精氨酸的添加) ， 变性的可溶性G F P采用稀释复性能达到较高的复性收率。6 .3 .

394、2 G F P 包涵体变性蛋白质的稀释复性 上面实验结果显示， 变性可溶性G F P 在优化条件下能得到较高的复性收率。 然而G F P包涵体变性蛋白 质采用上述方法复性时，复性效率远低于变性可溶性 G F P e图6 .4 ( a ) 和 ( b ) 分别为 复性蛋白 浓度 对聚 集体生 成和 天然结 构 含量的 影响。乙n o a d d 阅心2Mu m 旧以升 ， 让 S M. m i n i m一.2跳爪 泊-0 15 Me 1r i m一盛一. 们扭地石 、 吧加洲气劲朽相/ 1一 、 ，一一- 一一 一一一求下二。二贫书200如。愁月00早 戴 聋T=B 一 兰 一_二一: 已1

395、0 0， 油 1 4 0 1 60 4 8 0 2 0 0 2 2 0 0即钓印即_. 3T T N1+ - T r r T 日035咖仍叨比010005咖 遥。胃00两 dO n C o n o e r d r a f o n ( u g tr n t)P r o t e 讯c o n c e n h 相o n ( u g t n) 图6 4蛋自浓度对G F P 包涵体蛋白 质稀释复性效果的影响F i g .6 . 4 E ff e c t o f p r o t e i n c o n c e n tr a t i o n o n a g g r e g a t e ( a ) a n d

396、 c o n t e n t o f n a t iv e s t r u c t u r e ( b ) f o r r e f o l d i n gb y d i l u t i o n a s s i s t e d b y v a r i o u s a d d i t i v e s . a l , b l , r e f o l d i n g w i t h o u t a d d it i v e s ; a 2 ,b 2 , r e f o l d i n g i n t h ep r e s e n c e o f 0 . 5 M A r g i n i n e ; a

397、3 , b 3 , r e f o l d i n g i n t h e p r e s e n c e o f 2 M u r e a . 如曲线a l 所示，无添加剂直接稀释复性时，随着复性蛋白 浓度的提高聚集沉淀的量显著增加， 且其浊度显著大于可溶性G F P 的复性产物， 这说明G F P 包涵体蛋白质稀释复 性时更易发生聚集沉淀。 采用凝胶过滤分析复性产物的上清时发现， 虽然在2 0 u p / m l 复性浓度下无沉淀出 现，然而其天然结构含量仅为1 4%，随复性蛋白 浓度疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的 探索的 提高， 其天然结构产率 进一步 下降， 在2 0 0

398、 p g / m l 浓 度时， 复 性上清中 天然 结 构收率仅为4 .7 %,所以蛋白浓度的提高不仅会促进聚集沉淀而且会阻止天然结构形成。曲 线a 2 和a 3 分别为添加0 .5 M糟氨酸和2 M脉后， 稀释复性产生的聚集体随蛋白 浓度的变化，显然二者都能明显抑制聚集生成。如曲线b 2 所示，与无添加剂相比精氨酸添加能部分促进正确折叠，而2 M脉辅助稀释复性的G F P 天然结构含量在各种蛋白 浓度下均接近于零 ( 曲线b 3 ) ， 表明2 M脉尽管能抑制聚集沉淀， 却会抑制正确折叠。 图6 . 5 为G F P 包涵体蛋白 质稀释复性产物的 凝胶过滤分析色谱图。 无添加剂直接稀释时，

399、 2 0 u g / m l 浓度下的复性产物天然结构相对峰面积甚至低于可溶性G F P 在2 0 0ll g f m l 时的 复 性产物 ( 图6 .3 砂 ) ) 。 2 0 0 u g / m l 浓度下，各 种添加 剂存在时G F P 包 涵 体蛋白 质的 稀释复性产物上清中 可溶性成份正 确结构含量均远低于变性可溶性G F P 。 因此G F P 包涵体蛋白 质的复性难度远大于可溶性G F P . 可溶性G F P稀释复性效率较高可能是由 于尽管其三级结构被破坏， 然而它保留了 成熟的 荧光发 射团， 所以 复性 过 程不 涉及荧 光发 射团 的 形成 过程p 峋。 而G F P

400、包涵体蛋白质没有成熟的荧光发射团， 其复性除了涉及肤链的折叠过程外卜 还需要荧光发射团的正确形成， 而这二者是高度祸联的， 因此它的复性过程是缓慢而低效， 这与文献报道是一致的 3 0 1 16 . 3 . 3经典层析方法复性G F P 包涵体变性蛋白 质 由于层析介质能隔离蛋白 质从而抑制复性过 程的聚集， 在此采用不同的层析方法来复 性G F P 包涵体蛋白 质， 观察它们抑制聚集和促进正 确折叠的能力。 表6 .2 为各 种层析方法复性结果的比较。 将G F P 包 涵 体 变 性 蛋白 质 吸 附 到H it r a p Q F F 阴 离 子 交 换 层 析 后， 逐 渐 降 低 变

401、 性剂浓度后， 最后采用无变性剂的高浓度盐缓冲液能 洗脱出目 标蛋白 质， 洗脱峰澄清，蛋白回收率为6 9%，显著高于稀释复性， 然而复性产物无荧光出现， 紫外扫描发现4 7 5 nn 处的吸收值显著低于2 8 0 n m ,凝胶过滤分析未见天然结构峰，这表明离子交换层析复性能有效地抑制聚集沉淀但不能促使G F P 正确折叠。 脉梯 度的S u p e r d e x 7 5 凝 胶过滤复 性的 蛋白 回 收率 也 较高， 但复 性产 物在 紫外 灯下未见荧光出 现， 吸收光谱扫描显示O D 4 7 S n m : O D 2 8 0 n m 仅为0 . 0 7 ,凝胶过滤分析天然6固定化T

402、r it o n X - 1 0 0柱上复性绿色荧光蛋白( a )( b ) 一02 仪侨加 - - 卜 -4 7 分即一为a s 草2 B Q m4 7 5 n n，E出u.q0男V,，4已.7.旧1 0 1 1 1 2， 31 e( d ) 式 一 2 日 r，一 号 闷了 竺 的扣一戒 一卫 氏片 旧 ，神 叫. 47 51 ， ，E)山。门qosqV，名口7.，1 0 1 1 1 2 1 0 1 4，生34匕启7.口1 0 1 1 1 2 7 1 1 4R e t e n ti o n v ol u m e ( n d )只 川 臼 1 0 o n v o lu me ( m) 图6

403、. 5 G F P 包涵体蛋白 质稀释复 性的凝胶过滤分析色谱图F ig .6 . 5 . S E C a n a l y s i s o f r e f o l d e d G F P f r o m i n c l u s i o n b o d i e s b y d i l u t i o n . a , 2 0 p g / m l i n t h e a b s e n c e o fa d d i t i v e s ; b , 2 0 0 E tg / m l i n t h e a b s e n c e o f a d d i t i v e s ; c , 2 0 0 p

404、g / m l i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 5 M a r g i n i n e ; d ,2 0 0 p g / m l i n t h e p r e s e n c e o f 2 M ur e a . * , n a t i v e G F P .结构产物含量仅为1 .8 ，说明脉梯度凝胶过滤复性G F P 也不利于天然结构形成。 与以上二者相比，N i 一 金属鳌合层析复性样品可见微弱荧光，O D 4 7 5 n m : O D 2 8 0 ，为0 . 1 4 , 凝胶过滤分析显示其天然结构峰含量为2 . 8 ，然而其蛋白回收率只有2 7 %

405、. 将G F P 包涵体 变性蛋白 质 在高 盐 条件下吸附 到B u t y l S e p h a r o s e F F疏 水柱上 后，用复性缓冲液洗脱得到 1 0 .3%的蛋白回收率，然而其天然结构含量为 2 3%，O D 4 7 5 n m :O D 2 8 0 n m 达到了0 .2 6 ，显著高于前面几种层析方法， 暗示G F P与介质间的疏水作用可能有助于活性结构形成，然而不利于洗脱。文献报道 G F P荧光发射团在一定 的 疏 水 环 境 形 成 更 有 利， 我 们的 结 果 与 这 一 观点 相 符 (3 0 3 。 而疏 水 性更 强 的P h e n y l柱导致更低

406、的蛋白回收率。为了提高蛋白 回收率，在此引入脉梯度复性， B u ty l 和P h e n y l 柱蛋白 回 收率提高到了6 8 ， 然而发 现洗脱峰活性结 构含量却显 著降 低， 表明脉梯度引入尽管有助于提高蛋白回收率，却不利用G F P的正确折叠。鉴于前面疏水作 用层析及其相关技术辅 助蛋白 质折叠复性的探索 表T a b l e 6 . 2 : C o rn不同 层析方法复性G F P 包涵体蛋白 质的结果比 较s o n o f r e f o l d e d G F P w i t h v a r io u s c h r o m a t o g r a p h i c m e

407、t h o d s( f - ) 0 13 2 x 0 -(%)018月234稀释复性对照 I E C S E C I MAC HI C HI C HI C HI C HI C QF FS u p e r d e x 7 5N 1 - C h e l a t i n gW-盐梯度 R梯度服梯度，配体0 . 0 7的69印B u t y l F FB u t y i F F盐梯度脉梯度P h e n y l F F盐梯度1 9 石P h e n y l F F服梯度0 . 6 6P h e n y l F F甘油辅助盐梯度1 0 . 40 . 1 5N o t e : T h e c o n t

408、 r o l e x p e r i m e n t w a s t o 1 0 0 - f o l d d i l u t e u n f o l d e d G F P f ro m i n c l u s i o n b o d i e s o f 2 0 m g / m li n t o re f o l d i n g b u ff e r . C o n t e n t o f n a t i v e s t r u c t u r e w a s t h e r e l a t i v e a r e a o f n a t i v e G F P p e a k a t 2 8

409、 0 n m u p o nS E C a n a l y s i s .章 节的 研究结 果， 在此引入甘油 进行介导， 结果发 现P h e n y l 正 确折叠 提高到了3 0 % .因此采用弱疏水作用层析盐梯度洗脱或强疏水作用层析在甘油介导下洗脱复性有助于G F P 正确折叠， 然而蛋白回收率较低。6 . 3 .4固定化T r i t o n X - 1 0 0 柱正确折叠G F P 包涵体变性蛋白 质 如图6 .6 所示， 当G F P 包涵体变性蛋白质进样至高盐缓冲液平衡的固定化T r it o nX - 1 0 0 柱 上 后 随 变性 剂的 去除 而 被 吸附， 采 用 含

410、卜 C D的 复 性缓 冲 液 洗 脱 得 到 一 个 高峰， 蛋白 浓 度达到3 8 0 l tg / n t l ， 其蛋白 得率为6 4 。 洗脱峰在 室 温放置 过程中， 荧光逐渐恢复， 4 7 5 n m与2 8 0 n m吸收度比 值达到0 .4 4 , 凝胶过滤分析发现复性峰中 天然结构含量达到4 6 %( 图6 . 7 ) ， 而且其聚集体保留 体积明显大于稀释复性产物( 图6 .5 ) ,说明固定化T r i t o n X - 1 0 0 柱可能 有助于降 低蛋白 质之间的 聚集程度。图6 . 8 为 稀释法和 p - C D 洗脱固 定化T r it o n X - 1

411、0 0 柱复 性G F P 包 涵体 蛋白 质的 荧 光光 谱比 较。 前 者 复性G F P 的荧光密度仅为天然G F P 的8 . 6 %，而后者为5 4 .6 % ，由于荧光密度直接反6固定化T r it o n X - 1 0 0柱上复性绿色荧光蛋白应了 天 然结构 含量， 因 此p - C D洗脱的固定 化T r i t o n X - 1 0 0 复 性效率 远高于 稀 释法。 任之场者一。nP亡00书加佰10朋0Jlljesesjwejl，!qlJJ日*|”门川川.尸卜|川一一一 又|月川.一、 /1|馨山111甘W川: :让认认 春“。0讯琳书1气1曰1份己1叶4 .刁办心刁，

412、 一， - 丫叫 -，-， 一 -一丫时 一- r es es1 0 2 0 3 0 4 0 6 oE l u t i o n v o l u m e ( m l ) 图6 . 6 G F P 包涵体蛋白质在固定化T r it o n X - 1 0 0 柱上洗脱复性色谱图F i g . 6 . 6 . C h r o m a t o g r a m s o f r e f o l d i n g o f G F P i n c l u s i o n b o d i e s b y i m m o b i l i z e d T r i t o n X - 1 0 0 c o l u m n

413、 . * ，G F P p e a k s 厂 写: 髯 .G:贬、4 1 2 3 4 6 6 1 6 ， 1 0 ， ，1 2 1 3 1 4 1 6R e t e n t i o n v o l u me ( ml ) 图6 .7 固定化T ri t o n X - 1 0 0 柱复 性G F P 包涵体蛋白质的凝胶过滤分析F ig .6 . 7 . S E C a n a l y s i s o f r e f o l d e d G F P i n c l u s io n b o d i e s 妙i m m o b i l i z e d T r it o n X - 1 0 0

414、c o l u m n# ， n a t iv eGF P .6 .3 . 5固定化T r i t o n X - 1 0 0 层析柱复 性G F P 包涵体蛋白 质的机理探讨 为了 推 测p - C D 洗脱的 固 定 化T r i t o n X - 1 0 0 层 析柱复 性G F P 的 机理， 在 此分别 采用 不同 疏水 作 用层析以 p - C D作为 流 动相 洗脱以 及采用固 定化T r i t o n X - 1 0 0 柱 按经典疏水层析模式方法洗脱，结果如表6 .3 所示。 采用经典的B u t y l , P h e n y l 以 及未祸联的A l l y l 疏水

415、作用层析柱吸附G F P 包涵体变 性蛋白 质后， p - C D不能 将其 洗脱， 表明 p - C D不 是经典 疏水作 用层析的 有 效 洗脱 剂。疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折益复性的探索 、白卜 了/J百JIJ1黝知刘/ b 卿吕a勺吕二。搜吕匕 士 溉 。 挫卜 _只i 7 口芝 洲15 9湘以q 图6 . 8不同方法复性G F P 包涵体蛋白质的荧光光谱F i g .6 . & C o m p a r i s o n o f fl u o re s c e n c e s p e c t r a o f r e f o l d e d G F P w it h v a r

416、i o u s m e t h o d s . a , n a t i v e G F P ; b ,r e f o l d e d G F P a ft e r a d s o r p ti o n t o i m m o b i l i z e d T r i t o n X - 1 0 0 a n d w i t h p - c y c l o d e x t r i n a s e l u e n t ; c ; t h es u p e r n a t a n t o f r e f o l d e d G F P b y d i l u t i o n a t 2 0 0 ji g

417、 / m l 表6 . 3 不同类型的疏水柱与洗脱方式对G F P 复性效果的影响T a b l e 6 .3 E ff e c t s o f v a r i o u s H I C m e d i a a n d d i ff e re n t e l u t i o n w a y s o n r e f o l d i n g e f f i c i e n c y o f G F P疏水作用介质类蛋白 收率正确结构含量洗脱条件型 %)( % )B u t y l 4 F FP h e n y l 6 F FT r i t o n X- 1 0 0T r i t o n X- 1 0

418、0p C Dp C DP C O5 ， GU二 Gr .T r i t o n X- 1 0 0p C D 6 4 4 6N o t e : S . G r , g r a d i e n t o f d e c r e a s i n g s a l t c o n c e n t r a t i o n ; U . G r . ， u re a g r a d i e n t 作为 对照的 未祸联 层析柱 在高盐 条 拌下也能 吸附 变 性蛋白 质， 暗示 其功能 基一 烯基 可 能 也 是一 种疏 水 性 配体， 然 而 - C D 不 能 洗脱 结 合 蛋白 质， 表明T r it o

419、 n X - 1 0 0 祸联到柱上后介质特性发生明显改变。 当固定化T r i t o n X - 1 0 0 吸附G F P 包涵体变性蛋白 质后， 降低盐浓度不能导 致其洗6固定化T r it o n X - 1 0 0柱上复性绿色荧光蛋白脱。 当 采 用脉梯度方式 洗脱时， 能 洗脱出3 1 % 的 蛋白 ， 显著 低于B u t y l 和P h e n y l 疏水柱( 表 6 .2 ) ，表明此层析柱的疏水性显 著强于后二者，而且洗脱峰天然结 构含量很低。 与 上 述情况不同， 固 定 化T ri t o n X - 1 0 0 采用卜 C D作为 洗脱剂， 既能 有 效洗脱目标

420、蛋白 质， 又能 促使G F P 正 确 折叠， 这 说明 (3 - C D洗 脱的固 定化T r i t o n X - 1 0 0 层析 柱可能以一种独特的方式复性G F P 包涵体蛋白 质。 文献报道采用表面活性剂与环糊精组合成的人工分子伴侣能模拟分子伴侣辅助蛋白质复性的两个步骤促使蛋白质I确折叠: 一是表面活性剂捕捉目 标蛋白质形成复合物， 第二步 是(3 - C D添 加从 复合 物剥离 表面 活性剂， 同 时 释放结 合的蛋白 质 1 1 4 0 1固定化的T r i t o n X - 1 0 0 柱其配体- T r it o n X - 1 0 0 为一典型的非离子型表面活性剂

421、， 而洗脱剂， p - C D是 经典人工分 子伴 侣常用的 表面 活性剂剥 离剂。 在此我 们将T ri t o n X - 1 0 0 和R - C D作为经典 人工分子伴侣尝试复性G F P 包涵体蛋白 质。 如图 6 . 4所示，将变性的 G F P包涵体蛋白 质分别稀释至含 0 .0 1% 和 0 . 1% 的T ri t o n X - 1 0 0 中， 无天然G F P 结构检出， 表明G F P 与T ri t o n X - 1 0 0 形成复合物。 在0 .0 10% u T r i t o n X - 1 0 。 情况 下 ( 低于C M C ) 低 浓 度 j3 - C

422、 D 添加 导 致 约7 % 的 天 然结 构 含 量， 随着R - C D浓度 提高( 4 m M ) 天 然结构 含量逐 渐降 低; 而 在。 . 1 % T r i t o n X - 1 0 0 情 况下( C M C ) ， 低浓 度p - C D不能 释放 结合的 蛋白 质， 8 m mp - C D添加时 也 仅得到6 . 3 % 的天然结构含量， p - C D浓度进一步提高天然结构含量反 而降低。 上述数据说明 经典的人工分子伴侣方法并不能促使G F P成功复性，而且即使利用胶束形成的方法也无法避免G F P 包涵体变性蛋白 质复性过程中的大量可溶性聚集体生成。 当 将固定化

423、的T r i o t o n X - 1 0 0 介质代替上面液态T ri t o n X - 1 0 0 时，G F P 包涵体蛋白 质 也被捕捉， 2 .4 m Mp - C D天 然结构 含量为2 2 % ， 显 著高于上述 经典 人工分 子 伴侣 系统。 有意思的 是R - C D浓 度进一步提高， 天然结 构含量反 而降 低。 、 而当 将捕 捉日标蛋白 质后的固定化的 T r i o t o n X - 1 0 0介质装入色谱柱中，再分别采用不同 浓度的卜 C D 洗脱 发现， 随 着p - C D 浓度的 提高 天然结 构 含量显著提高， 2 4 m M的 卜 C D 洗脱得到的

424、复性( F P 夭然结构含量达到了4 9 %。 这说明柱上洗脱方式复性效率显著由于溶液分批方式。 以 上结 果说明 p - C D洗脱的固 定 化T r i t o n X - 1 0 0 可能 采用了 经典 人工分 子 伴 侣的捕捉一 释放机理，T ri t o n X - 1 0 0 的固定化可能促使释放的蛋白 质进入层析介质内 部进疏水作用层析及其相关技术 辅助蛋白 质折益复性的探索行折叠促进了正确结构的形成， 然而当目 标蛋白 质在溶液分批系统中释放时， 高浓度的 P - C D由于迅速释放吸附的蛋白 质而加 剧了 它们的 聚集倾向， 所以反而降低正确折叠 率。 T r i t o n

425、 X - 1 0 0 是一 种带P E G长 链亲 水末端 和辛基 苯疏水末端的 表面 活性剂， 当其亲水端化学键合到层析介质上成为一种带亲水长链的具有柔韧性的新型疏水作用介质， 当目 标蛋白 质在T r i t o n X - 1 0 0 柱上吸附 后， 卜 C D洗脱时G F P 可能与 介 质发生一种重新结合一 释放的过程， 未折叠完全的 具有暴露疏水基团的中间体可以 重新被介质吸附从而抑制了聚集，这样在洗脱过程中G F P不断的发生结构变化直至天然结构形成。 而经典的疏水作用层析柱尽管能在高盐下吸附变性蛋白 质， 然而其配基由于缺乏 长 亲 水 手 臂 而缺 乏 柔韧 性， 多 位点

426、的 吸附 可 能 会 阻 止 (3 - C D靠 近结 合， 因 而 难以 释放结合蛋白质。 、与 、 、“的妈们拈加筋加招切 岁百日公创.书丝00a 0弓j 4 肠 e y e 呀 。 d . 幼 r 亩 n 呀 石c o n c n e 谧 r a t 泣 o n儡 图b .9经典人工分子伴侣和固定化人工分子伴侣对G F P 分批稀释夏性结果F i & 6 .9 . R e s u lt s o f r e f o l d i n g o f G F P d u ri n g f e d - b a t c h d i l u t i o n b y c l a s s i c a l a

427、 n d i m m o b i l iz e d a r t i f i c i a lc h a p e r o n e , a , d i l u t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 2 g i m m o b i l i z e d T r it o n X - 1 0 0 g e l f o l l o w e d b y e l u t i o n w i t hp - C D i n a p a c k e d c o l u m n ; b : d i l u t i o n i n t h e p r e s e n c e o

428、 f 0 . 1 g i m m o b i l i z e d T r it o n X - 1 0 0 g e l f o l l o w e db y (3 - C D a d d i t i o n ; 。 ， d i l u t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 0 1 %T r i t o n X - 1 0 0 f o l l o w e d b y (3 - C D a d d i t i o n ; dd i l u t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 1 %T r i t o n

429、X - 1 0 0 f o l l o w e d b y P - C D a d d i t i o n . C o r r e c t s t r u c t u r e w a sr e p re s e n t e d b y r e l a t i v e a r e a o f n a t i v e G F P p e a k a t 2 8 0 n m u p o n S E C a n a l y s i s .6 .4本章小结 ( 1 ) G F P 包涵体变性蛋白 质采用 稀释 法难以 复 性， 复 性效率显 著低于 变性的 可溶 性G F P ， 蛋白 浓度的提高不仅会

430、导致聚集沉淀而且会抑制正确折叠， 无添加剂存在下2 0 0h 留 n t l 蛋白 终浓度时前者复性产物上 清中正确结构含量仅为4 .7%， 提示荧光 发射团6固定化T r it o n X - 1 0 0柱上复性绿色荧光蛋白难以通过自发折叠而形成。 ( 2 ) 将G F P 包涵体变性蛋白 质在高盐下吸附 到T r i t o n X - 1 0 0层析柱上 后用p - C D 洗脱， 能成功复性G F P 包涵体蛋白 质， 蛋白回收率为6 4 ， 复性蛋白 浓度为3 8 0 1 t g / m l ,天然结构含量为4 6 %。 ( 3 ) 离子交换层析、 凝胶过滤、 金属鳌合层析、 经典疏

431、水作用层析及其洗脱方法溶液体系下的人工分子伴侣系统均无法促使 G F P包涵体蛋白 质有效折叠，提示采用p - C D洗脱固定化T r i t o n X - 1 0 0 层析柱复性G F P 包涵体蛋白 质的机理可能为人工分子伴侣和疏水作用层析的祸合。7结论与展望7结论和展望7 . 1本文主要结果 本文利用商业化疏水作用介质、固定化P E G介质、固定化聚合环糊精介质以及固定化 T r i t o n X - 1 0 0介质建立了一系列基于疏水相互作用的固定化人工分子伴侣系统， 分别对溶菌酶、重组。2 b干扰素、重组金黄色葡萄球菌肤链延长因子 ( E F - G ) 以及 重组绿 色荧光蛋白

432、 ( G F P ) 进行了 复 性，旨 在促使目 标蛋白 质在一 个由 层析 介质 组 成的相对封闭环境通过疏水作用进行吸附一释放， 使其在这一过程进行结构变化， 从而促进正确结构的形成，并且避免聚集产生。 上述主要实验结果概括如下: ( 1 ) 采用几种商业化疏水作用层析柱尝试直接复性溶菌酶，发现蛋白回收率显著高于稀释复性， 但比活收率低于稀释复性的可溶性产物， 且随着疏水强度的增加而下降， 表明商业化疏水作用层析能抑制蛋白质折叠过程中的聚集沉淀， 但促使其错误折叠。 将变性溶菌酶在高盐下吸附到P o r o s P E 疏水作用层析柱上， 采用脉梯度解吸5 0 %甘油介导洗脱， 活性回收

433、率达到8 6 . 3 % ， 蛋白 收率为8 5 % ，比 活回收率为1 0 1 % ，复 性蛋白 浓度能 达到1 .2 m g / m l ， 无 甘油 存 在下， 活 性收率 仅为5 0 .4 % ，比 活回 收 率为5 9%，说明采用甘油介导的疏水作用层析复性蛋白质时既能抑制聚集又能正确促进折叠。 甘油介导脉梯度洗脱模式的疏水作用层析复性蛋白 质的过程可能模拟了 分子伴侣的捕捉一释放作用机理， 它可能改变了溶菌酶的折叠途径， 形成一种在正确折叠途径上的中间体，其折叠速度较慢，但能最终恢复天然结构。 ( 2 ) 采用商业 化疏水作用介质溶 液分 批辅助复性重组 a - 2 b I F N

434、， 可以 抑制 沉淀 生成， 然而随着介质疏水性提高可溶性蛋白回收率显著下降， 而采用疏水作用层析直接穿过复性时进一步降低蛋白 回收率， 表明重组c c - 2 b I F N在疏水环境下复性时， 正确折叠过程可能受到抑制，从而导 致不可 逆吸附。 将重组a - 2 b I F N在高盐下吸附到P o r o sE T疏水作用层析柱上，采用盐酸肌解吸2 0 %甘油介导洗脱，蛋白回收率达到8 4 %,复 性 产 物比 活 为3 .0 x 1 护 I U l m g ， 复 性 蛋白 浓 度 达 到了1 . 1 m g / m l , 复 性 效 率 显 著 高 于直接稀释和无甘油介导下疏水作用层

435、析的复性方法， 结果表明采用弱疏水作用介质和适宜浓度的甘油洗脱相结合既可以抑制聚集又可以促进正确折叠。丝 交 血 通iA= 析 孕 其 担 荞 R 术 辅 助 蛋 白 质 折 叠 复 性 的 探 索 ( 3 ) 将变性E F - G在高盐下吸附到固定化P E G疏水柱上后， 采用8 M W 脉冲洗脱复性，蛋白回收率高达 8 8%， 正确折叠结构含量达到 8 0%，复性蛋白 浓度为 5 8 0 L g l m l ， 复性效率显著高于稀释法。 E F - G在高盐下的结合不能被竞争性疏水作用所克服， 低温方式可用于解吸结合蛋白 质， 但不能促进释放蛋白 质正确折叠， 表明 脉脉冲解吸是释放疏水结

436、合变性蛋白质的有效方法。 采用强疏水作用介质和穿过方式均不能促使E F - G正确折叠， 表明固定化P E G可以 提供一个有利于蛋白 质折叠的 环境， 而一种类似分子伴侣复性蛋白质机理的吸附一释放过程是疏水作用层析成功复性E F - G的必要条件。 ( 4 ) 1 0 % 的T r i t o n X - 1 0 0 和H L B 与 之相 近的 表面活 性 剂与 高 浓度变性E F - G 混合 后随变性剂稀释能形成结构独特澄清的蛋白质与表面活性剂复合物，表面活性剂高于C MC浓度以 及它与变性蛋白 质的预先混合可以 抑制捕捉过程中的聚集沉淀a E F - G与表面 活性剂复 合物在固 定

437、化 聚合p - C D 柱上 进行洗 脱复 性， 蛋白 回收率为9 8 .7 % , 复性蛋白 浓 度为5 3 0 p g l m l ， 复 性E F - G 与天 然结 构一致。 (3 - C D聚合 后增加了 对表 面活性剂的 亲和力， 而聚合p - C D的固定 化 进一步 加强了 这种能力。 与 溶液分 批方式 相比 ，固定 化聚 合 价 C D的 人工分子伴侣系 统能 显著 抑制结 合蛋白 质释放过程中的 聚 集。 未祸联柱、 固定 化P - C D单体 柱以 及采 用直接穿 过法复 性E F - G时， 复 性收 率显 著 低于表 面活 性剂 胶束 与固 定 化聚合 p - C

438、D的 祸合系 统， 提示 后者 作用机理可能 为使 变性蛋白 质在封闭环境中进行捕捉一释放而实现正确折叠同时避免聚集。 ( 5 ) G F P包涵体变性蛋白 质采用稀释法难以 复性， 复性效率显著低于变性的可溶性G F P ， 蛋白 浓度的提高不仅会导致聚集沉淀而且会抑制正确折叠， 无添加剂存在下2 0 0 f i g /m l 蛋白 终浓度时前者复 性 产物 上清中正 确结 构 含量仅为4 . 7 % ， 提示荧 光发 射团难以 通过自 发折叠而形成。 将G F P 包涵体 变性蛋白 质在高盐 下吸附到T r i t o n X - 1 0 0层析柱 上后用p - C D洗脱， 能成功复 性

439、G F P 包涵体蛋白 质， 蛋白 回收率为6 4 %， 复性蛋白 浓度为3 8 0 ji g / m l ， 天 然结 构含量为4 6 % . 离 子交 换层析、 凝 胶过滤、 金 属赘合层析、 经典疏水作用层析及其洗脱方法溶液体系下的人工分子伴侣系统均无法促使G F P 包 涵体蛋白 质有效折叠， 提示 采用 p - C D 洗脱固 定 化T r i t o n X - 1 0 。 层析柱 复 性G F P包涵体蛋白质的机理可能为人工分子伴侣和疏水作用层析的祸合。7结论与展望7 .2本文的创新点 蛋白质折叠过程中分子间疏水作用导致的聚集反应是导致活性收率降低的主要原因， 疏水作用介质配基能

440、通过疏水作用而结合蛋白质， 从而抑制蛋白质分子间聚集，因而疏水作用层析是潜在的复性手段。 尽管有人采用自己 合成的特殊疏水作用介质尝试复性了某些蛋白质，然而还未见采用商业化疏水作用介质用于蛋白质复性的报道。细胞内蛋白 质折叠的高效性在于分子伴侣能通过疏水作用结合具有暴露疏水表面的新生肤和折叠中间体从而抑制其聚集， 随后通过结构变化将结合蛋白质释放至亲水环境， 从而促使其折叠。 人工分子伴侣复性体系模拟了分子伴侣的作用机理， 利用表面活性剂和变性蛋白质疏水结合形成复合物， 然后通过环糊精剥离表面活性剂而释放蛋白质促使其折叠。 然而经典的人工分子伴侣系统在开放体系中应用， 难以避免蛋白质分子间聚集

441、， 而且未见报道其用于包涵体蛋白质的复性， 暗示其应用的局限性。 本文综合了人工分子伴侣和疏水作用层析的特点， 发展了基于疏水相互作用的固定化人工分子伴侣系统，创新点如下: ( 1 ) 发现商业化疏水作用层析对蛋白 质正 确折叠有抑制作用， 首次提出 在疏水作用层析复性蛋白 质的过程中引入甘油， 通过逐渐提高介质环境的亲水性和加强蛋白 质的水化作用而促进正确折叠， 建立了甘油介导下的商业化疏水作用层析复性系统， 由于商业化疏水作用介质性能稳定容易得到，因此此方法展示了广阔的应用前景; ( 2 ) 首次建立了表面活性剂胶束和固定 化聚合p 一 环糊精 层析柱相结 合的固 定化人工分子伴侣复性系统

442、，并成功用于复杂蛋白质一 E F - G的复性。 ( 3 ) 首 次 将T r it o n X - 1 0 0 固 定 化 建 立了 采 用 R 一 环 糊 精 作 为 洗 脱 剂 的 新 型 疏 水 作 用 层析和人工分子伴侣祸联的固定化人工分子伴侣复性系统，并成功用于G F P包涵体蛋白质的复性。7 3今后的研究方向 本论文综合分析了疏水作用层析和人工分子伴侣的特点， 提出蛋白 质在封闭环境下通过疏水作用性质的捕捉一释放过程而恢复天然结构并得到高浓度复性产物的假设， 在此基础上建立了一系列具有人工分子伴侣特点、 基于疏水作用的固定化人工分子伴侣系统， 用于几种蛋白质的复性获得了成功。 然

443、而论文一方面未对上述系统复性蛋白 质的作用机理和过程进行系统和深入的探讨，一些结论只是通过间接证据获得;疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索另一方面由于蛋白质的折叠过程是复杂而多变的， 还需要对上述系统应用的广泛性进行进一步考察。因此建议今后从以下几个方面开展研究: ( 1 ) 考察蛋白质在固定化人工分子伴侣系统中吸附一 解吸过程中的结构变化， 并与蛋白 质的自由折叠过程进行比较， 分析前者是否更有利于蛋白 质正确疏水核心的形成。论文实验结果显示采用吸附一解吸方法在甘油介导下疏水作用层析柱、固定化P E G 柱、 固 定 化聚合p - C D柱中 复 性蛋白 质的 效率明 显高于

444、 直接将变性蛋白 质在上述柱中穿过复性。 本论文并未对这一现象的原因作分子水平上的探讨， 建议采用核磁共振、 荧光光谱和圆二色等光谱手段分析吸附到介质上变性蛋白 质的结构状态和解吸时状态，通过设计控制实验考察洗脱过程的结构变化动力学。 ( 2 ) 分析蛋白 质采用p - C D在固定化T r it o n X - 1 0 。 层析柱洗脱过程中的结构变化。上述方法对G F P 包涵体蛋白质具有独特的复性效果， 提示层析过程中G F P 折叠中间体可能通过吸附一解吸过程而避开了错误折叠途径。 可通过改变柱长和介质辅助溶液分批复性等方法考察结构变化动力学。 ( 3 ) 采用上述系统对一系列结构特征不

445、同的 模型蛋白 质以 及包涵体蛋白 质进行复性， 并对复性条件进行优化， 总结出普遍规律， 找到关键参数。 上述系统都是基于疏水作 用机理复 性蛋白 质的， 其中 配体 ( 包括介质配体和作为 变性蛋白 质捕捉剂的 表面活性 剂 ) 的 疏水性和链长可能 对正 确折叠具 有重要影响， 此外 增加肤 链柔性的 变 性剂、氧化还原对的添加以及离子强度等因素可能对于某些蛋白 质复性具有重要作用， 对这些因素进行综合分析，将为其实际应用奠定基础。 ( 4 ) 根据机理研究结果和参数考察， 对上述系统进一步改造，以 获得效果更好应用更 广 泛的 新型 系统。 例如对于 表 面活性剂 胶束 和固 定 化聚

446、合p - C D的 组合系 统 而 言，前者可以 改变表面活性剂种类或者采用纳米凝胶捕捉蛋白 质，后者可以 对聚合卜 C D进行修饰增加蛋白 质释放能力或者引入活性琉基而促进二硫键形成;而对于固定化T r i t o n X - 1 0 0 和p - C D洗 脱剂组 成的 系 统而言， 前者可以 设 法合成 一系列 性质不同 的 表面活 性剂， 后者可以 采用p - C D的 衍生 物或聚 合物。 ( 5 ) 将上述系统进行放大，以 考察其大规模应用的可能性。参考文献1 3 9参考文献 I 1 D o b s o n C M . T h e n a t u r e a n d s i g n

447、 i fi c a n c e o # p ro t e i n f o l d i n g . I n : M e c h a n i s m o f p r o t e i n f o l d i n g ( 2 n d E d ) E d i t e d b y P a i n R H , O x f o r d U n i v e r s it y P r e s s , O x f o r d . 2 0 0 0 , P I 2 1 D i l l K . A . D o m i n a n t f o r c e s i n p r o t e i n f o l d i n g

448、. B i o c h e m i s t r y . , 1 9 9 0 , 2 9 :7 1 3 3 - 7 1 5 5 3 1 A n fi n s e n C B . P r i n c i p l e s t h a t g o v e rn t h e f o l d i n g o f p r o t e i n c h a i n s . S c i e n c e , 1 9 7 3 , 1 8 1 : 2 2 3 - 2 3 0 4 1邹承鲁， 第二套 遗传 密码一 新生 肚链及 蛋白 质 折叠的 研究 湖南科学技 术出 版社 ， 长沙， 1 9 9 7 5 1 R a d

449、 f o r d S E . P r o t e i n f o l d i n g : p ro g r e s s m a d e a n d p ro m is e s a h e a d . T r e n d s B i o c h e m . S c i , 2 0 0 0 , 2 5 :6 1 1 石i 8 6 1 M i s a w a S , K u m a g a i 1 . R e f o ld i n g o f t h e r a p e u t i c p ro t e i n s p r o d u c e d i n E s c h e r i c h i a

450、c o l i a s i n c l u s i o n . B i o p o l y m e r s , 1 9 9 9 , 5 1 : 2 9 7 - 3 0 7 7 1 S h i P Y , M a i z e l s N , W e i n e r A M . R e c o v e r y o f s o l u b l e , a c t i v e r e c o m b i n a n t p r o t e i n fr o m i n c l u s i o n b o d i e s . B i o t e c h n i q u e s , 1 9 9 7 , 2

451、 3 : 1 0 3 6 - 1 0 3 8 8 P a d l a n E A , L o v e W E R e f i n e d c r y s t a l s t r u c t u r e o f d e o x y h e m o g l o b i n S . 1 1 M o l e c u l a r i n t e r a c t io n s i n t h e c r y s t a l . J . B i o l . C h e m . , 1 9 8 5 ,2 6 0 : 8 2 8 0 - 8 2 9 1 9 O n B H， T h o m a s P J .

452、A l t e r a t i o n o f c y s t i c f i b r o s i s t r a n s m e m b r a n e c o n d u c t a n c e r e g u l a r f o l d i n g p a t h w a y . J . B i o l . C h e m ., 1 9 9 6 , 2 7 1 :7 2 6 1 - 7 2 6 4 1 0 1 H u a n g Z , P r u s i n e r S B , C o c h e n F E . S c r a p i e p r i o n s : a t h r

453、e e - d i m e n t i a l m o d e l o f a n i n f e c t o u s f r a g m e n t . F o l d . D e s ., 1 9 9 6 , 1 : 1 3 - 1 9 1 1 1 D i F i g l i a M , S a p p E , C h a s e K 0 , D a v i e s S W , B a t e s G P , V o n s a t te l J P , A r o n i n N . A g g r e g a t i o n o f h u n t i n g t i n i n n

454、e u r o n a l i n t r a n u c le a r i n c l u s i o n s a n d d y s t r o p h i c n e u r i t e s i n b r a i n . S c i e n c e , 1 9 9 7 , 2 7 7 : 1 9 9 0 - 1 9 9 3 1 2 1 P o l y m e r o p o u l o s M H , L a v e d a n C , L e r o y E , I d e S E , D e h e j i a A , D u t r a A , P i k e B , R o o

455、 t H R u b e n s t e i n J , B o y e r 民S t e n r o o s E S , C h a n d r a s e k h a r a p p a S ， A t h a n a s s i a d o u A， P a p a p e t r o p o u l o s T , J o h n s o n W G , L a z z a r i n i A从 D u v o i s i n R C , D i b r i o G ， G o l b e L 1 , N u s s b a u m R L . Mu t a t i o n i n t

456、 h e a l p h a - s y n u c l e i n g e n e i d e n t i f i e d i n f a m i l i e s w i t h P a r k i n s o n s d i s e a s e . S c i e n c e , 1 9 9 7 ,2 7 6 : 2 0 4 5 - 2 0 4 7 1 3 1 B e n e d e k G B . C a t a r a c t a p r o t e i n c o n d e n s a t i o n d i s e a s e : t h e p r o t o r l e c

457、t u r e . I n v e s t . O p h t h a l m o l V i s . S c i ， 1 9 9 7 , 3 8 : 1 9 1 1 - 1 9 2 1 1 4 L e v i n t h a l C . A r e 伽r e p a t h w a y s 橱 p r o t e i n f o l d i n g ? J . C h i m . P h y s . 1 9 6 8 , 6 5 : 4 4 - 4 5 1 5 1 B a l d w i n R L . H o w d o e s p r o t e i n f o l d i n g g e

458、 t s t a r t e d ? T r e n d s B i o c h e m . S c i ., 1 9 8 9 , 1 4 :2 9 1 - 2 9 4 1 6 1 P l a x c o K W, S i m o n s K爪B a k e r D . C o n t a c t o r d e r , t r a n s i t i o n s t a t e p l a c e m e n t a n d t h e r e f o l d i n g r a t e s o f s i n g l e d o m a i n p r o t e i n s . J .

459、M o L B io l . 1 9 9 8 , 2 7 7 :9 8 5 - 9 9 4 1 7 B a k e r D . A s u r p r i s i n g s i m p l ic it y t o p r o t e i n f o l d i n g . N a t u r e , 2 0 0 0 , 4 0 5 : 3 9 - 4 2 1 8 1 K u w a j i m a K . T h e m o lt e n g l o b u l e s t a t e as a c lu e f o r u n d e r s t a n d i n g t h e f o

460、 l d i n g a n d c o o p e r a t i v i t y o f g l o b u l a r - p r o t e i n s t r u c t u r e . P r o t e i n s , 1 9 8 9 ,6 : 8 7 - 1 0 3t 1 9 1 P t it s y n 0 B . M o l t e n g l o b u le a n d p r o t e i n f o l d i n g .A d v .P r o t . C h e m . , 1 9 9 5 , 4 7 : 8 3 - 2 2 9 2 0 1 B r e m s

461、 D N , P l a i s t e d S M , H a v e l H A , T o m i c h C S . S t a b i l i z a t io n o f a n as s o c i a t e d f o ld i n g i n t e r m e d i a t e o f b o v i n e g r o w t h h o r m o n e 勿s it e - d i re c t e d m u t a g e n e s i s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A . , 1 9 8 凡 8 5 : 3 3

462、 6 7 - 3 3 7 1 2 1 1 R a m a c h a n d r a n G N , M i t r a A K . A n e x p l a n a t i o n f o r t h e r a re o c c u r re n c e o f c i s p e p t i d e u n i t s i n1 4 0疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索 p r o t e i n s a n d p o l y p e p t i d e s . J . M o l . B i o l ., 1 9 7 6 , 1 0 7 : 8 5 - 9 2 2

463、2 C h e n g H N . , B o v e y F A . C i s - T r a n s e q u i l i b r i u m a n d k i n e t i c s t u d i e s o f a c e ty l - L - p ro l i n e a n d g l y c y l - L - P r o l i n e . B i o p o l y m e r s , 1 9 7 7 , 1 6 : 1 4 6 5 - 1 4 7 2 2 3 J o c h e n B , F r a n z X S . P r o l i n e i s o m

464、e r i z a t i o n a n d i t s c a t a l y s i s in p r o t e i n f o l d i n g . I n :Me c h a n i s m o f p r o t e i n f o ld i n g ( 2 n d E d ) . E d i t e d b y P a i n R .H . O x f o r d U n iv e r s i ty P r e s s . O x f o r d . ,2 0 0 0 , p p 2 1 2 - 2 3 7 2 4 B r a n d t s J F , H a l v o

465、r s o n H R , B r e n n a n M. C o n s i d e r a t i o n o f t h e p o s s i b i l i ty t h a t t h e l o w s t e p i n p r o t e i n d e n a t u r a t i o n r e a c t i o n i s d u e t o c is - t r a n s i s o m e ri s m o f p r o l i n e re s id u e s . B i o c h e m i s t ry , 1 9 7 5 , 1 4 : 4 9

466、 5 3 - 4 9 6 3 2 5 C r e ig h t o n T . P r o t e i n f o l d i n g c o u p l e d t o d i s u lp h i d e - b o n d f o r m a t io n . I n : M e c h a n i s m o f p r o t e i n f o l d i n g . E d i t e d b y P a i n R . H . , O x f o r d U n i v e r s i ty P r e s s . O x f o r d . 2 0 0 0 , p p 2 5

467、 0 - 2 7 8 2 6 1 W e t la u f e r D B . N u c l e a t i o n , r a p id f o ld i n g , a n d g l o b u l a r i n t r a c h a i n r e g i o n s in p ro t e i n s . P r o c . N a i l . A c a d . S c i . U S A . , 1 9 7 3 , 7 0 : 6 9 7 - 7 0 1 2 7 1 K i m P S ， B a l d w i n R L . S p e c i f i c i n t

468、e r m e d i a t e s i n t h e f o l d i n g r e a c t io n s o f s m a l l p r o t e i n s a n d t h e m e c h a n i s m o f f o l d i n g . A n n u . R e v . B i o c h e m . , 1 9 8 2 , 5 1 :4 5 9 . 4 8 9 2 8 H a r r i s o n S C D u r b i n R . I s t h e r e a s i n g l e p a t h w a y f o r t h e

469、f o l d i n g o f a p o ly p e p t i d e c h a i n ? P r o c . N a t I .A c a d . S c i . U S A， 1 9 8 5 , 8 2 : 4 0 2 8 - 4 0 3 0 2 9 B a s h f o r d D , C o h e n F E , K a r p l u s M , K u n t z I D , W e a v e r D L . D i f f u s io n - c o l l i s i o n m o d e l f o r t h e f o l d i n g k i

470、n e t i c s o f m y o g l o b i n . P ro t e i n s . 9 8 8 , 4 :2 1 1 - 2 7 3 0 K i m P S , B a l d w i n R L . I n t e r m e d i a t e s i n t h e f o l d i n g re a c t i o n s o f s m a l l p ro t e i n s . A n o n . R e v . B i o c h e m. 1 9 9 0 , 5 9 :6 3 1 - 6 6 0 3 1 L a z a r i d i s 1 , K

471、a r p lu s M. N e w v i e w o f p r o t e i n f o l d i n g r e c o n c i l e d w i t h t h e o l d t h ro u g h m u l t i p l e u n f o l d i n g s i m u l a t i o n s . S c i e n c e , 1 9 9 7 , 2 7 8 : 1 9 2 8 - 1 9 3 1 3 2 1 K u l k a m i S 长A s h c ro ft A E , C a r e y M , M a s s e l o s D ,

472、R o b i n s o n C V , R a d f o r d S E . A n e a r - n a t iv e s t a t e o n t h e s t o w re f o l d i n g p a t h w a y o f h e n l y s o z y m e . P ro t e i n S c i ， 1 9 9 9 , 8 : 3 5 - 4 4 3 3 1 A g a s h e V R , H a r t l F - U , R o l e s o f m o l e c u l a r c h a p e r o n e s i n c y t

473、 o p l a s m i c p r o t e i n f o l d i n g . S e m i n . C e l l D e v . B i o l 二加0 , 1 1 : 1 5 - 2 5 3 4 V a n d e n B e r g , B ., E l l i s R .J . , D o b s o n C . M . E ff e c t s o f m a c r o m o l e c u l a r c r o w d i n g o n p ro t e i n f o l d i n g a n d a g g r e g a t i o n . E M

474、B O J . , 1 9 9 9 , 1 8 :6 9 2 7 一 9 3 3 3 5 1 E l l i s , R 工 J . I n t r o d u c t i o n 一 1 0 y e a r s o f m o l e c u l a r c h a p e r o n e s . S e m i n . C e l l D e v . B i o 1 ., 2 0 0 0 , 1 1 : 卜 5 3 6 1 L e r o u x R M， H a r t l F U . C e l l u l a r r u c t i o n o f m o le c u l a r

475、c h a p r o n e s . I n :M e c h a n i s m o f p r o t e i n f o l d i n g E d i t e d 妙P a i n R . H ., O x f o r d U n i v e r s i ty P r e s s . O x f o r d ., 2 0 0 0 , p p 3 6 6 - 4 0 4 3 7 1 C o y l e J E , J a e g e r J , G ro s s M , R o b i n s o n C V , R a d f o r d S E , S t r u c t u r

476、a l a n d m e c h a n i s t i c c o n s e q u e n c e s o f p o l y p e p t i d e b i n d i n g 妙G r o E L . F o l d . D e s . 1 9 9 7 , 2 ; R 9 3 - R I 0 4 3 8 1 C o r r a l e s F J , F e r s h t A R . T o w a r d a m e c h a n i s m f o r G ro E L . G r o E S c h a p e r o n e a c t iv it y : a n

477、A T P a s e - g a t e d a n d - p u l s e d f o l d i n g a n d a n n e a l i n g c a g e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A . 1 9 9 6 , 9 3 :4 5 0 9 . 4 5 1 21 3 9 1 B e n - Z v i A P , G o l o u b i n o f f P . R e v i e w :m e c h a n i s m s o f d i s a g g r e g a t i o n a n d r e f o l d i

478、 n g o f s t a b l e p r o t e in a g g re g a t e s b y m o l e c u l a r c h a p e r o n e s .) S t r u c t B i o l ., 2 0 0 1 , 1 3 5 : 8 4 - 9 3 01 G o ld b e r g e r R F , E p s t e i n C J , A n f i n s e n C B . A c c e l e r a t i o n o f r e a c t i o n o f r e a c t i o n r e d u c e d b o

479、 v i n e p a n c r e a t i c r i b o n u c l e a s e b y a m i c r o s o m a l s y s t e m f r o m r a t l i v e r . 7 . B i 。 皿 C h e m . , 1 9 6 3 ,2 3 8 : 6 2 8 - 6 3 5 4 1 1 V e n e t i an e r P , S t r a u b F B . T h e e n z y m a t i c r e a c t iv a t i o n o f r e d u c e d r i b o n u c l

480、e a s e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a ., 1 9 6 3 , 6 7 :6 6 - 1 6 8 4 2 1 F is h e r G , B a n g H , M e c h C . N a c h w e i s e i n e r e x z y m k a t a l y s e f u r d i e c i s - t r a n s - i s o m e r i s i e r u n g d e r p e p t i d b i n d u n g i n p r o l i n h a l t i g e n

481、 p e p t i d e n . B i o m e d . B i o c h i m . A c t a , 1 9 8 4 , 4 3 : 1 1 0 1 一 川 1参考文献1 41 4 3 E d m a n J C , E l l i s L , B l a c h e r R W , R o t h R A , R u tt e r W J . S e q u e n c e o f p r o t e i n d i s u l f i d e i s o m e r a s e a n d im p l i c a t io n o f i t s r e l a t i

482、o n s h i p t o t h i o r e d o x i n . N a t u r e , 1 9 8 5 , 3 1 7 :2 6 7 - 2 7 0t 4 4 B a r d w e l l J C , L e e J O , J a n d e r G , M a r t i n N , B e l i n 玖B e c k w i t h J . A p a t h w a y f o r d i s u l f id e b o n d f o r m a t i o n i n v i v o . P ro c N a t l A c a d S c i U S A

483、 . , 1 9 9 3 , 9 0 : 1 0 3 8 - 1 0 4 2 4 5 B a l b a c h J , S c h m i d F X . P r a l i n e i s o m e r i z a t i o n a n d i t s c a t a l y s i s i n p r o t e i n f o ld i n g . I n : P a i n R . H . : m e c h a n i s m o f p r o t e i n f o l d i n g ( 2 n d E d ) ,O x f o r d U n i v e r s i t

484、 y P r e s s . O x f o r d . , 2 0 0 0 , P 2 1 2 - 2 4 9 4 6 1 L o n d o n J , S k r z y n i a C , G o l d b e r g M E . R e n a t u r a t i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i t r y p t o p h a n a s e a ft e r e x p o s u r e t o 8 M u re a . E v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e o f n u

485、 c l e a t i o n c e n t e r s . E u r . J . B i o c h e m . , 1 9 7 人 4 7 : 4 0 9 - 4 1 5 4 7 We t z e l R . M u t a t i o n s a n d o f f - p a t h w a y a g g r e g a t i o n o f p r o t e i n s . T r e n d s B io t e c h n o l. , 1 9 9 4 , 1 2 : 1 9 3 - 1 9 8 4 8 H a a s e - P e tt i n g e l l C

486、 A , K i n g , J . F o r m a t i o n o f a g g r e g a t e s f r o m a t h e r m o l a b i l e i n v i v o f o l d i n g i n t e r m e d i a t e i n P 2 2 t a i l s p i k e m a t u r a t io n . a m y o t r o p h i c l a t e r a l s c l e r o s i s . P ro c . N a i l . A c a d . S c i . U . S . A . ,

487、 1 9 8 8 ,9 7 : 1 2 5 7 1 - 1 2 5 7 6t 4 9 K o p i t o R R . A g g r e s o m e s , i n c l u s i o n b o d i e s a n d p r o t e i n a g g r e g a t i o n . T r e n d s C e l l B i o l. , 2 0 0 0 , 1 0 : 5 2 4 - 5 3 4 5 0 l C l a r k E D B . R e f o l d i n g o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n

488、s . C u r r O p i n B i o t e c h n o l . 1 9 9 8 , 9 : 1 5 7 - 1 6 3 . 5 1 G o l d b e r g M E , R u d o l p h R , J a e n i c k e R . A k in e t i c s t u d y 叮t h e c o m p e t i t i o n b e t w e e n r e n a t u r a t i o n a n d a g g r e g a t i o n d u r i n g t h e re f o l d i n g o f d e n

489、 a t u r e d - re d u c e d e g g w h i t e ly s o z y m e . B io c h e m is t r y . , 1 9 9 1 , 3 0 : 2 7 9 0 - 2 7 9 7 5 2 1 S p e e d MA , Wa n g D I C , K i n g J . S p e c i f ic a g g r e g a t i o n o f p a rt ia l l y f o l d e d p o iy p e p t i d e c h a i n s : t h e m o l e c u l a r b a

490、 s i s o f i n c l u s i o n b o d y c o m p o s i t i o n . N a t B i o t e c h n o l ., 1 9 9 6 , 1 4 : 1 2 8 3 - 1 2 8 7 5 3 1 R i n a s U , B a ile y J E . O v e re x p r e s s io n o f b a c t e r ia l h e m o g lo b in c a u s e s in c o r p o r a t i o n o f p r e - 1 - l a c t a m a s e i n

491、t o c y t o p la s m i c in c l u s i o n b o d i e s . A p p l . E n v i r o n . Mi c ro b i o l . , 1 9 9 3 , 5 9 :5 6 1 - 5 6 6 . 5 4 L i l ie H , S c h w a r z E ., R u d o lp h R . A d v a n c e s in re f o l d in g o f p r o t e in s p r o d u c e d i n E . c o l i . C u r t . O p in . B i o t

492、 e c h n o l . , 1 9 9 8 , 9 : 4 9 7 - 5 0 1 5 习C a r r i o M M, C o r c h e r o J L , V i l t a v e r d e A . D y n a m i c s o f i n v i v o p r o t e i n a g g r e g a t i o n : b u i i d in g i n c l u s i o n b o d i e s i n r e c o m b i n a n t b a c t e r i a . F E MS Mic r o b i o l . L e t

493、t . , 1 9 9 8 , 1 6 9 : 9 - 1 5t 5 6 1 C a r r i o M M , V i l ta v e r d e A . C o n s t r u c t i o n a n d d e c o n s t r u c t i o n o f b a c t e r i a l i n c l u s i o n b o d i e s .J B i o t e c h n o l ., 2 0 0 2 ,9 6 : 3 - 1 2 5 7 B o w d e n G A . , P a r e d e s A M , G e o r g i o u G

494、 . S t r u c t u r e a n d m o r p h o l o g y o f p r o t e i n i n c l u s i o n b o d i e s i n E s c h e r i c h i a c o l i . B i o t e c h n o l o g y . , 9 9 1 , 9 : 7 2 5 - 7 3 0 5 8 1 C a r r io M M , V i lla v e r d e A . P r o te in a g g r e g a t io n a s b a c t e r i a l in c l u s i

495、o n b o d ie s i s r e v e r s ib l e . F E E S L e tt， 加0 1 产8 9 : 2 9 - 3 3 . 5 9 G e o r g i o u G , T e l f o r d J N , S h u l e r M L , Wi l s o n D B . L o c a l i z a t i o n o f i n c l u s i o n b o d i e s i n E s c h e r ic h i a c o l i a v e r - p ro d u c i n g 1 l - l a c t a m a s e

496、 o r a l k a l in e p h o s p h a t a s e . A p p l . E n v i r o n . .M i c ro b i o l . , 1 9 8 6 , 5 2 : 1 1 5 7 - 1 1 6 1 . 6 0 1 B o w d e n G A , G e o r g io u G . F o l d i n g a n d a g g r e g a t i o n o f i - l a c t a m a s e i n t h e p e r i p l a s m i c s p a c e o f E s c h e r i c

497、 h i a c o l t . J . B i o l . C h e m ., 1 9 9 0 , 2 6 5 : 1 6 7 印- 1 6 7 6 6 6 1 1 W o n g H H . O N e i l l B K , M i d d e l b e r g A P . C u m u l a t iv e s e d i m e n t a t i o n a n a l y s i s o f E s c h e r i c h i a c o l i d e b r i s s i z e . B i o t e c h n o l . B i o e n g . , 1

498、9 9 7 , 5 5 : 5 5 6 - 5 6 4 f 6 2 M u k h o p a d h y a y A . I n c l u s i o n b o d i e s a n d p u r i f i c a t i o n o f p r o t e i n s i n b i o l o g i c a l l y a c t i v e f o r m s . A d v B i o c h e m E n g B i o t e c h n o l ， 1 9 9 7 , 5 6 :6 1 一 1 0 91 4 2疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白 质折叠复性的探索 6

499、 3 1 R i n a s U , B a i l e y J E . P r o t e i n c o m p o s it i o n a l a n a l y s is o f i n c l u s i o n b o d i e s p r o d u c e d i n r e c o m b i n a n t E s c h e r i c h i a c o l i . A p p l . Mi c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , 1 9 9 2 , 3 7 : 6 0 9 - 6 1 4 6 4 A l l e n S P

500、, P o l a z z i J D , G i e r s e J 长 E a s t o n AM T w o n o v e l h e a t s h o c k g e n e s e n c o d i n g p r o t e i n s p r o d u c e d i n r e s p o n s e t o h e t e r o l o g o u s p r o t e i n e x p r e s s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . , 1 9 9 2 , 1

501、 7 4 : 6 9 3 8 - 6 9 4 7 6 5 1 V e i n g e r L , D i a m a n t S , B u c h n e r J , G o l o u b i n o f f P . T h e s m a l l h e a t - s h o c k p r o t e i n I b p B f ro m E s c h e r i c h i a c o l i s t a b i l i z e s s t r e s s - d e n a t u r e d p r o t e i n s f o r s u b s e q u e n t

502、r e f o l d - i n g b y a m u lt i c h a p e r o n e n e t w o r k . J . B i o l . C h e m, 1 9 9 8 , 2 7 3 : 1 1 0 3 2 - 1 1 0 3 7 . 6 6 1 M i d d e l b e r g A P . P r e p a r a t i v e p r o t e i n r e f o l d i n g . T r e n d s B i o t e c h n o l . ,2 0 0 2 , 2 0 : 4 3 7 - 4 4 5工 6 7 ) H a e

503、l e w y n J , L e y D . A r a p i d s i n g l e p u r i f ic a ti o n m e t h o d f o r h u m a n i n t e r f e r o n - y fr o m i s o l a t e d E s c h e ri c h i a c o i l . i n c l u s i o n b o d i e s .B i o c h e m Mo l B i o l I n t , 1 9 9 5 , 3 7 : 1 1 6 3 - 1 1 7 1 6 8 G e o u r g i o u G

504、, V a l a x P . I s o l a t i n g i n c l u s i o n b o d i e s f r o m b a c t e r i a . Me t h o d s E n z y m o l ., 1 9 9 9 , 3 0 9 : 4 8 - 5 8 .( 6 9 Ma a c h u p a l l i - R e d d y J , K e l l e y B D , D e B e rn a r d e z C l a r k E . E f f e c t o f i n c l u s i o n b o d y c o n t a m i

505、n a n t s o n t h e o x i d a t i v e r e n a t u r a t i o n o f h e n e g g w h i t e l y s o z y m e . B i o t e c h n o l . P r o g . , 1 9 9 7 , 1 3 : 1 4 4 - 1 5 0 . t 0 M a r s t o n F A . T h e p u r i f i c a t i o n o f e u k a r y o t i c p o l y p e p t id e s s y n t h e s i z e d i n E

506、 s c h e r i c h i a c o l i . B i o c h e m J , 1 9 8 6 ,2 4 0 : 1 - 1 2 . 7 1 M a r s t o n F A , H a r t l e y D . L . S o l u b i li z a t l o n o f p r o t e i n a g g r e g a t e s . M e t h o d s E n z y m o 1 . , 1 9 9 0 , 1 8 2 : 2 6 4 - 2 7 6 7 2 G u Z , We i d e n h a u p t M , I v a n o

507、v a N , P a v l o v M , X u B , S u Z G , J a n s o n J C . C h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d s f o r t h e i s o l a ti o n。 a n d r e f o l d i n g o f p r o t e i n s fr o m E s c h e r ic h i a c o i l i n c l u s i o n b o d i e s .P r o t e i n E x p r P u r i f ,2 0 0 2 , 2 5 : 1 7 4

508、- 1 7 9 7 3 W a l k e r S G , L y d d i a n A . A q u e o u s t w o - p h a s e s y s t e m s a s a n a l t e r n a t i v e p r o c e s s r o u t e f o r t h e f r a c t i o n a t i o n o f s m a l l i n c l u s i o n b o d ie s . J C h r o m a t o g r B . B i o m e d S c i A p p l . , 1 9 9 8 , 7 1

509、 1 : 1 8 5 - - 1 9 4 7 4 F i s c h e r B , S u m n e r L , G o o d e n o u g h P . I s o l a t i o n , re n a t u r a t i o n , a n d f o r m a t i o n o f d i s u l f i d e b o n d s o f e u k a r y o t i c p r o t e i n s e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o l i a s i n c l u s i o n b

510、o d i e s .B i o t e c h n o l . B i o e n g . , 1 9 9 3 , 4 1 : 3 - 1 3 7 5 T s u m o t o K , E j i m a D , K u m a g a i I , A r a k a w a T . P r a c t i c a l c o n s i d e r a t i o n s i n r e f o l d i n g p r o t e i n s fr o m i n c l u s i o n b o d i e s . P r o t e i n E x p r P u r i f

511、, 2 0 0 3 , 2 8 : 1 - 8 7 6 H a g e l P , G e r d i n g J J T , F i e g g e n W, B l o e m e n d a l H . C y a n a t e f o r m a t i o n i n s o l u t i o n s u r e a .l . C a c u l a t i o n o f c y n a t e c o n c e n t r t i o n s a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e a n d p H . B i o c h

512、e m B i o n h y s A c t a , 1 9 7 1 , 2 4 3 : 3 6 6 - 3 7 2 . 7 7 S t o c k e l J , D o t i n g K , Ma l o t k a J , J a h n i g F , D o r n m a i r K . P a t h w a y o f d e t e r g e n t - m e d ia t e d a n d p e p t i d e l i g a n d - m e d i a t e d r e f o l d i n g o f h e t e r o d i m e r

513、c la s s I I m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l it y c o m p l e x ( M H C ) m o l e c u l e s . E u r J B i o c h e m , 1 9 9 7 , 2 4 8 : 6 8 4 - 6 9 1 . 7 8 P u r i N K , C a r d a m o n e M. A r e l a t i o n s h ip b e t w e e n t h e s t a r t i n g s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f

514、r e c o m b i n a n t p o r c i n e g r o w t h h o r m o n e s o l u b i l i z e d f r o m i n c l u s i o n b o d i e s a n d t h e y i e l d o f n a t iv e ( m o n o m e r i c ) p r o t e i n a ft e r i n v i t r o re f o l d i n g . F E B S L e t t , 1 9 9 2 , 3 0 5 : 1 7 7 - 1 8 0 . 7 9 1 K u r

515、 u c z I , T i t u s J A , J o s t C R , S e g a l D M. C o r r e c t d i s u l f i d e p a i r i n g a n d e f f i c i e n t re f o ld i n g o f d e t e r g e n t - s o l u b i l i z e d s i n g l e - c h a i n F v p r o t e i n s fr o m b a c t e r i a l i n c l u s i o n b o d i e s . M o l l m m

516、 u n o l , 1 9 9 5 , 3 2 : 1 4 4 3 - 1 4 5 2 . 8 0 G a v i t P , B e tt e r M. P r o d u c t io n o f a n t i f u n g a i re c o m b i n a n t p e p t i d e s i n E s c h e r i c h i a c o l i . J B i o t e c h n o l , 2 0 0 0 , 7 9 : 1 2 7 - 1 3 6参考文献1 4 3 8 1 K h a n R H , R a o K B C A , E s h w

517、a r i A N S , T o t e y S M, P a n d a A K . S o l u b i l i z a t i o n o f re c o m b i n a n t o v i n e g r o w t h h o r m o n e w i t h r e t e n t i o n o f n a t i v e - l i k e s e c o n d a ry s t r u c t u r e a n d it s r e f o l d i n g f r o m t h e i n c l u s i o n b o d i e s o f E

518、s c h e r i c h i a c o l i . B i o t e e h n o l P r o g , 1 9 9 8 , 1 4 : 7 2 2 - 7 2 8 . 8 2 1 P a t r a A K , Mu k h o p a d h y a y R , M u h h ij a R , K r i s h n a n A , G a r g L C , P a n d a A K O p t i m i z a t i o n o f i n c l u s i o n b o d y s o l u b i l i z a t io n a n d r e n a

519、 t u r a t i o n o f re c o m b i n a n t h u m a n g r o w t h h o r m o n e f r o m E s c h e r ic h i a c o i l . P r o t e i n E x p r e s s P u r i f , 2 0 0 0 , 1 8 : 1 8 2 - 1 9 2 8 3 S t J o h n R J , C a r p e n t e r J F , R a n d o l p h T W. H i g h p r e s s u r e f o s t e r s p r o t

520、e i n r e f o l d i n g f r o m a g g r e g a t e s a t h i g h c o n c e n t r a t i o n . P r o c N a t A c a d S c i U S A , 1 9 9 9 , 9 6 : 1 3 0 2 9 - 1 3 0 3 3 8 4 1 D e B e r n a r d e z C l a r k E , S c h w a r z E , R u d o l p h R .I n h i b i t i o n o f a g g r e g a t i o n s i d e re

521、a c t i o n s d u r i n g i n v i t r o p r o t e i n f o l d i n g . Me t h o d s E n z y m o l , 1 9 9 9 , 3 0 9 :2 1 7 - 2 3 6 8 5 M u k h o p a d h y a y A . R e v e r s i b l e p ro t e c ti o n o f d i s u l f i d e b o n d s f o l l o w e d b y o x i d a t i v e f o l d i n g re n d e r r e c

522、 o m b i n a n t h C G (3 h i g h l y i m m u n o g e n i c . V a c c i n e , 2 0 0 0 , 1 8 : 1 8 0 2 - 1 8 1 0 . 8 6 D e B e r n a r d e z C l a r k E . P r o t e i n r e f o l d i n g f o r i n d u s t r i a l p r o c e s s c u r re n t o p i n i o n i n b i o t e c h n o l o g y . , 2 0 0 1 , 1 2

523、 : 2 0 2 - 2 0 7 8 7 F a l c o n e r R J , O N e i l l B K , Mi d d e l b e r g A P . C h e m ic a l t r e a t m e n t o f E s c h e r i c h i a c o l i . 2 . D i r e c t e x t r a c t i o n o f r e c o m b i n a n t p ro t e i n f r o m c y t o p l a s m i c i n c l u s i o n b o d i e s i n i n t

524、a c t c e l l s . B i o t e c h n o l B io e n g ., 1 9 9 8 , 5 7 :3 8 1 - 3 8 6 . 8 8 H a r t R A . e t a l . L a r g e - s c a l e , i n s i t u i s o l a t i o n o f p e r i p l a s m i c I G F - I fr o m E . c o l i . B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 4 , 1 2 : 1 1 1 3 - 1 1 1 7t 8 9 A h n J H , L

525、 e e Y P , R h e e J S . I n v e s t ig a t i o n o f r e f o l d i n g c o n d i t i o n f o r P s e u d o m o n a s fl u o re s c e n s l i p a s e 妙r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y . J B i o t e c h n o l ., 1 9 9 7 , 5 4 : 1 5 1 - 1 6 0 . 9 0 1 S i m m o n s T , N e w h o u s

526、e Y M , A rn o l d K S , I n n e r a r it y T L , W e i s g r a b e r K H . H u m a n l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r e c e p t o r f r a g m e n t . S u c c e s s f u l r e f o l d i n g o f a f u n c t i o n a l l y a c t i v e l i g a n d - b i n d i n g d o m a i n p ro d u c e d i n

527、 E s c h e r i c h i a c o i l . J B i o C h e m , 1 9 9 7 , 2 7 2 :2 5 5 3 1 - 2 5 5 3 6 . 9 1 N e g r o A , O n i s t o M , G r a s s a t o L , C a e n a z z o C , G a r b i s a S . R e c o m b in a n t h u m a n T I M P - 3 f r o m E s c h e r i c h i a c o i l : s y n t h e s i s , re f o l d i

528、r t g , p h y s i c o - c h e m i c a l a n d f u n c t i o n a l i n s i g h t s . P r o t e in E n g , 1 9 9 7 , 1 0 :5 9 3 - 5 9 9 .1 9 2 C e r l e tt i N , M c Mas t e r G K , C o x D , S c h m i t z A , M e y b a c k B . P r o c e s s f o r r e f o l d i n g r e c o m b i n a n t l y p r o d u

529、c e d T G F - - - l i k e p r o t e i n s . U S P a t e n t , 1 9 9 7 , 5 6 5 0 4 9 4 . 9 3 R u d o l p h R , L i l l e H . I n v i t r o f o l d i n g o f i n c l u s i o n b o d y p r o t e i n s . F A S E B J ., 1 9 9 6 , 1 0 : 4 9 - 5 6 9 4 1 K a t o h S . , K a t o h Y . C o n t i n u o u s r e

530、 f o l d i n g o f ly s o z y m e w it h f e d - b a t h a d d i t i o n o f d e n a t u r e d p r o t e i n s o l u t i o n . P r o c e s s B l o e h e m i s t ry . , 2 0 0 0 , 3 5 : 1 1 1 9 - 1 1 2 4 9 5 R u d o l p h , R a i n e r , F i s h e r . P r o c e s s f o r o b t a i n i n g r e n a t u

531、r e d p r o t e i n s . U S p a t e n t . , 1 9 9 0 , 4 9 3 3 4 3 4汐 司M a e d a Y , U e d a T , l m o t o T . E f f e c ti v e re n a t u r a t i o n o f d e n a t u r e d a n d r e d u c e d i m m u n o g l o b u l i n G i n v it r o w it h o u t as s i s t a n c e o f c h a p e ro n e . P ro t e i

532、 n E n g . , 1 9 9 6 , 9 : 9 5 - 1 0 0 9 7 1 Y a n c e y P H . , C l a r k M E . , H a n d S C , B o w l u s R D , S o m e r o G N . L i v i n g w it h w a t e r s t r e s s : e v o l u t i o n o f o s m o l y t e s y s t e m s . S c i e n c e , 9 8 2 , 2 1 7 , 1 2 1 4 - 1 2 2 2 9 8 B o l e n D W. P

533、 r o t e i n s t a b i l i z a t i o n b y n a t u r a l l y o c c u r r i n g o s m o l y t e s . I n P r o t e i n s t r u c t u r e , s t a b i l i t y , a n d f o l d i n g . E d i te d 勿M u r p h y K .P . . U . S . A . H u m a n P r e s s ., 2 0 fl 1 , p p l 7 - 3 6 9 9 A r a k a w a T , T i m

534、as h e f f S N . T h e s t a b i l i z a t i o n o f p ro t e i n s b y o s m o l y t e s . B i o p h y s .J . , 1 9 8 5 , 4 7 : 4 1 1 - 4 1 4f 1 0 句 G e k k o K , T i m as h e f f S N . M e c h a n i s m o f p r o t e i n s t a b i l i z a t i o n 妙g l y c e r o l : p re f e r e n t i a l h y d r a

535、 t i o n i n g l y c e r o l- w a t e r m i x t u r e s , B i o c h e m i s t r y , 1 9 8 1 ,2 0 : 4 6 6 7 - 4 6 7 6 .1 4 4夔丝一 里 属 析 孕 其 相 关 技 术 辅 助 蛋 白 质 折 叠 复 性 的 探 索 1 0 1 1 1 L e e J C - 7 2 01， T i m a s h e ff S .N . T h e s t a b i l i z a t i o n o f p r o t e i n s 妙s u c ro s e , J .B i o

536、l .C h e m ., 1 9 8 1 , 2 5 6 : 7 1 9 3 1 0 2 1 L iu Y , B o le n D W. T h e P e p t id e B a c k b o n e P l a y s a D o m in a n t R o le i n P ro t e i n S t a b i l i z a t i o n b y N a t u r a l l y O c c u r r i n g O s m o l y t e s t . B i o c h e m i s t ry , 1 9 9 5 , 3 4 , 1 2 8 8 4 - 1

537、2 8 9 1 1 0 3 W a n g A , B o le n D W . A N a t u r a l l y O c c u r r i n g P r o t e c t i v e S y s t e m i n U re a - R i c h C e l l s : M e c h a n i s m o f O s m o l y t e P r o t e c t i o n o f P r o t e i n s a g a i n s t U r e a D e n a u u r a t i o n , B i o c h e m s i t ry , 1 9 9

538、 7 , 3 6 ,9 1 0 1 - 9 1 0 8 1 0 4 Q u Y . , B o l e n C . L ， B o l e n D . W.( 1 9 9 8 ) O s m o l y t e - d r i v e n c o n t r a c t i o n o f a r a n d o m c o i l p r o t e i n P r o c .N a t l .A c a d . S c i . U S A 9 5 , 9 2 6 8 - 9 2 7 3 1 0 5 1 R a r i y R V . C o r re c t p ro t e i n f

539、o l d i n g i n g l y c e ro l . P r a c .N a t l . A c a d .S c i . U S A ., 1 9 9 7 , 9 4 : 1 3 5 2 0 - 1 3 5 2 3 1 0 6 M e n g F , P a r k Y , Z h o u H . R o l e o f p r a l i n e , g ly c e r o l a n d h e p a r i n a s p ro t e i n f o l d i n g a i d s d u r i n g r e f o ld i n g o f r a b b

540、 i t m u s c l e c r e a t i v e k i n a s e . I n t J B i o c h e m C e l l B i o l . , 2 0 0 0 , 3 3 : 7 0 1 - 7 0 9 1 0 7 1 L a i B, C a o A , L a i L . O r g a n ic c o s o l v e n t a n d h e n a g g w h it e l y s o z y m e f o l d i n g . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . , 2 0 0 0 ,

541、1 5 4 3 : 1 1 5 - 1 2 2 1 0 8 1 D i a m a n t S , E l i a l m N , R o s e n t h a l D , G o l o u b i n o ff P . C h e m i c a l C h a p e r o n e s r e g u l a t e m o l e c u l a r c h a p e r o n e s i n v i t r o a n d i n c e l l s u n d e r c o m b i n e d s a l t a n d h e a t s t r e s s e s

542、 . J B i o l C h e m , 2 0 0 1 , 2 7 6 : 3 9 5 8 6 - 3 9 5 9 1 1 0 9 1 O h n i s h i 毛O h n i s h i K , W a n g X , T a k a h a s h i A , O k a i c h i K . R e s t o r a t i o n o f m u t a n t T P 5 3 t o n o r m a l T P 5 3 f u n c t i o n b y g l y c e r o l a s a c h e m i c a l c h a p e r o n

543、e , . R a d . R e s . , 1 9 9 9 , 1 5 1 :4 9 8 - 5 0 0 1 1 0 M a e d a Y , Y a m a d a H , U e d a T , i m o t o T . E ff e c t o f a d d it i v e s o n t h e r e n a t u r a t i o n o f re d u c e d iy s o z y m e i n t h e p r e s e n c e o f 4 M u r e a . P r o t e i n E n g , 1 9 9 6 , 9 :4 6 1

544、4 6 5 1 1 1 G u is e AD , We s t S M, C h a u d h u r i J B . P r o t e i n f o l d i n g i n v i v o a n d r e n a t u r a t i o n o f re c o m b i n a n t p ro t e in s f r o m i n c l u s i o n b o d i e s . Mo l B io t e c h n o l ., 1 9 9 6 , 6 : 5 3 - 6 4 1 1 2 C l e l a n d J L , H e d g e p

545、e t h C , Wa n g D I . P o l y e t h y l e n e g l y c o l e n h a n c e d re f o l d i n g o f b o v i n e c a r b o n i c a n h y d r a s e B . s t o i c h i o m e t r y a n d re f o l d i n g m o d e l . J B i o l C h e m ., 1 9 9 2 , 2 6 7 : 1 3 3 2 7 - 1 3 3 3 4汇 1 1 3 K a r u p p i a h N . , S

546、 h a r m a A . C y c lo d e x t r i n s a s p r o t e i n f o l d i n g a i d s , B i o c h e m . B i o p h y s . R e s , C o m m o n . , 1 9 9 5 , 2 1 1 :6 0 - 6 6 1 1 4 A r o r a D , K h a n n a N . M e t h o d f o r i n c r e a s i n g t h e y i e l d o f p r o p e r l y f o ld e d r e c o m b i

547、n a n t y i n t e r f e r o n f rom i n c l u s i o n b o d i e s , J .B i o t e c h n o l ., 1 9 9 6 , 5 2 : 1 2 7 - 1 3 3 1 1 5 S u e n a g a M, O h m a e H , T s u j i S , I t o h卫N i s h im u r a O . R e n a t u r a t i o n o f r e c o m b i n a n t h u m a n n e u r o t r o p h i n - 3 fr o m i

548、 n c l u s i o n b o d i e s u s i n g a s u p p r e s s o r a g e n t o f a g g r e g a t i o n . B i o t e c h n o l . A p p l . Bi o c h e m. , 1 9 9 8 , 2 8 , 1 1 9 - 1 2 4 1 1 6 B u c h n e r J , R u d o l p h R . R e n a t u r a t i o n , p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t

549、 i o n o f r e c o m b in a n t F a b - f r a g m e n t s p r o d u c e d i n E s c h e r ic h i a c o l i . B i o / T e c h n o l o g y , 1 9 9 1 , 9 : 1 5 7 - 1 6 2 . 1 1 7 1 L i n W J , T r a u g h J A . R e n a t u r a t i o n o # c a s e i n k i n a s e 1 1 f r o m r e c o m b i n a n t s u b u

550、 n it s p r o d u c e d i n E s c h e r i c h i a c o li : p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e re c o n s t i t u t e d h o l o e n z y m e . P ro t e i n E x p r P u r i f 1 9 9 3 , 4 : 2 5 6 - 2 6 4 . 1 1 8 H s i h M H , K u o J C , T s a i H J . O p ti m i z a

551、t i o n o f t h e s o l u b i l i z a t i o n a n d re n a t u r a t i o n o f f i s h g ro w t h h o r m o n e p r o d u c e d b y E s c h e r i c h i a c o l a . A p p I M i c r o b i o l B i o t e c h n o l , 1 9 9 7 , 4 8 :6 6 - 7 2 . 1 1 9 L i n T Y , T i m a s h e ff S N . O n t h e r o l e o

552、f s u r f a c e t e n s i o n i n t h e s t a b i l i z a ti o n o f g l o b u l a r p r o t e i n s . P r o t e i n S c i , 1 9 9 6 , 5 : 3 7 2 - 3 8 1 . 1 2 0 1 A r a k a w a T , T s u m o t o K . T h e e f f e c t s o f a r g i n i n e o n re f o ld i n g o f a g g r e g a t e d p r o t e i n s :

553、 n o t f a c i l i t a t e re f o l d i n g , b u t s u p p r e s s a g g re g a t i o n . B i o c h e m B io p h y s R e s .C o m m u n . ,2 0 0 3 , 3 0 4 : 1 4 8 - 1 5 2 1 2 1 1 T a n d o n S , H o r o w it z P . D e t e r g e n t - a s s i s t e d r e f o l d in g o f g u a n i d i n i u m c h l

554、o r i d e - d e n a t u r e d参考文献1 4 5 r h o d a n e s e . T h e e ff e c t o f i a u r y l m a l t o s id e . J B i o l C h e m . 1 9 8 6 , 2 6 1 : 1 5 6 1 5 - 1 5 6 8 1 1 2 2 T a n d o n S , H o r o w i t z P . D e t e r g e n t - as s i s t e d r e f o l d i n g o f g u a n i d i n i u m c h l o

555、r i d e - d e n a t u r e d r h o d a n e s e .T h e e ff e c t s o f t h e c o n c e n t r a t i o n a n d t y p e o f d e t e r g e n t .J B i o l C h e m ., 1 9 8 7 , 2 6 2 : 4 4 8 6 - 4 4 9 1 1 2 3 D i a z R S , C a r m o n a P , R e g u e i ro P , M o n r e a l J . R e n a t u r a t i o n o f t

556、 h e b r a i n m y e l i n p ro t e i n s b y o c t y l g l u c o s i d e d e t e r g e n t . B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n ., 1 9 9 2 , 1 8 9 : 1 5 3 4 - 1 5 4 2 1 2 4 L o n d o n E , K h o r a n a H G . D e n a t u r a t i o n a n d r e n a t u r a t i o n o f b a c t e r i o r h o

557、 d o p s i n i n d e t e r g e n t s a n d l i p i d - d e t e r g e n t m i x t u r e s . J B i o l C h e m , 1 9 8 2 , 2 5 7 :7 0 0 3 - 7 0 1 1 1 2 5 V u l l a r d L a u r e n t , R a b i l l o u d T h i e r r y , G o l d b e r g M i c h e l E . ( 1 9 9 8 ) I n t e r a c t i o n o , n o n - d e t

558、e r g e n t s u l f o b e t a i n s w i t h e a r ly f o l d i n g in t e r m e d i a t e s f a c i l i t a t e i n v i t r o p r o t e i n re n a t u r a t i o n E u r .J . B i o . c h e w . 2 5 6 : 1 2 8 - 1 3 5 1 2 6 K u b o i R , Y o s h i m o t o M , Wa l d e P , L u i s i P L . R e f o ld i n

559、g o f C a r b o n i c A n h y d r as e A s s i s t e d b y 1 - P a l m it o y l - 2 - O l e o y l - s n - G l y c e r o - 3 - P h o s p h o c h o l i n e L i p o s o m e s . B i o t e c h n o l . P r o g . , 1 9 9 7 , 1 3 : 8 2 8 - 8 3 6 1 2 7 Y o s h i m o t o M , S h i m a n o u c h i T , U m a k

560、o s h i H . I m m o b i l i z e d l i p o s o m e c h r o m a t o g r a p h y f o r r e f o l d i n g a n d p u r i f ic a t i o n o f p ro t e i n . J . C h r o m a t o g r . B . B i o m e d . S c i . A 即1 . , 2 0 0 0 , 7 4 3 , 9 3 - 9 9 1 2 8 B u i l d e r S , H a r t R , L e s t e r P , R e i f s

561、 n y d e r D . R e f o l d i n g o f m is f o l d e d A i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r - I U S P a t e n t , 1 9 9 7 , 5 6 6 3 3 0 4 1 2 9 H s v e h a n D , D e B e r n a r d e z C l a r k E O x i d a t i v e r e n a t u r a t i o n o f i y s o z y m e a t h i g h c o n c e n t r a

562、t i o n s . B i o t e c h n o l B i o e n g , 1 9 9 7 , 5 4 : 2 2 1 - 2 3 0t 1 3 叨 R u d o l p h R , B o h m G , L i l i e H , J a e n i c k e R . F o l d in g p ro t e i n s , I n : P ro t e i n F u n c t i o n . A P r a c t i c a l A p p r o a c h ( 2 n d ) . E d it e d b y C re i g h t o n T E .

563、N e w Y o r k : I R L P r e s s , 1 9 9 7 , p p 5 7 - 9 9 . 1 3 1 C o w l e y D J , M a c k i n R B . E x p r e s s i o n , p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f re c o m b i n a n t h u m a n . p r o i n s u l i n , F E B S 沈氏1 9 9 7 , 4 0 2 : 1 2 4 - 1 3 0 1 3 2 B e n -

564、 Z v i A P ,C h a t e l l e r R J , F e r s h t A R , G o l o u b i n o ff P . M i n i m a l a n d o p t i m a l m e c h a n is m f o r G r o E - m e d i a t e d p r o t e i n f o ld i n g . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . , 1 9 9 8 ,9 5 : 1 5 2 7 5 - 1 5 2 8 0 1 3 3 1 D o n g X , Y a

565、n g H , S u n Y . L y s o z y m e re f o l d i n g w i t h i m m o b i l i z e d G r o E L c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y . J C h r o m a t o g r A , 2 0 0 0 , 8 7 8 : 1 9 7 - 2 0 4 1 3 4 1 Z a h n R , B u c k l e A M, P e t r e t t 氏J o h n s o n C M, C o r r a l e s F J , G o l b i k R ,

566、F e r s h t A R . P r o c . N a i l A c a d . S c i . U S A , 1 9 9 6 , 9 3 : 1 5 0 2 4 - 1 5 0 2 9 , 1 3 5 C h a t e l lie r J , H i l l F , L u n d , P A , F e r s h t A R . In v iv o a c t iv it ie s o f G r 6 E L m in ic h a p e r o n e s . P r o c N a l l . A c a d . S c i . U S A , 1 9 9 8 , 9

567、 5 : 9 8 6 1 - 9 8 6 6 1 3 6 R a m a n B , R a m a k r is h n a T , R a o C M . E ff e c t o f t h e c h a p e r o n e - l i k e a l p h a - c r y s t a l l i n o n t h e r e f o l d i n g o f l y s o z y m e a n d r i b o n u c l e a s e A . F E B S le t t ， 1 9 9 7 , 4 1 6 : 3 6 9 - 3 7 2 1 3 7 1

568、S z e b e n i A , O l s o n M. N u c l e o l a r p r o t e i n B 2 3 h a s m o l e c u l a r c h a p e r o n e a c t i v i t i e s . P r o t e i n S c i 1 9 9 9 , 8 : 9 0 5 - 9 1 2 .1 1 3 8 T a p as M , T a r a d as S , A s i m P , M a n a m i R , K a l i P D , B b a b a t a r a k B . C h a p e ro n

569、 e - l i k e A c t iv i t y o f T u b u l i n . B i n d i n g a n d r e a c t i o n o f u n f o l d e d s u b s t r a t e e n z y m e s . J . B io l, C h e m . , 2 0 0 1 , 2 7 6 : 3 9 7 4 2 - 3 9 7 4 7 1 3 9 D u C , Y e J M., W o l f e J L . I m p r o v e d F o ld i n g Y i e l d s 时a M o d e l P r

570、o t e i n U s i n g P ro t e i n D i s u l fi d e I s o m e r as e . P h a r m a c e u t . R e s . . , 1 9 9 8 , 1 5 : 1 8 0 8 - 1 8 1 5 1 4 0 1 R o z e m a D , G e l l m a n S H . A r t if ic i a l C h a p e r o n e s s P r o t e i n R e f o l d i n g v i a S e q u e n t i a l U s e o f D e t e r g

571、 e n t a n d C y c l o d e x t r i n . J . A m . C h e m . S a c . , 1 9 9 5 , 1 1 7 , 2 3 7 3 - 2 3 7 41 4 6疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索 1 4 1 lR o z e m a D,G e l l m a n S H . A r t i f i c i a l c h a p e r o n e - a s s i s t e d re f o l d i n g o f c a r b o n i c a n h y d r a s e B . J B i o l

572、C h e m . , 1 9 9 6 , 2 7 1 : 3 4 7 8 - 3 4 8 7 1 4 2 R o z e m a D , G e l l m a n S H . A r t if ic i a l c h a p e r o n e - a s s i s t e d r e f o l d i n g o f d e n a t u r e d - r e d u c e d l y s o z y m e : m o d u l a t i o n o f t h e c o m p e t i t i o n b e t w e e n r e n a t u r a

573、t i o n a n d a g g re g a t i o n . B io c h e m i s t r y , 1 9 9 6 , 3 5 : 1 5 7 6 0 - 1 5 7 7 1( 1 4 3 D a u g h e r t y D L , R o z e m a D , H a n s o n P 民G e l l m a n S H . A r t i f i c i a l C h a p e ro n e - a s s i s t e d r e f o l d i n g o f c i t r a t e s y n t h a s e. J B i o l

574、, c h e m . . , 1 9 9 8 ,2 7 3 : 3 3 9 6 1 - 3 3 9 7 1 1 4 4 S u n d a r i C S , R a m a n B , B a l a s u b r a m a n i a n D . A r t if i c i a l c h a p e r o n i n g o f i n s u l i n , h u m a n c a r b o n i c a n h y d r as e a n d h e n e g g l y s o z y m e u s i n g l i n e a r d e x t r i

575、 n c h a i n s - - a s w e e t r o u t e t o t h e n a t i v e s t a t e o f g l o b u l a r p r o t e i n s . F E B S L e tt ., 1 9 9 9 , 4 4 3 : 2 1 5 - 2 1 9 1 4 5 1 Y u t a N , Ma s a h ir o 1 , No z o m i Y , Y a s u h i r o A , K a z u n a r i A . P r o t e i n r e f o l d i n g a s s i s t e

576、d b y s e l f - a s s e m b l e d n a n o g e l s as n o v e l a rt i f i c i a l m o l e c u l a r c h a p e r o n e .F E B S L e tt e r s , 2 0 0 3 , 5 5 3 : 2 7 1 - 2 7 6f 1 4 6 Y o s h i m o t o N , H as h i m o t o T , F e l ix M M , U m a k o s h i H , K u b o i R . A rt i fi c i a l c h a p e

577、 r o n e - a s s i s t e d r e f o l d i n g o f b o v i n e c a r b o n i c a n h y d r a s e u s i n g m o l e c u la r a s s e m b li e s o f s t i m u l i - r e s p o n s i v e p o l y m e r s . B i o m a c r o m o l e c u l e s , 2 0 0 3 , 4 : 1 5 3 0 - 1 5 3 8 1 4 7 L i n S , L i n K , C h i u

578、 H , L i n S . E n h a n c e d p r o t e i n re n a t u r a t i o n b y t e m p e r a t u re - r e s p o n s i v e p o ly m e r s . B i o t e c h n o l . B i o e n g , 2 0 0 0 , 6 7 : 5 0 5 - 5 1 2 1 4 8 1 Y o s h i m o t o M , K u b o i R . O x i d a ti v e R e f o l d i n g o f D e n a t u r e d /

579、 R e d u c e d L y s o z y m e U t i l i z i n g t h e C h a p e ro n e - L i k e F u n c ti o n o f L i p o s o m e s a n d I m m o b i l i z e d L i p o s o m e C h r o m a t o g r a p h y . B i o t e c h n o l P r o g . , 1 9 9 9 , 1 5 : 4 8 0 - 4 8 7 . 1 4 9 K u b o i R , M a w a t a r i T , Y o

580、 s h i m o t o M . O x i d a t i v e R e f o l d i n g o f L y s o z y m e A s s i s t e d 勿N e g a t i v e ly C h a r g e d L i p o s o m e s : R e l a t i o n s h i p w i t h L y s o z y m e - M e d i a t e d F u s i o n o f L i p o s o m e s . J . B i o s c i . B i o e n g . , 2 0 0 0 , 9 0 : 1 4

581、 - 1 9 . 1 5 0 E n g e l h a r d M , E v a n s P A . K i n e t i c s o f i n t e r a c t i o n o f p a r t i a l l y f o l d e d p ro t e i n s w it h a h y d r o p h o b i c d y e : e v i d e n c e t h a t m o l t e n g lo b u l e c h a r a c t e r i s m a x i m a l i n e a r l y f o l d i n g i n

582、t e r m e d i a t e s .P r o t e i n S c i . , 1 9 9 5 , 4 : 1 5 5 3 - 1 5 6 2 1 5 1 1 K u n d u B , G u p t a s a r m a P . H y d r o p h o b i c d y e i n h i b i t s a g g r e g a t i o n o f m o lt e n c a r b o n ic a n h y d r a s e d u r i n g t h e r m a l u n f o l d i n g a n d r e f o l d

583、 i n g . P r o t e i n s , 1 9 9 9 , 3 7 : 3 2 1 - 3 2 4 1 5 2 lR a in e s R T . M e 如d o f f o l d i n g p ro t e i n s w i t h s y n t h e ti c d it h i o l c a t a l y s t s . U S p a t e n t , 1 9 9 9 , 5 9 1 0 4 3 5 1 5 3 L e v as h o v AV , K ly a c h k o N L . R e v e r s m i c e l l a r s y

584、s t e m s . I n :M e t h o d s .i n B i o t e c h n o l o g y , E n z y m e s i n N o n a q u e o u s S o l v e n t s : M e t h o d s a n d P r o t o c o l s , v o l . 1 5 . E d i t e d b y V u i f s o n E N , H a i l i n g P J , H o l l a n d F I L . H u m a n a P r e s s ,T o t o w a ,N J , 2 0 0

585、1 , p p . 5 7 5 - 5 8 6 . 1 5 4 K u d ry ash o v a E V , G l a d i l i n A 长 L e v ash o v A V . P ro t e i n s ( e n zym e s ) i n s u p r a m o le c u l a r as s e m b l e s : i n v e s t ig a t i o n o f s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n b y t i m e - r e s o l v e d fl u o re s c e n c

586、 e a n i s o t r o p y , P in g B i o l. C h e m . ( R u s . ) , 2 0 0 2 , 4 2 :2 5 7 - 2 9 4 . 1 5 5 M a r t i n e k K , L e v a s h o v AV , K l y a c h k o N L , K h m e l n i t s k y Y L , B e r e z i n I V , Mi c e l l a r e n zym o lo g y E u r . J . B i o c h e m, 1 9 8 6 , 1 5 5 : 4 5 3 - 4

587、6 8 1 5 6 M a r t i n e k K , L e v as h o v AV . , K l y a c h k o N L . , P a n t i n V 1 , B e re z i n I V .) T h e p r i n c i p l e s o f e n z y m e s t a b i l i z a t io n . V I . C a t a l y s i s b y w a t e r - s o l u b l e e n z y m e s e n t r a p p e d i n t o r e v e r s e d m i c e

588、 l l e s o f s u r f a c t a n t s i n o r g a n i c s o l v e n t s . B io c h i m .B i o p h y s .A c t a ., 1 9 8 1 , 6 5 7 :2 7 7 - 2 9 4 .汇 1 5 7 V a l d e z D , L e H u e r o u J Y , G i n d r e M , U r b a c h W, W a k s M . H y d r a t i o n a n d p r o t e i n f o l d i n g i n w a t e r a

589、n d i n re v e r s e m i c e l l e s : c o m p re s s i b i l i t y a n d v o l u m e c h a n g e s . B i o p h y s .J . , 2 0 0 1 , 8 0 : 2 7 5 1 - 2 7 6 0 .参考文献二 4 7 1 5 8 1 H a g e n A J , H a tt o n T A , Wa n g D C . P r o t e i n f o ld i n g i n re v e r s e m i c e l l e s . B i o t e c h n

590、o l . B i c e n g . , 1 9 9 0 , 3 5 : 9 5 5 一 6 0( 1 5 9 1 H a s h i m o t o Y , O n o T A , G o t o 喊 H a tt o n T A . p r o t e i n re f o l d i n g b y re v e r s e d m i c e l l e s u n t i l i z i n g s o l i d - l i q u i d e x t r a c t i o n t e c h n i q u e .B i o t e c h . B i o e n g , 1

591、 9 9 8 , 5 7 : 6 2 0 - 6 2 3 1 6 0 V in o g r a d o v A A , K u d r y a s h o v a E V , L e v a s h o v A V , V a n D o n g e n W M . S o l u b i l i z a t i o n a n d re f o l d i n g o f i n c l u s io n b o d y p r o t e i n s i n r e v e r s e m i c e l le s .A n a l B i o c h e m . , 2 0 0 3 ,

592、3 2 0 :2 3 4 - 2 3 8 1 6 1 1 L i M , S u Z G， J a n s o n J C . I n v i t r o p ro t e i n r e f o l d i n g b y c h r o m a t o g r a p h i c p r o c e d u re s , P r o t e i n E x p r e s s i o n a n d P u r i f i c a t i o n , 2 0 0 3 , 3 3 : 1 - 1 0 1 6 2 1 B a t a s B , C h a u d b u r i J B .

593、P r o te in r e f o l d i n g a t h i沙 c o n c e n t r a t io n u s in g s iz e - e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y . B i o t e c h n o l . B i o e n g , 1 9 9 6 , 5 0 : 1 6 - 2 3 . 1 6 3 1 B a t a s B , J o n e s H R , C h a u d b u r i J B . S t u d i e s o f t h e h y d r o d y n a m

594、i c v o l u m e c h a n g e s t h a t o c c u r d u r i n g r e f o l d i n g o f l y s o z y m e u s i n g s i z e - e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y . J C h r o m a t o g r . A , 1 9 9 7 , 7 6 6 : 1 0 9 - 1 1 9仁 1 6 4 了B a t a s B ,C h a u d h u r i J B . C o n s i d e r a t i o n s o

595、 f s a m p l e a p p l i c a t io n a n d e l u t io n d u r i n g s i z e - e x c l u s io n c h r o m a t o g r a p h y - b a s e d p r o t e i n r e f o l d i n g .J C h r o m a t o g r A , 1 9 9 9 , 8 6 4 :2 2 9 - 2 3 6 1 6 习 W e rn e r M H , C l o re G M , G ro n e n b o rn A M , K o n d o h A

596、, F i s h e r R J . R e f o l d i n g p r o t e in s 妙酬 fi l t r a t i o n c h ro m a t o g r a p h y . F E B S L e t t . 1 9 9 4 , 3 4 5 : 1 2 5 - 1 3 0 .汇 1 6 6 1 M u l le r C , R i n a s U . R e n a t u r a t i o n o f h e t e r o d i m e r i c p l a t e l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o

597、r f r o m i n c l u s i o n b o d i e s o f r e c o m b i n a n t E s c h e r i c h i a c o l i u s i n g s i z e - e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y . J C h r o m a t o g r . A , 1 9 9 9 , 8 5 5 : 2 0 3 - 2 1 3 1 6 7 1 F a h e y E M ., C h a u d h u r i J B , B in d in g P . R e f o ld

598、i n g a n d p u r if ic a t io n o f a u r o k in a s e p la s m in o g e n a c t i v a t o r f r a g m e n t b y c h r o m a t o g r a p h y . J C h r o m a t o g r . B , 2 0 0 0 , 7 3 7 :2 2 5 - 2 3 5 . 1 6 8 1 O n Z , S u Z， J a n s o n J C . U r e a g r a d i e n t s i z e - e x c l u s i o n c

599、h r o m a t o g r a p h y e n h a n c e d t h e y i e l d o f l y s o z y m e r e f o l d i n g . J C h r o m a t o g r A, 2 0 0 1 , 9 1 8 3 1 1 - 3 1 8 . 1 6 9 1 D o n g X , W a n g Y ,S h i J H , S u n Y . S iz e e x c lu s io n c h r o m a t o g r a p h y w it h a n a rt i f ic ia l c h a p e ro

600、n e s y s t e m e n h a n c e d l y s o z y m e re n a t u r a t i o n . E n z y m e M i c r o b . T e c L , 2 0 0 2 , 3 0 :7 9 2 - 7 9 7 1 7 0 1 S m i t h D C , H i d e r R C . T h i o l e x c h a n g e c a t a ly s e d r e f o l d i n g o f s m a l l p r o t e i n s u t i l i z i n g s o l id - p

601、h a s e s u p p o r t s . B i o p h y s . c h e m ., 1 9 8 8 , 3 1 :2 1 - 2 8 . 1 7 1 C re ig h t o n T E . F o l d i n g o f p r o t e i n s a d s o r b e d r e v e r s i b l y t o i o n - e x c h a n g e r e s i n s . P r o t e i n S t r u c t F o l d , D e s . , 1 9 8 6 , 2 4 9 - 2 5 7仁 1 7 2 1 C

602、 re i g h t o n T E . A p r o c e s s f o r p r o d u c t i o n o f a p r o t e i n , W o r l d P a t e n t , 1 9 8 6 , W O 8 6 1 0 5 8 0 9汇 1 7 3 lC r e i g h t o n T E . P r o c e s s f o r t h e p r o d u c t i o n o f a p ro t e i n , U .S . P a t e n t , 1 9 9 0 , 4 9 7 7 2 4 8L 1 7 4 1 S u n n

603、 a r J , D y r J E , H a m s i k o v a E , N o v a k J , V o n k a V . P r o c e d u r e f o r r e f o l d i n g a n d p u r i fi c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n s fr o m E s c h e r i c h ia c o l i i n c l u s i o n b o d i e s u s i n g a s t r o n g a n i o n e x c h a n g e

604、r J .C h r o m a t o g r .B . 1 9 9 4 , 6 5 6 : 1 2 3 - 1 2 6 1 7 5 1 L i M , Z h a n g G , S u Z . D u a l g r a d i e n t iro n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y i m p ro v e d r e f o l d i n g y i e l d o f ly s o z y m e . J C h r o m a t o g r A . , 2 0 0 2 ,9 5 9 : 1 1 3 - 1 2 0(

605、1 7 6 1 L i M， S u Z . R e f o l d in g h u m a n l y s o z y m e p r o d u c e d a s a n in c lu s io n b o d y b y u r e a c o n c e n t r a t io n a n d 州 g r a d i e n t i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , C h ro m a t o g r a p h i a , 2 0 0 2 , 5 6 : 3 3 - 3 8 1 7 7 L i M, S u

606、Z . R e f o l d in g o f s u p e ro x i d e d i s m u t a s e b y i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , B i o t e c h n o l L e t t . , 2 0 0 2 ,2 4 :9 1 9 - 9 2 3 . 1 7 8 G ly n o u K , l o a n n o u P C , C h r i s t o p o u l o s T . O n e - s t e p p u r i f i c a t i o n a n d r

607、 e f o l d i n g o f r e c o m b i n a n t p h o t o p r o t e i n a e q u o r i n b y i m m o b i l i z e d m e t a l - i o n a ff n i t y c h ro m a t o g r a p h y , P ro t e i n E x p r . P u r i f ,1 48疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索 2 0 0 3 , 2 7 : 3 8 4 - 3 9 0 . 1 7 9 S h i Y , J i ang C , C h e n

608、Q , T a n g H . O n e - s t e p o n - c o l u m n a f f i n it y r e f o l d i n g p u r i fi c a t i o n a n d f u n c t i o n a l ana ly s i s o f r e c o m b i n a n t h u m a n V D A C 1 . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .C o m m u n . , 2 0 0 3 , 3 0 3 : 4 7 5 - 4 8 2 . 1 8 0 R e h m B H

609、A , Q i Q , B e e r m an n B B , H i n z H J , S t e i n b u c h e l A . M a t r i x - a s s i s t e d i n v i t r o r e f o l d i n g o f P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a c l a s s 1 1 p o l y h y d r o x y a l k a n o a t e s y n t h a s e f r o m i n c l u s i o n b o d i e s p r o d u c

610、 e d i n r e c o m b i n ant E s c h e r i c h i a c o l i . B i o c h e m . J . , 2 0 0 1 , 3 5 8 : 2 6 3 - 2 6 8 . 1 8 1 1 L e m e r c i e r G , B a k a l a r a N , S a n t a r e l l i X . O n - c o l u m n r e f o ld i n g o f an i n s o l u b l e h i s t i d i n e t a g r e c o m b i n a n t e x

611、 o p o l y p h o s p h a t a s e fr o m T r y p a n o s o m a b r u c e i o v e r e x p r e s s e d i n E s c h e r ic h i a c o l i . J C h r o m a t o g r . B , 2 0 0 3 , 7 8 6 : 3 0 5 - 3 0 9 . 1 8 2 X u J , Z h o u Q , M a Z , Y u J , H u a M , D i n g R . S t u d y o n c o n s t r u c t i o n o

612、 f H i s 6 - h u m an T N F (3 f u s i o n e x p r e s s i o n p l a s m i d an d s i n g l e - s t e p p u r i fi c a t i o n o f i t s p r o d u c t . P h a r m . B i o t e c h n o l 。 2 0 0 0 , 7 : 1 - 5 , 1 8 3 S t e m p f e r G , H o l l - N e u g e b a u e r B , R u d o l p h R . I m p ro v e

613、d r e f o l d i n g o f an i m m o b i l i z e d f u s io n p r o t e i n . N a t B i o t e c h n o l . , 1 9 9 6 , 1 4 : 3 2 9 - 3 3 4 1 8 4 1 B e r d i c h e v s k y Y , L a m e d R , F r e n k e l D , G o p h n a U , B a y e r E A , Y a r o n S , S h o h a m Y , B e n h a r I . M a t r ix - a s s

614、 i s t e d r e f o l d i n g o f s i n g l e - c h a i n F v - c e l l u lo s e b i n d i n g d o m a i n f u s i o n p r o t e i n s . P r o t e i n E x p r e s . P u r i f , 1 9 9 9 , 1 7 :2 4 9 - 2 5 9 1 8 5 L in g M , X u X , S h i F , Z h u Y , L o n g N . R e f o ld i n g o f r e c o m b in an

615、 t h u m a n in t e r l e u k in - 2 b y r e v e r s e p h a s e h i g h p e r f o r m a n c e l iq u i d c h r o m a t o g r a p h y . C h i n . J : B i o t e c h n o l ， 1 9 9 7 , 1 3 : 1 8 0 - 1 8 3 1 8 6 1 A l t a m i r ano M M , G a r c i a C , P o s s ani L D , F e r s h t A R . O x i d a t iv

616、 e r e f o l d i n g c h r o m a t o g r a p h y : f o l d i n g o f t h e s c o r p i o n t o x i n C n S . N a t B i o t e c h n o l ., 1 9 9 9 , 1 7 : 1 8 7 - 1 9 1 1 8 7 1 A lt a m i r a n o M M , W o o l f s o n A , D o n d a A , S h a m s h i e v A , B r i s e n o - R o a L , F o s t e r N W,

617、V e p r i n t s e v D B , D e L i b e r o G , F e r s h t A R , M i l s t e i n C . L ig a n d - i n d e p e n d e n t a s s e m b l y o f r e c o m b i n a n t h u m an C D I b y u s i n g o x i d a t i v e r e f o l d i n g c h ro m a t o g r a p h y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S .

618、 A ., 2 0 0 1 ,9 8 : 3 2 8 8 3 2 9 3 . 1 8 8 M a n n e n T , Y a m a g u c h i S , H o n d a J , S u g i m o t o S ,N a g a m u n e T . E x p an d e d - b e d p ro t e i n r e f o l d in g u s i n g a s o l i d - p h a s e a rt i f i c i a l c h 叩e ro n e . J B io s c i . B i o e n g 夕0 0 1 ,9 1 :4

619、0 3 - 4 0 8 1 8 9 Y o s h i m o t o M. , K u b o i R . , Y an g Q . , M i g a k a J . I m m o b i l i z e d l i p o s o m e c h r o m a t o g r a p h y f o r s t u d i e s o f p r o t e i n - m e m b r a n e i n t e r a c t io n s a n d r e f o l d i n g o f d e n a t u r e d b o v i n e c a r b o n

620、 ic a n h y d r a s e . J C h r o m a t o g r B . B i o m e d . S c i . A p p l , 1 9 9 8 , 7 1 2 : 5 9 - 7 1 1 9 0 Q u e i r o z J A , T o m a z C T , C a b r a l J M. H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n s . J B i o t e c h n o l ., 2 0 0 1 , 8

621、7 : 1 4 3 - 5 9 1 9 1 1 E r ik s s o n K O , H y d r o p h o b i c in t e r a c t io n c h r o m a to g r a p h y , I n P r o t e i n p u ri f i c a t io n : P r in c ip le s , h ig h r e s o l u t i o n m e t h o d s , and a p p l ic a t i o n s ( 2 n d E d . ) . E d i t e d 妙J ans o n J C , R y d

622、e n L . J o h n Wi l e y an d S o n s , N e w y o r k , 1 9 9 8 , p p 2 8 4 - 3 0 9 . 1 9 2 P r iv a l o v P L , G i l l S J . S t a b i l i ty o f p r o t e i n s t r u c t u r e a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n . A d v . P r o t e i n C h e m. 1 9 8 8 . 3 9 : 1 9 1 - 2 3 4 1 9 3 1

623、 M u r p h y K P , P r iv a l o v P L , G i l l S J . C o m m o n f e a t u r e s o f p r o t e i n u n f o l d in g and d i s s o l u t i o n o f h y d r o p h o b i c c o m p o u n d s . S c i e n c e , 1 9 9 0 , 2 4 7 : 5 5 9 - 5 6 1 1 9 4 M a k h a t a f z e , G . I , P r iv a lo v , P .L . . E

624、n e r g e t i c s o f p r o t e i n s t r u c t u r e . A d v . P r o t e i n C h e m . , 1 9 9 5 4 7 : 3 0 7 - 3 2 5 1 9 习 D a n d l i k e r W B , A l o n s o 凡S a u s s u r e V A , K i e r s z e n b a u m F , L e v i n s o n S A , S c h a p i r o H C . T h e e f f e c t o f c h a o t r o p i c i o

625、 n s o n t h e d i s s o c i a t i o n o f a n t i g e n - a n t i b o d y c o m p l e x e s , B i o c h e m i s t r y , 1 9 6 7 ,参考文献1 4 9 6 : 1 4 6 0 - 1 4 6 7 1 9 6 V a n O s s C J , G o o d R J , C h a u d h u ry M K . N a t u re o f t h e a n t i g e n - a n t i b o d y i n t e r a c t i o n .

626、P r i m a r y a n d s e c o n d a ry b o n d s : o p t i m a l c o n d i t i o n s f o r a s s o c i a t i o n a n d d i s s o c i a t i o n . J . C h r o n m a t o g r . , 1 9 8 6 , 3 7 6 : 1 1 1 一1 9 .工 1 9 7 T a n f o r d C . T h e H y d ro p h o b i c E f f e c t : F o r m a t io n o f Mi c e l

627、le s a n d B i o l o g i c a l M e m b r a n e s . W i l e y Ne w Y o r k . 1 9 7 3 . 1 9 8 Z i m m e r m a n J M, E l i e z e r N , S i m h a R . T h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f a m i n o a c i d s e q u e n c e s i n p ro t e i n s 衍s t a t i s t i c a l m e t h o d s , J . T h e o r . B

628、 i o l ., 1 9 6 8 , 2 1 : 1 7 0 - 2 0 1 1 9 9 N o z a k i Y , T a n f o r d C . T h e s o l u b i l i t y o f a m i n o a c i d s a n d t w o g ly c i n e p e p t i d e s i n a q u e o u s e t h a n o l a n d d i o x a n e s o l u t i o n s .E s t a b l is h m e n t o f a h y d r o p h o b i c i t y

629、 s c a l e . J . B i o l . C h e m . , 1 9 7 1 , 2 4 6 : 2 2 1 1 - 2 21 7 2 0 0 J o n e s D D . A m i n o a c i d p r o p e rt i e s a n d s i d e - c h a in o r i e n t a t i o n i n p ro t e i n s : a c ro s s c o r r e l a t i o n a p p r a o c h . J T h e o r . B l o l ， 1 9 7 5 , 5 0 , 1 6 7 -

630、1 8 3f 2 0 l M a n a v a l a n P , P o n n u s w a m y P K . H y d r o p h o b i c c h a r a c t e r o f a m i n o a c i d r e s i d u e s i n g l o b u l a r p r o t e i n s . N a t u r e , 1 9 7 8 ,2 7 5 : 6 7 3 - 6 7 4仁 2 0 2 W e r t z D H , S c h e r a g a H A . I n fl u e n c e o f w a t e r o

631、n p r o t e i n s t r u c t u r e . A n a n a ly s i s o f t h e p r e f e r e n c e s o f a m i n o a c i d re s i d u e s f o r t h e i n s i d e o r o u t s i d e a n d f o r s p e c i f i c c o n f o r m a t i o n s i n a p ro t e i n m o l e c u l e . Ma c r o m o l e c u l e s , 1 9 7 8 , 1 1

632、:9 - 1 5口 0 3 C h o t h ia C . T h e n a t u r e o f t h e a c c e s s i b l e a n d b u r i e d s u r f a c e s i n p r o t e in s . J . M o l . B i o l . , 1 9 7 6 , 1 0 5 : 1 - 1 4 2 0 4 K r i g b a u m W R , K o m o r i y a A . L o c a l i n t e r a c t i o n s a s a s t r u c t u r e d e t e r

633、m i n a n t f o r p ro t e i n m o l e c u l e s : 1 1 . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 1 9 7 9 , 5 7 6 : 2 0 4 - 2 4 8 2 0 5 R o s e G D , G e s e l o w i t z A R , L e s s e r G J , L e e R H , Z e h fu s M H . H y d r o p h o b ic it y o f a m i n o a c i d r e s i d u e s i n g l o b

634、u l a r p r o t e i n s . S c ie n c e , 1 9 8 5 ,2 2 9 : 8 3 4 - 8 3 8 2 0 6 E i s e n b e r g D , M c L a c h l a n A D . S a l v a t i o n e n e r g y i n p r o t e in f o l d i n g a n d b i n d i n g . N a t u r e , 1 9 8 6 , 3 1 9 : 1 9 9 - 2 0 3 2 0 7 O c h o a 1 L . H y d ro p h o b i c ( i

635、n t e r a c t i o n ) c h r o m a t o g r a p h y . B io c h i m i e , 1 9 7 8 , 6 0 : 1 - 1 5 . 2 0 8 V o g e l H J , L i n d a h l , L , T h a l i n E . C a lc i u m - d e p e n d e n t h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f c a l m o d u l i n , t r o p o n i

636、n C a n d t h e i r p r o t e o ly t i c f r a g m e n t s . F E B S L e m , 1 9 8 3 , 1 5 7 : 2 4 1 - 2 4 6 2 0 9 L i n d a h l L , V o g e l H .J . M e t a l - i o n - d e p e n d e n t h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f a - l a c t a l b u m in s . A n a l

637、 . B i o c h e m . , 1 9 8 4 , 1 4 0 : 3 9 4 - 4 0 2 2 1 0 P o r a t h J , O l i n B I m m o b i l i z e d m e t a l i o n a f fi n i t y a d s o r p ti o n a n d i m m o b i l i z e d :p e t a l i o n a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f b i o m a t e r i a l s . S e n u n p r o t e i n a

638、 f f i n i t i e s f o r g e l - i m m o b i l i z e d i r o n a n d n i c k e l i o n s . B i o c h e m i s t r y , 1 9 8 3 , 2 2 : 1 故I 一 1 6 3 0 2 1 1 lA m e r s h a m p h a r m a c i a b i o t e c h . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y : P r i n c i p l e a n

639、 d me t h o d s . 1 9 9 3 2 1 2 T i s e l i u s A . A d s o r p t i o n s e p a r a t i o n b y s a l t i n g o u t . A r k . K e m i . M i n e r a l G e ro . , 1 9 4 8 , 2 6 B : 1 - 5 2 1 3 H j e rt e n S . S o m e g e n e r a l a s p e c t s o f h y d r o p h o b i c in t e r a c t i o n c h r o m

640、 a t o g r a p h y . J . C h r o m a t o g r . , 1 9 7 3 , 8 7 : 3 2 5 - 3 3 1口 1 4 Y o n R J . C h r o m a t o g r a p h y o f l i p o p h i l i c p ro t e i n s o n a b s o r b e n t s c o n t a in i n g m i x e d h y d r o p h o b i c a n d i o n i c g r o u p s . B i o c h e m . 1 , 1 9 7 2 , 1

641、2 6 :7 6 5 - 7 6 7 2 1 5 E r - e l 乙Z a i d e n z a i g Y , S h a lt i e l S . H y d r o c a r b o n - c o a t e d S e p h a r o s e s . U s e i n t h e p u r i f i c a t i o n o f g l y c o g e n p h o s p h o ry l a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 1 9 7 2 , 4 9 :3 8 3

642、 - 3 9 01 5 0疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索 2 1 6 Wi lc h e k M, M i r o n T . O n t h e m o d e o f a d s o r p t i o n o f p r o t e i n s t o h y d r o p h o b i c c o l u m n s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 9 7 6 , 7 2 : 1 0 8 - 1 1 3 2 1 7 H o f s t e e B H J . H y d r o p

643、 h o b ic a ff i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n s . A n a l . B i o c h e m . , 1 9 7 3 , 5 2 : 4 3 0 - 4 4 8 . 2 1 8 P o r a t h J . S u n d b e r g L , F o r n s t e d t N ， O l s s o n 1 . S a l t i n g o u t i n a m p h i l i c g e t s a s a n e w a p p ro a c h t o h y d

644、r o p h o b i c a d s o r p t i o n . N a t u r e , 1 9 7 3 , 2 4 5 :4 6 5 - 4 6 6 . 2 1 9 H j e r te rn S , R o s e n g r e n ， P a h l m a n S . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y . T h e s y n t h e s i s a n d t h e u s e o f s o m e a l 卿l a n d a ry l d e r

645、 i v a t i v e s o f a g a r o s e . 1 . C h r o m a t o g r . , 1 9 7 4 , 1 0 1 : 2 8 1 - 2 8 8 2 2 0 J a n s o n J C , L a a s T . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o n P h e n y l - a n d O c t y l - S e p h a r o s e C L - 4 B . I n : C h r o m a t o g r a p

646、 h y o f s y n t h e t i c a n d b i o l o g i c a l m a c ro m o l e c u l e s . E d i t e d b y R o g e r E , E l l i s H o r w o o d l t d . , C h i c h e s t e r , E n g l a n d , 9 7 8 . 2 2 1 3 M e l a n d e r W, H o rv a t h C . S a l t e ff e c t s o n h y d ro p h o b i c i n t e r a c t i

647、o n i n p r e c i p i t a t i o n a n d c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n s : a n i n t e 印 r o t a t i o n o f ly o t r o p i c s e r i e s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . , 1 9 7 7 . 1 8 3 :2 0 0 - 2 1 5 2 2 2 M e la n d e r 袱 C o r r a d i n i D , H o rv a t h C . S a l t

648、m e d i a t e d r e t e n t i o n o f p r o t e i n s i n h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y . A p p l ic a t io n o f s o lv o p h o h i c t h e o ry . J . C h r o m a t o g r . , 1 9 8 4 , 3 1 7 : 6 7 - 8 5 2 2 3 S t a b y A , M o l l e r u p J . S o l u t e r

649、e t e n t i o n o f l y s o z y m e i n h y d r o p h o b i c p e r f u s i o n c h r o m a t o g r a p h y . J C h r o m a t o g r . A , 1 9 9 6 . 7 3 4 2 0 5 - 2 1 2 2 2 4 A r a k a w a T . T h e r m o d y n a m i c a n a ly s i s o f t h e e ff e c t o f c o n c e nt r a t e d s a l t s o n p r o

650、 t e i n i n t e r a c t i o n w i t h 抑d ro p h o b i c a n d p o l y s a c c h a r i d e c o l u m n s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . , 1 9 8 6 , 2 4 8 : 1 0 1 . 1 0 5 2 2 5 1 A r a k a w a T , T i m a s h e ff S N . M e c h a n i s m o f p r o t e i n s a lt i n g i n a n d s a l t i

651、 n g o u t b y d i v a l e n t c a t i o n s a l t s : b a l a n c e b e t w e e n h y d r a t i o n a n d s a l t b in d i n g . B i o c h e m i s t ry , 1 9 8 4 , 2 3 :5 9 1 2 - 5 9 2 3 2 2 6 1 R o e t t g e r B F , M y e r s , J .A . , L a d i s c h , M. R . , R e g n i e r , F . E . A d s o r p

652、ti o n p h e n o m e n a i n h y d ro p h o b i c i n t e r a c t i o n c h ro m a t o g r a p h y . B io t e e h n o l . P r o g . , 1 9 8 9 , 5 : 7 9 - 8 8 . 2 2 7 1 J - i s s e n H P . P r o t e i n b in d i n g 协t w o - d i m e n s i o n a l h y d r o p h o b i c b i n d i n g t h e la tt i c e

653、s : S o r p t i o n k i n e ti c s o f p h o s p h o ry l s e b o n i m m o b i l i z e d b u t y l re s id u e s . J . C o l t I n t e r f . S o l ., 1 9 8 6 , 1 1 1 : 5 7 0 - 5 8 6 2 2 8 O s c a r s s o n S . I n f l u e n c e o f s a l t s o n p r o t e i n i n t e r a c t i o n s a t i n t e r f

654、 a c e s o f a m p h i p h i l i c p o ly m e r s a n d a d s o r b e n t s . J . C h r o m a t o g r . 白， 1 9 9 5 ,6 6 6 : 2 1 - 3 1 2 2 9 G e n g戈 G u n L . , C h a n g J . S t u d y o f t h e r e t e n t i o n m e c h a n i s m o f p ro t e i n s i n h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c

655、h ro m a t o g r a p h y . J . C h ro m a t o g r . , 1 9 9 0 , 5 0 7 : 1 - 2 3 2 3 0 1 L i n F Y , C h e n W Y , R u a a n R C , H u a n g HM. M ic r o c a l o r i m e t r i c s tu d i e s o f t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n p ro t e i n s a n d h y d r o p h o b i c l i g a n d s i n h

656、 y d ro p h o b i c i n t e r a c t io n c h ro m a t o g r a p h y : e ff e c t s o f c h a i n l e n g t h , d e n s it y a n d t h e a m o u n t o f b o u n d p r o t e i n . J . C h r o m a t o g r . A .; 2 0 0 0 , 8 7 2 : 3 7 . 4 7 2 3 1 D o r s e y J G , D i l l K A . T h e m o le c u la r m e

657、 c h a n i s m o f r e t e n t io n i n re v e r s e - p h a s e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . C h e m . R e v . , 1 9 8 9 , 8 9 :3 3 1 - 3 4 6 . 2 3 2 1 T a n f o r d , C . H y d ro p h o b i c f r e e e n e r g y m i c e l l e f o r m a t i o n a n d t h e a s s o c i a t i o n o f p r

658、o t e i n s w i t h a m p h i p h i le s . J . M o l .B i o l. , 1 9 7 2 ,6 7 : 5 9 - 7 4口 3 3 1 L a s s T . 人 g a r d e r iv a ti v e s f o r c h r o m a to g r a p h y , e le ct r o p h o r e s is a n d g e l- b o u n d e n z y m e s . I V . B e a z y l a t e d d i b r o m o p r o p a n a l c r o

659、s s - l in k e d S e p h a ro s e a s a n a m p h o 曲i l ic g e l f o r h y d r o p h o b i c s a l t i n g - o u t c h ro m a t o g r a p h y o f e n zym e s w i t h s p e c i a l e m p h a s i s o n d e n a t u r i n g r i s k s . 3 . C h ro m a t o g r . , 1 9 7 5 , 1 1 1 : 3 7 3 - 3 8 7 2 3 4 Y

660、o n R J . R e c e n t d e v e l o p m e n t s in p ro t e i n c h ro m a t o g r a p h y i n v o l v i n g h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s . l n t . 3 . B i o c h e m. 1 9 7 8 . 9 : 3 7 3 - 3 7 9参考文献1 5 1 2 3 5 H o f s t e e B H J . N o n - i o n i c a d s o r p t i o n c h r o m a t o

661、 g r a p h y a n d a d s o r p t i v e i m m o b i l i z a t i o n o f p r o t e i n s . P u r e A p p l . C h e m . , 1 9 7 9 , 5 1 : 1 5 3 7 - 1 5 4 8 2 3 6 A l b e rt s s o n P A . P a r t i t i o n o f C e l l P a r t i c l e s a n d M a c ro m o l e c u l e s . A l m q v is t & Wi k s e l l , S

662、 t o c k h o l m , a n d Wi l e y - I n t e r s c i e n c e , N e w Y o r k . 2 n d e d . 1 9 7 1 . 2 3 7 L in g T G I , M a t t i a s s o n B . P o l y ( e t h y l e n e g l y c o l ) a n d p o l y ( v i n y l a l c o h o l ) s u b s t i t u t e d c a r b o h y d r a t e f o r m i l d h y d ro p h

663、o b i c c h ro m a t o g r a p h y . J c h r o m a t o g r ., 1 9 8 3 , 2 5 4 : 8 3 - 8 9汇 2 3 8 H u b e r t P , M a t h i s氏 D e l l a c h e r i e E . P o l y m e r l i g a n d s f o r m i l d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h ro m a t o g r a p h y : p r i n c i p l e s , a c h i e v

664、 e m e n t s a n d f u t u r e t r e n d s . J C h ro m a t o g r , 1 9 9 1 , 5 3 9 : 2 9 7 - 3 0 6f 2 3 9 A x e n R , P o r a t h ) ， E m b a c k S . C h e m i c a l c o u p l i n g o f p e p t i d e s a n d p r o t e i n s t o p o l y s a c c h a r i d e s 勿 m e a n s o f c y a n o g e n h a l i d

665、 e s . N a t u r e , 1 9 6 7 , 2 1 4 : 1 3 0 2 - 1 3 0 4 2 4 0 M a i s a n o F , B e l e w M , P o r a t h J . S y n t h e s i s o f n e w h y d ro p h o b i c a d s o r b e n t s b as e d o n h o m o l o g o u s s e r i e s o f u n c h a r g e d a l 勺I s u l p h i d e a g a r o s e d e r i v a t iv

666、 e s . J . C h r o m a t o g r . , 1 9 8 5 , 3 2 1 : 3 0 5 - 3 1 7 . 2 4 1 H j e r te n S , Y a o K , E r i k s s o n K O , J o h a n s s o n B . G r a d i e n t a n d i s o c r a t i c H i g h P e r f o r m a t so n H y d r o p h o b i c I n t e r a c t i o n C h ro m a t o g r a p 坤o f p r o t e i

667、 n s o n a g a ro s e c o l u m n s . J . C h r o m a t o g r . , 1 9 8 6 , 3 5 9 : 9 9 - 1 0 9 2 4 2 1 H j e rt e n S , Y a o K , L i u , Z Q , Y a n g D , Wi t B L . S i m p l e m e t h o d t o p r e p a r e n o n - c h a r g e d a m p h i p h i l i c a g a ro s e d e r iv a t i v e s , f o r i n

668、s t a n c e f o r h y d r o p h o b i c i n t e r a c ti o n c h r o m a t o g r a p h y . J . C h r o m a t o g r . , 1 9 8 6 , 3 5 4 :2 0 3 - 2 1 0 2 4 3 R o s e n g r e n J , P a h i m a n S , G l a d M , H j e r t e n S . H y d ro p h o b i c i n t e r a c ti o n c h r o m a t o g r a p h y o n

669、n o n - c h a r g e d S e p h a r o s e d e r i v a t i v e s . B i n d i n g o f a m o d e l p r o t e i n , r e l a t e d t o i o n i c s t r e n g t h , h y d ro p h o b i c i t y o f t h e s u b s t i t u t e , a n d d e g r e e o f s u b s t i t u t i o n ( d e t e r m i n e d b y N M R ) . B i

670、 o c h i m B i o p h y s . A c t a , 1 9 7 5 ,4 1 2 : 5 1 - 6 1 2 4 4 ) J e n n i s s e n H P . M u l ti v a l e n t i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y a s e x e m p l i f i e d b y t h e a d s o r p t i o n a n d d e s o r p t i o n o f s k e l e t a l m u s c le e n z y m e s o n h

671、y d ro p h o b i c a l k y l - l i g a n d s . J , c h r o m a t o g r , 1 9 7 8 , 1 5 9 :7 1 - 8 3 2 4 5 1 J o h a n s s o n B玩D r e v i n 1 . Q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f t h e l i g a n d i n p h e n y l - s e p h a r o s e F F w i t h p r o t o n n u c l e a r m a g n e

672、ti c r e s o n a n c e a n d d e r i v a t i v e u l t r a v i o l e t s p e c t ro s c o p y . J C h ro m a t o g r , 1 9 8 7 3 9 1 : 4 4 8 - 4 5 1 2 4 6 ) P h a r n t a c i a F i n e C h e m i c a l s , O c t y l S e p h a r o s e C L - 4 B a n d P h e n y l S e p h a r o s e C L - 4 B . 2 4 7 1 R

673、 i p p e l G , S z e p e s y L . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n s o n a n A l k y l - S u p e r o s e c o lu m n . J . C h r o m a t o g n 人 ， 1 9 9 4 , 6 6 4 : 2 7 - 3 2脚8 O s c a r s s o n S , K a r s n a s P . S a l t - p r o m o t e d a

674、d s o r p t io n o f p ro t e i n s o n t o a m p h i p h i l i c a g a r o s e - b a s e a d s o r b e n t s . 1 1 . E ff e c t s o f s a l t a n d s a lt c o n c e n t r a ti o n . J . C h r o m a t o g r . A . , 1 9 9 8 , 8 0 3 : 8 3 - 9 3 . 2 4 9 H j e rt e m S . H y d r o p h o b i c i n t e r

675、a c t i o n c h ro m a t o g r a p h y o f p ro t e i n s o n n e u t r a l a b s o t b a n t s . I n : M e t h o d s o f p ro t e i n s e p e r a t i o n ( V o l 2 ) . E d it e d 妙C a t s i m o p o o la s N , P l e n u m p u b l i s h i n g c o r p o r a t i o n Ne w Y o r k , 1 9 7 6 2 5 们 E l R a

676、 s s i Z . R e c e n t p ro g r e s s i n r e v e r s e d - p h a s e a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f c a r b o h y d r a t e s p e c ie s . J . C h r o m a t o g r . A ., 1 9 9 6 , 7 2 0 :9 3 - 1 1 8 2 5 1 V i s s e r J , S t r a t i n g M . S e p a

677、 r a t i o n o f l i p o a m i d e d e h y d ro g e n a s e is o e n z y m e s b y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . B i o c h i m B i o p h y s . A c t a , 1 9 7 5 , 3 8 4 : 6 9 - 8 0 2 5 2 H r k a l Z , R e j n k o v a J . H y d r o p h o b i c i n t e r a c ti o n c h r o m a t o g r

678、a p h y o f s e r u m p r o t e in s o n P h e n y l - S e p h a r o s e C L - 4 B . J . C h r o m a t o g n 1 9 8 2 , 2 4 2 : 3 8 5 - 3 8 8 2 5 3 M c N a i r R D , K e n n y A l P r o t e i n s o f t h e k i d n e y m i c r o v i l l a r m e m b r a n e . T h e a m p h i p a t h e t i c fr o m1 5 2

679、疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索 d i p e p t i d y l p e p t i d a s e I V . B i o c h e m . 1 . , 1 9 7 9 , 1 7 9 :2 7 9 - 3 9 5 2 5 4 C o m i n g s D E , Mi g u e l A G , L e s s e r H H . N u c l e a r p r o t e i n s . V l . F r a c t i o n a t i o n o f c h r o m o s o m a l n o n - h i s t o n e p r o

680、 t e i n s u s i n g h y d r o p h o b i c c h r o m m t o g r a p h y . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 1 9 7 9 , 5 6 3 : 2 5 3 - 2 6 0 . 2 5 5 1 K u e h n L , M e y e r H . , R e i n a u e r H . H y d r o p h o b i c i n t e r a c ti o n c h r o m a t o g r a p h y a s a t o o l i n i n

681、s u l i n r e c e p t o r s t u d y . P r o c . 2 n d . I n t l . I n s u l i n s y m p , 1 9 8 0 ,2 4 3 - 2 5 0 2 5 6 L e f o r t S , F e r r a r a P . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o r a p h y f o r t h e i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f b i o s y n t

682、 h e t i c h u m a n g r o w t h h o r m o n e f r o m c r u d e f e r m e n t a t i o n m i x t u r e s . J . C h r o m a t o g r . , 1 9 8 6 , 3 6 1 : 2 0 9 - 2 1 6 . 2 5 7 H j e rt e r n S . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n s , n e u c l e

683、i c a c i d s , V i r u s e s a n d c e l l s o n n o n - c h a r g e d a m p h i l i c g e l s , I n : m e t h o d s o f b i o c h e m i c a l a n a l y s i s . E d i t e d b y G l i c k D , J o h n Wi l e y a n d S o n s , I n c , 1 9 8 1 , p p 8 9 - 1 0 8 2 5 8 D i o g o M M , Q u e i r o z J A ,

684、 M o n t e i r o G A , P r a z e r e s D M F . S e p a r a t i o n a n d a n a l y s i s o f p l a s m i d d e n a t u r e d f o r m s u s i n g h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y . A n a l . B i o c h e m . , 1 9 9 9 , 2 7 5 : 1 2 2 - 1 2 4 2 5 9 D i o g o M M.

685、, Q u e i r o z J A . , M o n t e i r o G A， Ma r t i n s S A M, F e r re i r a , G N M, P r a z e re s D M F . P u r i f i c a t i o n o f a c y s t i c f i b r o s i s p l a s m i d v e c t o r f o r g e n e t h e r a p y u s i n g h y d r o p h o b i c i n t e r a c t io n c h r o m a t o g r a p

686、 h y . B i o t e c h n o l . B io e n g . , 2 0 0 0 , 6 8 : 5 7 6 - 5 8 3 . 2 6 0 G e n g X , C h a n g X . H i g h - p e r f o r m a n c e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t io n c h r o m a t o g r a p h y a s a t o o l f o r p r o t e i n r e f o l d i n g . J C h r o m a t o g r a p h y , 1 9

687、 9 2 , 5 9 9 : 1 8 5 - 1 9 4 2 6 1 白 泉， 孔宇， 张 养军， 耿 信笃一还原型 牛胰岛素 在疏水界面上的 折叠.西北大学学 报 自 然科 学报) , 2 0 0 0 , 3 0 ( 2 ) : 1 2 7 - 1 3 02 6 2 郭 立安疏水作用色谱法同 时 纯化及复性 基因 重组人干 扰素- a . 色 谱，2 0 0 1 , 1 9 ( 4 ) :3 0 1 - 3 0 3 2 6 3 刘 彤， 耿 信笃多功能蛋白 增活器的 研制及 性能 研究西北 大学学报， 1 9 9 9 ,2 9 ( 2 ) : 1 2 3 - 1 2 6 2 6 4 G e

688、n g X， B a i Q , Z h a n g Y , L i a X , Wi t D . R e f o l d i n g a n d p u r i f i c a t i o n o f i n t e r f e r o n - g a m m a i n i n d u s t ry b y h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y . J . B i o t e h c n o l . , 2 0 0 4 , 1 1 3 : 1 3 7 - 1 4 9 2 6 5 耿信笃

689、，白 泉. 用疏水作用层析复性并同时纯化蛋白质的机理及其应用. 中国科学( B辑)， 2 0 0 2 , 3 2 ( 5 ) : 4 6 0 - 4 7 1 2 6 6 C a l d w e l l K D , A x e n R . , P o r a t h J . U t i l i z a t i o n o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n f o r t h e f o r m a t i o n o f a n e n zym e r e a c t o r b e d . B i o t e c h n o l . B

690、 i o e n g . 1 9 7 5 , 1 7 : 6 1 3 - 6 1 6 . 2 6 7 S a n d b e r g M . , L u n d a l h P . , G r e ij e r E . , B e l e w M . . I m m o b i l i z a t i o n o f p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s o n a l k y l d e r i v a t i v e s o f a g a r o s e g e l b e a d s . B i o c h i m . B i o p h y

691、s . A c t a , 1 9 8 7 , 9 2 4 : 1 8 5 - 1 9 2 . 2 6 8 H a n s o n P . E . ; G e l l m a n S H . Me c h a n i s t i c c o m p a r i s o n o f a rt i f i c i a l - c h a p e r o n e - a s s i s t e d a n d u n a s s is t e d re f o l d i n g o f u r e a - d e n a t u r e d c a r b o n i c a n h y d r

692、a s e B . F o l d D e s . , 1 9 9 8 , 3 :4 5 7 - 4 6 8 2 6 9 1 L a n g K , S c h m i d F X . U s e o f a t ry p s i n - p u l s e m e t h o d t o s t u d y t h e r e f o l d i n g p a t h w a y o f r i b o n u c l e a s e . F u r . J . B io c h e m., 1 9 8 6 , 1 5 9 ,2 7 5 - 2 8 1 2 7 0 R o d e r H

693、, E l o v e G A , S h a s t ry M C R . E a r l y s t a g e s o f p r o t e i n f o l d i n g . I n . : m e c h a n i s m o f p r o t e i n f o l d i n g ( 2 n d E d ) . E d it e d b y P a i n R . H , O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s . O x f o r d ., 2 0 0 0 , p p 8 1 2 7 1 F u k u d a H , A

694、 r a i M, K u w a j i m a K . F o l d i n g o f g r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n a n d t h e c y c le 3 m u t a n t . B i o c h e m i s t ry , 2 0 0 0 , 3 9 : 1 2 0 2 5 - 1 2 0 3 2 2 7 2 E n g l a n d e r S W. P ro t e i n f o ld i n g i n t e r m e d i a t e s a n d p a t h w a y s s t

695、 u d i e s b y h y d r o g e n e x c h a n g e . A n n u . R e v . B io p h y s . B i o m o l . S t r u c t ., 2 0 0 0 ,2 9 21 3 - 2 3 8 2 7 3 R o b i n s o n C V . P r o t e i n f o l d i n g m o n i t o r e d b y m a s s s p e c t r o m e t r y . I n : m e c h a n i s m o f p r o t e i n参考文献1 5 3

696、f o l d i n g ( 2 n d E d ) . E d i t e d 勿P a i n R ,H , O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s . O x f o r d ., 2 0 0 0 ,p p 1 0 5 - 1 1 7 2 7 4 1 L i M, S u Z G . S e p a r a r io n a n d i n d e n t i f i c a t i o n o f d i f f e r e n t r e f o l d i n g c o m p o n e n t s . J . B io t e c

697、 h n o l . , 加0 3 , 1 帕: 1 1 9 - 1 2 7 2 7 5 W e n J , A r a k a w a T , P h i l o J S . S i z e - e x c l u s i o n c h ro m a t o g r a p h y w i t h o n - l i n e l i g h t - s c a tt e r in g , a b s o r b a n c e , a n d re f r a c ti v e in d e x d e t e c t o r s f o r s t u d y i n g p r o t

698、 e i n s a n d t h e i r i n t e r a c t i o n s . A n a l B i o c h e m， 1 9 9 6 , 2 4 0 : 1 5 5 - 1 6 6价 7 6 J e n s e n P K , H a n a t a A K , L e e C S , M o n i t o r i n g p r o t e i n r e f o l d i n g i n d u c e d 妙d i s u l f i d e f o r m a t i o n u s i n g c a p i l l a ry i s o e l e

699、 c t r i c f o c u s i n g e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t ry . A n a l . C h e m， 1 9 9 8 , 7 0 : 2 0 4 4 - 2 0 4 9 2 7 7 1 B la k e C C F , K o e n i g D F , M a i r G A , S a r m a R . C ry s t a l s t r u c t u r e o f l y s o z y m e b y X - r a y d i ff

700、r a c t i o n . N a t u r e , 1 9 6 5 , 2 0 6 : 7 5 7 - 7 6 1 2 7 8 1 R a b i n o v it c h A , Z a r i t s k y A , F i s h o v 1 , E i n a v M , H a n d a s H . B a c t e r i a l L y s i s妙 P h a g e - a T h e o r e c t i c a l Mo d e l . J , T h e o r . B io l , 1 9 9 9 , 2 0 1 :2 0 9 - 2 1 3 . 2 7

701、 9 1 T o r e s t e i n d o tt i r 1 , H a k a n s s o n L , H a l l g r e n R , O u d b j o m s s o n B , A r v i d s o n N G , V e n g e P . S e r u m L y s o z y m e : a p o t e n t ia l M a r k e r o f M o n o c y t e l m a c r o p h a g e A c t i v it y i n R h e u m a t o i d A rt h r i t i s .

702、 R h e u m a t o l o g y ( O x f o r d ) , 1 9 9 9 , 3 8 : 1 2 4 9 - 1 2 5 4 2 8 0 1 M i r a n k e r A , R o b i n s o n C V , R a d f o r d S E , A 川 i n R T , D o b s o n C M . 1 9 9 3 , D e t e c t i o n o f t r a n s ie n t p r o t e i n f o l d in g p o p u l a t i o n s b y m a s s s p e c t r

703、 o m e t ry . S c ie n c e , 2 6 2 : 8 9 6 - 8 9 9 2 8 1 1 O r s i n i G , G o l d b e r g M E . T h e r e n a t u r a t i o n o f r e d u c e d c h y m o t r y p s i n o g e n A in g u a n i d in e H C 1 . R e f o l d i n g v e r s u s a g g r e g a t i o n . J B i o l . C h e m ., 1 9 7 8 ,2 5 3 :

704、 3 4 5 3 - 3 4 5 8 . 2 8 2 ) S a x e n a V P , W e t l a u f e r D B . F o r m a t i o n o f t h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e i n p r o t e i n s . 1 . R a p i d n o n e n z y m i c r n a c t i v a t i o n o f r e d u c e d ly s o z y m e . B i o c h e m i s t r y , 1 9 7 0 , 9 :

705、5 0 1 5 - 5 0 2 3 2 8 3 lY o s h i i H , F u r u t a T , Y o n e h a r a叭I t o D , L i n k o Y , L i n k o P . R e f o l d in g o f d e n a t u r e d / r e d u c e d l y s o z y m e a t h i g h c o n c e n t r a t i o n w i t h d i l t r a t i o n . B io s c i . b i o t e c h n o l . b l o c h e m ,

706、 2 0 0 0 , 6 4 : 1 1 5 9 - 1 1 6 5 2 8 4 1 S h u g a r D . T h e m e a s u r e m e n t o f l y s o z y m e a c t i v i t y a n d t h e u l t r a - v i o l e t i n a c t i v a t i o n o f ly s o z y m e B i o c h e m B i o p h y s A c t a . 1 9 5 2 , 8 : 3 0 2 - 3 0 9 . 2 8 5 1 B r a d f o r d M M .

707、A r a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d f o r t h e q u a n t i t a t i o n o f m i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h e p r i n c i p l e o f p r o t e i n - d y e b i n d i n g . A n a l .B i o c h e m . , 1 9 7 6 , 7 2 : 2 4 8 - 2 5 4 . 2 8 6 1 马 永泽，

708、 硫酸 按在猪心乳 酸脱氢酶( H 4 ) 变性一 复 性中的作用. 生物化学与生 物物理 学 报, 1 9 9 1 , 2 3 ( 6 ) :4 7 5 - 4 8 0汇 2 8 7 ) I s a a c s A , L i n d e n t n a n n J . V i r u s i n t e r f e r e n c e . 1 . T h e i n t e r f e r o n . P r o c R S o c L o n d B B i o l S c i 1 9 5 7 , 1 4 7 : 2 5 8 - 2 6 7 2 8 8 1 P e s t k a S I

709、 n t e r f e r o n f r o m 1 9 8 1 t o 1 9 8 6 . M e t h o d s E n z y m o l ., 1 9 8 6 , 1 1 9 : 3 - 1 4 2 8 9 1 A d o l f G民K a ls n e r 1 , A h o r n H , M a u r e r F o g y I , C a n t e l l K . N a t u r a l h u m a n i n t e r f e r o n - a - 2 i s o - g l y c o s y l a t e d . B i o c h e m .

710、 J . , 1 9 9 1 , 2 7 6 : 5 1 1 - 5 1 8 2 9 0 1 K l a u s W , G s e l l B , L a b h a r d t 人M , W i p f B , S e n n H . T h e t h r e e - d i m e n s i o n a l h ig h r e s o l u t i o n s t r u c t u r e o f h u m a n i n t e r f e r o n a - 2 a d e t e r m i n e d 妙h e t e r o n u c i e a r N M R

711、S p e c t r o s c o p y i n s o l u t i o n . J , Mo t . B i o l . , 1 9 9 7 , 2 7 4 : 6 6 卜 6 7 5 2 9 1 G u n e r m a n J U . C y t o k i n e t h e r a p e u t i c s : L e s s o n s fr o m i n t e r f e r o n - a . P r o c , N a t l . A c a d . S c i . U S A . , 1 9 9 4 , 9 1 : 1 1 9 8 - 1 2 0 5 2

712、9 2 阎 玉 清 ， 巫 爱 珍 .人 干 扰 素a - 2 b 生 产 工 艺 的 研 究 . 生 物 工 程 学 报 . 1 9 9 6 , 1 2 ( 1 ) :2 3 - 2 7 . 2 9 3 )R u b i n s t e i n S , F a m i l l e tt i P C , P e s t k a S . C o n v e n i e n t a s s a y f o r i n t e r f e r o n s . 3 V i r o l . , 1 9 8 1 , 3 7 : 7 5 5 - 7 5 81 5 4噬 水 作 用 层 析 及 其 相 关 技

713、 术 辅 助 蛋 白 质 折 4 复 性 的 探 索 2 9 4 1 F e l i x AM , H e i m e r E P , L a m b ro s T J , S w i s t o k J , T a r n o w s k i S J , W a n g C T . A n a l y s i s o f d i f f e r e n t f o r m s o f r e c o m b i n a n t h u m a n l e u k o c 少 i n t e r f e r o n s a n d s y n t h e t i c f r a g m e n

714、 t s 勿 h i g h - p e r f o r m a n c e l iq u i d c h r o m a t o g r a p 勺. J . C h r o m a t o g r . , 1 9 8 5 , 3 2 7 : 3 5 9 - 3 6 8 2 9 5 1 Q u e i r o z J A , G a r c i a F A P , C a r b r a l J M S . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f C h r o m o b a c

715、 t e r i u m v i s c o s u m l i p a s e o n p o l y e t h y l e n e g l y c o l i m m o b i l i z e d o n s e p h a r o s e . J C h r o m g r . A , 1 9 9 6 , 7 3 4 : 2 1 3 - 2 1 9 2 9 6 K a z i r o Y . T h e r o l e o f g u a n o s i n e 5 - t r i p h o s p h a t e i n p o ly - p e p t i d e c h a

716、i n e n l o g a t i o n . B i o c h i m B io p h y s . A c t a , 1 9 7 8 , 5 0 5 : 9 5 - 1 2 7 2 9 7 A t k i n s B , G o tt l ie b T . F u s i d i c a c i d i n b o n e a n d j o i n t i n f e c t i o n s , I n J A n t i m i c r o b A g e n t s . , 1 9 9 9 , 1 2 ( s u p p l . 2 ) : 7 9 一 3 2 9 8 B o

717、 d l e y J 城 Z i e v e F J , L i n L , Z i e v e S T . F o r m a t i o n o f r i b o s o m e - G f a c t o r - G D P c o m p l e x i n t h e p re s e n c e o f f u s i d i c a c i d . B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n . , 1 9 6 9 , 3 7 : 4 3 7 - 4 4 3 2 9 9 N a g a e v 1 , B j o r k m a

718、n J , A n d e r s s o n D 1 , H u g h e s D . B i o l o g i c a l c o s t a n d c o m p e n s a t o r y e v o l u t i o n i n f u s id i c a c i d 一 r e s i s t a n t S t a p 妙l o e o e e u s a u r e u s . M o l . M i c ro b i o l ., 2 0 0 1 , 4 0 :4 3 3 - 4 3 9 3 0 0 S h i m o m u r A O , J o h n s

719、 o n F H , S a i g a Y . E x t r a c t i o n , p u r i f i c a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f a e q u o r i n , a b i o l u m i n e s c e n t p r o t e i n fr o m t h e l u m i n o u s h y d r o m e d u s a n , A e q u o r e a . J C e l l C o m p P h y s i o l . 1 9 6 2 , 5 9 : 2 2 3 - 2 3 9

720、3 0 1 R e i d B G . F ly n n G C . C h r o m o p h o r e F o r m a t i o n i n G r e e n F l u o r e s c e n t P r o t e i n . B i o c h e m is t r y , 1 9 9 7 , 3 6 : 6 7 8 6 - 6 7 9 1 3 0 2 W a r d W W, C o d y C W, H a r t R C , C o r m i e r M J . S p e c t r o p h o t o m e t r ic i d e n t it

721、y o f t h e t r a n s f e r c h r o m o p h o r e s i n R e n i l l a a n d A e q u o r e a g r e e n - fl u o r e s c e n t p r o t e i n s . P h o t o c h e m . P h o t o b io i ., 1 9 8 0 , 3 1 : 6 1 1 - 6 1 5 3 0 3 C u b i tt A B , H e i m凡A d a m s S 民B o y d A E , G r o s s L A , T s i e n R Y

722、 . U n d e r s t a n d i n g , i m p r o v i n g a n d u s i n g g r e e n fl u o r e s c e n t p r o t e i n s .T re n d s B i o c h e m S c i . , 1 9 9 5 , 2 0 :4 4 8 - 4 5 5 3 0 4 1 H e i m R , P r a s h e r D C , T s i e n R Y . Wa v e l e n g t h m u t a t i o n s a n d p o s tt r a n s l a t i

723、 o n a l a u t o x i d a t i o n o f g r e e n fl u o re s c e n t p r o t e i n . P r o c N a t l A c a d S c i U S A J9 9 4 , 9 1 : 1 2 5 0 1 - 1 2 5 0 4 3 0 5 Wa r d W W , B o k m a n S . H . R e v e r s i b l e d e n a t u r a t i o n o f A e q u o r e a g r e e n - fl u o re s c e n t p r o t e

724、 i n : p h y s i c a l s e p a r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t io n o f t h e r e n a t u r e d p r o t e i n . B i o c h e m i s t r y , 1 9 8 2 , 1 9 : 4 5 3 5 - 4 5 4 0 . 3 0 6 W a l d o G S , S t a n d i s h B M , B e re n d z e n J , T e r w i l l i g e r T C . R a p i d p r o t e i

725、 n - f o l d i n g a s s a y u s i n g g r e e n fl u o r e s c e n t p r o t e i n . N a t B i o t e c h n o t . , 1 9 9 9 , 1 7 : 6 9 1 - 6 9 5 3 0 7 1 B c k m a n S H , W a r d W W. R e n a t u r a t i o n o f A e q u o r e a g r e e n fl u o r e s c e n t p r o t e i n . B i o c h e m B i o p h

726、y s . R e s . C o mm u n ., 1 9 8 1 , 1 0 1 : 1 3 7 2 - 1 3 8 0 .附录 A图目录图1 . 1蛋白 质折叠复性及变性过程示意图 、， ， 二 ， ，. . . 3图1 .2不同类型蛋白质的折叠途径， ，.，二 二 . . 一”二， . . . . . . 6图1 . 3 月 甫 氨酸肚键的异构化. ， 一， 价 ， 一+ ， 二，. . . ， ，价7图1 .4蛋白 质折叠过程的几种模型 ， ， ，. . . - . . . 一. . . “ 一 ，. . . . . . . . . . . . . 8图 1 5蛋白质折叠的漏斗能图

727、理论示意图. . ， ， . 卜 .*. ， ， 一 ，.， 二 . ， ， .9图1 . 6 D n a K系统 ( H s p 7 0 ) 辅助的 蛋白 质 折叠机理 示 意图 ，. ， ， 二 ， . ， . ， 1 0图1 .7 G r o E L / G r o E S 系统( C h a p e r o n in ) 辅助的蛋白 质折叠机理示意图. . ， . 1 1图1 . 8优化的分子伴侣对蛋白质的解聚和重新折叠流程图 二 卜 二 ， ， ， ， . . 1 2图1 .9人工分子伴侣辅助蛋白质复性的机理. ， . . “ . . . ，. . . . . . . . . 2 4

728、图工 . 1 0 疏 水 作 用 原 理 示 意图. . . ，一 卜 . . . . 3 0图1 . 1 1基于表面张力差异的聚合物疏水性示意图. ， 二 ， ， 二， . .二 ， . 价. . . . . . . . 3 7图2 . 1天然溶菌酶在不同 疏水柱上的 洗脱色谱图. . -. - . ， 二， . . . . . . . . . . . . . . . . 5 4图2 .2甘油介导疏水作用层析复性蛋白 质过程的示意图 ， ， . . .5 5图2 . 3脉梯度体积对甘油介导的疏水作用层析复性溶菌酶效果的影响 . . 一5 6图2 .4 . 甘油不同添加方式对疏水作用层析复性溶

729、菌酶效果的影响 一， . . . . . . . . . . 5 7图2 .5不同甘油浓度下疏水作用层析复性溶菌酶凝胶过滤分析 :. ，. ， ， . 5 8图2 .6硫酸按浓度对甘油介导疏水作用层析复性溶菌酶的影响，. . . . 5 9图2 .7起始蛋白 浓度对甘油介导疏水作用层析复性溶菌酶的影响 - . . . - . . 5 9图2 .8上样量对甘油介导疏水作用层析复性溶菌酶效果的影响二 ，. . . ， ， 6 0图2 .9不同上样量对甘油介导疏水作用层析复性溶菌酶的洗脱图 谱 . ，二 ， . 6 1图2 . 1 0甘油对稀释复性和穿过疏水作用层析复性溶菌酶的影响， . r 二6

730、1图2 . 1 1溶菌酶在疏水柱上采用穿过以 及吸附一 洗脱模式的复性色谱图， . . . 6 3图2 . 1 2不同模式下疏水作用层析洗脱溶菌酶的复性动力学. . ， ， . ， . . . . 6 4图3 . 1 a - 2 b I F N三级结 构示 意图 . ，. .， . . . . . . 4 二 价 ， 一 “ . . 6 8图3 .2稀释复性蛋白终浓度对a - 2 b I F N聚集的影响 . . . . 一 ， . . . . . . . . . . . . . . 7 2图3 .3稀释复性a - 2 b I F N的反相色谱分析， .二 ， . 7 2图3 .4疏水作用介质

731、类型对辅助分批复性a - 2 b I F N效果的影响. . . . . ，. . . 7 4图3 . 5不同类型疏水柱对a - 2 b I F N复性可溶性蛋白 收率的影响。 ，一 ，. . . . . 7 5图3 .6 P o r o s E T ( a ) 和P o r o s P E ( b ) 穿过复 性a - 2 b I F N色 谱图 及反 相 色谱分 析. . . . . 7 6图3 .7 甘油介导P o r o s E T 疏水柱复性 a - 2 b I F N洗脱图 谱 ( a ) 及其反 相 色谱分 析 b )疏水作用层析及其相关技术辅助蛋白质折叠复性的探索 . . .

732、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 卜 . . - . . . . . . . . . ， 7 7图3 . 8 甘油介导P o r o s E T柱复性c c- 2 b I F N的荧光分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 9图3 .9 甘油介导P o r o s P E疏水柱复性c c - 2 b I F N的反相色谱分析. . . . . . . . . .

733、 . . . . . . . . . . . . 8 0图3 . 1 0 甘油介导P o r o s P E疏水柱复性a - 2 6 I F N的荧光分析，. . . . . . . . . . 8 1图4 . 1 E F - G三级结构图. . . . . . . ， ， 二 ， . ， ， ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4图4 .2不同添加剂下稀释复性E F - G的反相色谱分析. . . . . . . . . . . . . . . ， ， . ，. ， 二 8 9图4

734、 . 3 E F - G采用P E G疏水柱洗脱复性色谱图. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . 9 0图4 .4 脉脉冲洗脱固定化P E G疏水柱复性E F - G的反相色谱分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1图4 . 5不同洗脱方法对固定化P E G疏水柱复性E F - G蛋白收率的影响 ，. . . . . . . 9 2图4 . 6洗脱液中脉浓度对固定化P E G疏水柱复性E F - G效率的影响 ， . . . . . . . . 9 3图4 . 7不同疏

735、水柱采用脉脉冲洗脱复性E F - G谱图比较， ，. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 4图4 . 8不同疏水柱采用吸附后脉脉冲洗脱复性E F - G效果比较. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 5图4 . 9不同疏水柱穿过复性E F - G色谱图. ， . . ， ， . . . . . . . . . . . . . . ， . . . %图4 . 1 0穿过法和服脉冲洗脱法P E G疏水柱复性E F - G的凝胶过滤分析. 9 8图4 . 1 1不同疏水作用介质脉脉冲洗

736、脱复性E F - G的凝胶过滤色谱分析. . 9 9图5 . 1表面活性剂一E F - G复合物的凝胶过滤和反相色谱分析. . ， . ，1 0 5图5 .2 表面活性剂一蛋白 质复合物和可溶性E F - G荧光光谱. . . ， . ， . ，二 1 0 6图5 .3表面活性剂一 蛋白 质复合物和可溶性E F - G的圆二色光谱 . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 6图5 .4表面活性剂种类对E F - G捕捉过程的影响. . . . . . ， . . . . . . . . . . . . 11- 0 7图5 . 5表面活性剂浓度对E F - G捕捉动

737、力学过程的影响. . . . . . ， . . . . 1 0 8图5 .6 蛋白 浓度和操作方式对T ri t o n X - 1 0 0 捕捉E F - G效果的影响. . . . . . . . . . . . . . . 1 0 9图5 .7表面活性剂捕 捉的E F - G在固 定 化聚合p - C D上的 复 性色谱图. . . . . . . . . . . . I I I图5 .8 固 定 化聚 合P - C D 柱从复合物中 复 性E F - G的 反相色 谱( a ) 和 凝胶过 滤 分 析 ( b ) .，. . . . . . . . . . . . . . . . .

738、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 2图5 .9复 合物在固 定化P - C D色谱柱上复性 得到的E F - G 光谱分 析 ，. ， . . . . . 1 1 2图5 . 1 0 . E F - G复 合 物在未 祸联柱( a ) 和P - C D祸联柱 ( b ) 上的 复性色 谱图. . . . 1 1 3图5 . 1 1 E F

739、 - G复合物在p - C D ( b ) , 联柱上复 性洗脱峰的凝胶过滤分析 . . . . . . . . . . . . 1 1 3图5 . 1 2 . E F - G在固定 化聚合P - C D柱上穿 过复 性色谱图. . . . ， . . . . . . . . . . . . . . 1 1 5图5 . 1 3固定化聚合p - C D穿过复性E F - G的 凝胶过滤分析色谱图. . . . . . . . . . . . . . 1 1 5图6 . 1 G F P的三级结构. . . . ， . . . . . ，. . . . . . . . . . . . . . . .

740、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . ， . . . . 1 1 8图6 .2 . G F P荧光发射团分子内形成机理 ， . . . . . . . . . . . . . . ，. ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 8图6 .3复性的可溶性G F P 凝胶过滤色谱图 . . . . . . ， . . . . . . . . ， . ， 二 . ， 1 2 4图6 .4蛋白浓度对G F P 包涵体蛋白质稀释复性效果的影响. . . . . . .

741、 . . . . . . . . . . . . . 1 2 5附录 A图6 . 5 G F P 包涵体蛋白质稀释复性的凝胶过滤分析色谱图. ，二 ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7图6 . 6 G F P包涵体蛋白质在固定化T r i t o n X - 1 0 0 柱上洗脱复性色谱图， ， 二 ， ， ， ， 二 ， 1 2 9图6 . 7固定化 T r i t o n X - 1 0 0 柱复性 G F P包涵体蛋白质的凝胶过滤分析 . . . . . . . . 1 2 9图6 . 8不同方法复性G F P 包涵体蛋白

742、质的荧光光谱. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 0图6 . 9经典人工分子伴侣和固定化人工分子伴侣对G F P分批稀释复性结果二 1 3 2附录 B附录B表格目录表 1 . 1可得到的商业化疏水吸附剂和疏水柱. .， . . . . . 二 .， . ， . . . . . . . . . . . 3 2表 1 .2几种盐的表面张力系数 . . . . . . . . . 二 ，. . ，. . ， 二 ， ， ， ， . . . . . . . . . . . . . . . .

743、. . . . . 3 4表2 . 1疏水作用介质类型对溶菌酶复性效果的影响 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3表3 . 1 (x - 2 b干扰素稀释复性和甘油介导疏水作用层析复性效果的比 较. . . . . . . . . 7 7表3 .2甘油对P o r o s E T疏水作用层析和稀释法复性( x - 2 b I F N的影响. . . . . . . . . . . . . . . . 7 8表4 . 1不同添加剂下稀释复性E F - G的结果比较 . . . _ . . . . . . .

744、 . ， 二 ， . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8表4 .2高盐吸附脉脉冲洗脱P E G疏水作用层析复性E F - G的结果二 . . . . . 9 0表4 .3不同疏水作用层析穿过复性E F - G效果的比较 . . . . . . . . . . ， 9 7表 5 . 1可溶性pC D及其聚合物从 E F - G复合物中 剥离表面活性剂能力的比 较 ， . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .， ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， ， ，

745、 . ， ， . . ， ， . ， 1 1 0表5 .2 不同色谱介质对T r i t o n X - 1 0 0 捕捉E F - G的复性效果的比较 . . . . . . . . . . . . . 1 1 1表5 .3 E F - G在不同色谱柱上穿过复性结果比较. . . . . . . . . . . . . . . ， ， . 1 1 4表6 . 1 变性可溶性G F P不同添加剂存在下复性结果比较 ， 二 ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 3表6 .2不同 层析方法复性G F P 包涵体蛋白 质的 结果比 较

746、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 8表6 . 3 不同 类型的疏水柱与 洗脱方式对G F P 复性效果的影响. . . . . . . . 1 3 0个人简历及发表文章目 录个人简历及发表文章目录学历1 9 8 8 .9 -1 9 9 2 .7 ， 江西中医学院， 药学专业， 理学学士1 9 9 7 . 9 - 2 0 0 0 . 7 ， 江西中医学院， 药物化学专业， 理学硕士 加0 0 . 9 一 至今，中 科院 过程工程研究 所， 化学工艺专业，工学博士工作经历 1 9 9 2 . 7 - 1

747、9 9 3 . 1 1 江中 制药厂，从事生化药 一 “ 蝴激酶”的工艺革新。 1 9 9 3 . 1 2 - 1 9 9 7 . 8北京江中 药研所， 开发r h G M - C S F 、 瑞替普酶等重组蛋白 质的 中试工艺，并参与新药报批。 2 0 0 3 . 8 - 2 0 0 4 .4瑞典乌普萨拉生物医学中 心、乌普萨拉大学表面生物技术系从 事合作研究，题目 是 “ 蛋白 质包涵体复性新方法的研究 ， 。发表文章目 录 t L i J J , L i u Y D , Wa n g F W, Ma G H , S u Z G . H y d r o p h o b i c i n t

748、e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y c o r r e c t l y r e f o ld i n g p r o t e i n s a s s i s t e d 勿 g l y c e r o l a n d u r e a g r a d i e n t s J C h r o m a t o g n A . 2 0 0 4 , 1 0 6 1 : 1 9 3 - 1 9 9 .f 2 L i J J , V e n k a t a r a m a n a M, Wa n g A Q , S a n y a l S , J a n

749、s o n J C , S u Z G . A m i l dh y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h yt o a g a r o s e m e d i a r e f o l d i n g r e c o m b i n a n ti n v o l v i n g p o l y e t h y l e n e g l y c o l im m o b il i z e dS t a p h y l o c o c c u sE l o n g a t i o n F a c t o r

750、 G P r o t e i n E x p r . P u r i f . ( A c c e p t e d ) 3 ) L i J J , V e n k a t a r a m a n a M, S a n y a l S , J a n s o n J C , S u Z G . A n o v e l a r t i f i c i a l c h a p e r o n es y s t e m u s i n g t h e c o m b i n a t i o n o f ami c e l l e a n d i m m o b i l i z e dp o l y m

751、e r c o u p l e d t o a g a r o s e g e l f o r c o r r e c t r e f o l d i n g o f r e c o m b i n a n t - c y c i o d e x t r i nS t a p h y l o c o c c u sa立 4 八 诬 L se l o n g a t i o n f a c t o r - G ( E F - G ) . F E B S L e t t . ( I n r e v i s i o n )f 4 L i J J , Wa n g AqB a li a g i A ,

752、 J a n s o n J C , S u Z G . A n o v e l h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o nu s ingi mmo b i l i z e dX - 1 0 0 m e d i a i n c o m b i n a t i o n w i t hpc y c l o d e x t r i n r e f o l d in g G r e e n F l u o r e s c e n tf r o m E . c o l i i n c l u s i o n b o d i e s . J疏水作用层析及其相关技

753、术辅助蛋白质折叠复性的探索 C h r o m a t o g r . A . ( I n R e v i s i o n ) . 5 1李京京，王芳薇， 刘永东，罗天乐， 苏 志国 . 甘油介导的疏水作用层析复性重组 人 a - 干 扰素第一届 全国 化学 工程与生 物 化工年 会论 文 ( 光盘 ). 加 。 6 L i u Y 1 ) , Wa n g F W, L i J J , S u Z G . R e f o l d i n g , p u r i fi c a t i o n a n d p a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n

754、 o f a n o v e l s y n t h e t i c i n t e r f e r o n - a l p h a s p e c i e s , c o n s e n s u s i n t e r f e r o n I S B B E ( I n t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m o n B i o p r o c e s s a n d B i o m o l e c u l a r E n g i n e e r i n g ) , S h a n g h a i , 2 0 0 3 7 罗天乐，丁虹，李京京， 苏志国

755、 反相色谱监测粒细胞细胞集落刺激因子的 稀释 法和离子交 换复性 过 程过 程学 报( 己 接收 )$ 赵荣志，刘永东， 王芳薇， 李京京， 夏新，苏志国. 疏水作用层析分离正确折叠 与 错 误折叠的 复 合干扰素生物工 程学 报( 己 接收 ).闭 苏志国， 李京京 一 种复 性 蛋白 质的 方法. 中国 专利 ， 申 请号0 2 1 5 6 5 1 3 .9 , 2 0 0 2 . l 0 刘永东，李京京，王芳薇，苏志国一种复合千扰素的纯化方法. 中国专利， 2 0 0 3 1 0 1 2 1 3 4 3 . 5 , 2 0 0 3致谢致谢 本论文是在导师苏志国 研究员悉心指导下完 成的，

756、 他为课题的设计和进展倾注了大量的心血。 苏老师的渊博学识、 严谨的治学态度和为人处事给了我巨大的启发和指导。 他在我学习期间给予的诸多帮助无以 回报， 我唯有勤奋工作才能不辜负他的 谆谆教诲和殷切的期望。 感 谢瑞典V I N N O V A机构的 资 助， 使我 有机会在瑞典U p p s a l a 大学 对论文的 部 分工作进行合作研究。 在此特别感谢J a n - C h r i s t e r J a n s o n教授在此期间给予的生活上的关心和工作上的支持，教授灵活的思路和高深的学问 给我留 下了 深刻印 象。 U p p s a l a大学 细胞与 分子生 物学系 助理教 授

757、S u p a r n a S a n y a l 博士和表面生 物技术系助 理教 授A n d r a s B a l l a g i 博士 分别为 论文 研究 提供了E F - G和G F F 菌种， 并对论文部 分 研究提出了 宝贵的 建议， 在 此深表 谢意。 另 外 对我 在饰p s a l a 大学合 作研究期间 所 有曾 给予我帮助的其它老师和学生表示深深的感谢。 感谢自 然科学基金委 ( 合同号2 0 1 3 6 0 2 0 ) 对本论文课题研究的资助。 感谢原人教处艾菩1现人教处郭立娟、岳仁亮老师给予的支持和帮助。 同学王芳薇、刘永东、罗天乐、周卫斌， 湖北大学实习生丁虹、 北京理工大学实习生张燕斌， 参与了本论文的部分实验， 在此表示感谢。 感谢同学李明、 谷振宇、 张贵峰、 路秀玲、负 强、 孟凡涛、 胡涛为论文工作提出了 积极的建议。 石红老师、 闭 静秀老师、王云山 老师、 查丽杭老师以 及同学孙海虹、 李秀男、 赵容志、 郑春阳、 王仁伟等在为论文工作提供了帮助，在此表示感谢。 在我学习期间许多人曾 经给予热心的帮助和鼓励， 我无法一一列举， 在此一并表示深深的谢意。 最后深深感谢我的亲人， 他们的支持和鼓励是我安心学习， 从事论文研究的坚实后盾。