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1、浓度I C 5 0 ，结果见表l 。同样，活性跟踪也显示活性部位H - 4 ，H - 5 ，H _ 6 ，H 7 。表l 海兔提取物各组分细胞毒活性筛选结果( I C 5 0 ，l lg m 1 )H 一0H - IH - 2H - 3H - 4a - 5H - 6H 一7H 一8H L 一6 0一一一9 65 4 61 8 64 3 51 2 5一P - 3 8 8一一一一6 6 42 3 45 2 81 9 4一注：“一0 无活性，I C 5 0 1 0 0 ug m 13 讨论与文献方法比较，作者对实验方法稍作了调整和改进。如根据菌种生长情况在8 1 4 天内可随时镜检使用，孢子液中加入
2、液体沙氏培养基控制在2 3 ，孢子生长时问延长至1 8 h 等，从而提高了本法的稳定性。：本模型机理尚不完全清楚。经大量实验初步认为，具有使稻瘟霉变形的化合物一般具有抗有丝分裂的作用，可抑制微管的聚合或解聚。作者首次将此模型应用于海洋天然活性组分的跟踪筛选，并与肿瘤细胞毒筛选的结果进行了比较，两者结果比较一致。本方法成本低廉，用样量少，相关性好海洋生物中活性成分的含量一般很低，一般在十万分之一，甚至百万分之一以下，对其活性成分的筛选应尽量深入，避免造成漏筛。本方法虽然阳性率稍高，但阴性率较低，不易造成漏筛。而且，本方法方便快捷，从加样到观察只需1 8 h ，是一理想的粗筛模型，在海洋抗有丝分裂
3、、抗真菌药物的跟踪筛选方面，无疑有着广阔的应用前景。( 参考文献略)海洋药物9 11 抗艾滋病毒作用的研究事规良耿美玉李桂玲管华诗李泽琳1( 青岛海洋大学药物所2 6 6 0 0 31 中国预防医学科学院病毒学研究所1 0 0 0 5 0 )自1 9 8 1 年发现首例A I D S 患者至今，全球患者及感染者估计已近4 0 0 0 万，且每天仍以1 6 万感染者的速度递增。中国自1 9 8 5 年发现首例A I D S 患者至今，患者及感染者估计已接近3 0 万A I D S 以H I v - 1 选择性攻击并破坏机体的C D + 4免疫细胞为主要特征j 导致全身免疫功能缺陷，最终引起各种机
4、会性感染及并2 1 8发症而死亡现有抗A I D S 药物主要有逆转录酶抑制荆和整合酶抑制剂，对H I V有较强抑制作用，但作用环节单一；易出现耐药性，毒副作用大，不能有效控制A I D S 的迅速蔓延。理想的抗A I D S 药物应该在有效抑制H I V 复制的同时对机体免疫功能具有保护作用，且毒副作用低。由于尚无较好的防治方法，据预测，未来几年将是A I D S 的高发期。因此研制开发高效低毒的抗A I D S 药物是一项十分必要而又迫切的任务。硫酸多糖类药物抗病毒作用的研究始于6 0 年代，它是有膜病毒强有力的抑制剂。1 9 8 7 年发现，多糖类药物具有抗H I V 的作用。其作用机制
5、与干扰病毒和细胞的吸附、阻止病毒进入细胞、抑制逆转录酶活性、抑制合胞体形成有关。由于该类药物药源丰富，毒副作用低，因此是当前抗A I D S药物研究的主攻方向之一，但来源于海洋植物的硫酸多糖类药物研究较少，国内外尚未见报道。9 1 1 是从海洋藻中提取分离并经分子修饰而成的硫酸多糖类药物，本文旨在研究其体内外对艾滋病毒的作用及其细胞毒性，为将其开发为一类新型抗A I D S 药物提供依据。l 实验材料i 1 药品与试剂9 1 1 ( 青岛海洋大学海洋药物与食品研究所提供，批号9 5 0 6 0 1 ，用时以R P M I l 6 4 0 营养液配成所需浓度，过滤除菌，4 冰箱保存备用) ；R
6、P M l l 6 4 0 ( G I B C O公司) ；胎牛血清( N B S ，天津市川页生物制品公司，批号9 6 0 6 0 6 ) ：P 2 4 核心抗原E L I S A 检测度试剂盒( V i r o n o s t i k aH I V lA n t i g e nM i c r o e l i s aS y s t e m ，美国O r g a n o n 公司) ；A Z T ( 叠氮脱氧胸苷，威一康公司，1 0 0 m g 粒) ；M T T ( 四甲基偶氮唑蓝，S i g m a 公司产品，以p H 7 2 P B S 配成0 2 5 冰箱避光保存备用) 1 2 实验仪
7、器酶标仪( B i n R a d 公司) ，C 0 2 培养箱( Q u e u e 公司) ；流式细胞仪( F A C S ，V a n t a g e ，暮国肋公司) 。1 3 实验动物中国恒河猴，健康，体重范围4 6 k g ，雌雄各半，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，一级动物。实验前经体检无异常，经血清学问接免疫荧光( I F A ) 抗体检查法检查排除潜在的猴免疫缺陷病毒( S I V ) ，猴逆转录D型病毒( S R V ) 和猴T 淋巴细胞性I 型病毒( S T L v _ I ) 的感染。合格证编号；9 8 1 0 5 ，用商品化膨化饲料饲养2 1 91 4 病
8、毒及细胞株S I V m a c 2 3 9 病毒株，美国A a r o nD i a m o n d 艾滋病研究中心M a r x 博士惠赠，静脉途径感染恒河猴，感染剂量为3 M I D l 0 0 。H I V - 1 , 人免疫缺陷病毒I 型，T C I D 5 0为1 0 6 5 ；M T 4 细胞；H I V - 1 急性感染人T 淋巴细胞体外传代株：鹕细胞：H I v - 1慢性感染人T 淋巴细胞体外传代株；均由中国预防医学科学院病毒所提供2 实验方法与结果2 19 11 体外对H I v - 1 复制的影响及其细胞毒性2 1 19 1 1 体外对t 啪1 4 细胞内I I v _
9、 l 复制( 急性感染) 的抑制作用。：一取体外传代对数期生长的M T 4 细胞，显微镜下计数，取5 0 0 万个细胞与1 0 0 0 0 T C I D5 0 H I V - I 于3 7 C 共同孵育9 0 m i n ，离心洗涤两次，调整细胞浓度为5 X 1 0 5 m l ，9 6 孔培养中每孔1 0 0 ul 与不同浓度的药物1 0 0 | ll 于3 7 C 、5 C 0 2 、饱和湿度条件下共同培养6 天，每浓度设三个复孔，同时设阴性及阳性( A Z T ) 对照孔，取培养上清1 0 0I Il 按照P 2 4 核心抗原M i c r o e l i s a 检测试剂盒方法测定P
10、 2 4 核心抗原量，以R e e da n dM u e n c h 法计算药物对病毒生长抑制率及半数有效浓度E C 5 0 。计算公式为：半数有效浓度( E C S O ) = l g - 1 1 9 D i ( z P i 一0 5 ) 其中D 为药物最大浓度值，i 为相邻剂量间比例的对数，P 为药物对病毒生长的抑制率，结果见表1 。表19 1 1 体外对H I V - I 急性感染M T 4 细胞的作用组别对照孔9 l l药物浓度( I lg m 1 )1 5 O9 05 43 2 41 9 41 0 n MP 2 4 抗原量( p g m 1 )2 6 4 7 6U 3 33 0 6
11、 94 8 4 02 0 5 1 32 6 5 0 00 0 0计算E C 5 0 为：E C 5 0 = I g - I 1 9 1 5 O - I g l O 6 X ( 2 8 8 5 0 5 ) = 4 4 4 ( 1 lg m 1 )2 1 29 1 1 体外对H 9 细胞内H I v 1 复制( 慢性感染) 的抑制作用2 加眺一讹渊苎；抛吣蝴槲一眠阻舭毖o片lt 取体外传代数期生长的H 9 细胞，显微镜下计数，取5 0 0 万个细胞与1 0 0 0 0 T C I D沅5 0 者H I V - I 于3 7 C 共同孵育9 0 m i n ，离心洗涤两次，调整细胞浓度为5 X 1
12、0 5 m l ，9 6 孔培养板中每孔1 0 0 pl 与不同浓度的药物1 0 0 I I1 共同培养，每浓度设三个复孔，同时设阴性及阳性( A Z T ) 对照孔，培养9 天，取培养上清液按照P 2 4 核心抗原M i c r o e l i s a 检测试剂盒方法测定P 2 4 岩核心抗原量，计算药物对病毒生长抑制率及半数有效浓度E C 5 0 。结果见表2 。表2组别对照孔9 1 19 1 1 对H9 细胞内H I V - I 复制( 慢性感染) 的抑制作用药物浓度( pg m 1 ) P 2 4 抗原量( p g m 1 )抑制率( )一1 4 2 5 0一2 O0 0 01 0 0
13、 0 01 06 3 89 5 5 20 51 6 8 28 8 2 00 2 59 9 6 33 0 0 80 1 2 51 3 8 2 6-2 9 80 50 0 01 0 0 0 0计算E C 5 0 为：E C 5 0 = I g 一1 1 9 2 O - 1 9 2 X ( 3 1 6 7 8 0 5 ) = O 3 2 ( pg m 1 )2 1 39 1 1 体外对M T 4 细胞的毒性实验取对数期生长的M T 4 细胞，调整细胞浓度为5 X1 0 5 m l ，9 6 孔培养板每孔1 0 0“l 与不同浓度药物1 0 01 1l 予3 7 X 3 、5 C 0 2 、饱和湿度条
14、件下共同培养4 天，同时设阴性对照孔。采用舭T 法测各孔吸光度，计算半数中毒浓度T C S O 、治疗指数T I 。T C 5 0 计算公式为：半数中毒浓度( T C 5 0 ) = 1 9 - 1 1 9 D - i ( P i 一0 5 ) 其中D 为药物最大浓度值，i 为相邻剂量间比例的对数，P 为药物对细胞生长的抑制率，P = ( 对照孔O D 5 7 0 一实验孔0 D 5 7 0 ) 对照孔0 D 5 7 0 。结果见表3 。表3编号Ol9 1 1 体外对M T 4 细胞的毒性药物浓度( m g m 1 ) 0 D 5 7 0抑制率( )01 1 0 601 5 6 3，0 9 0
15、 0 ，1 8 62 ，3 1 2 50 8 4 22 3 936 2 5 00 6 9 33 7 341 2 5 0 00 4 6 3 - 5 8 152 5 0 0 0t0 2 1 6 8 0 5对 , i f 4 细胞的半数中毒浓度( T C S O ) 为：T C 5 0 = l g l 1 9 2 5 O - 1 9 2 ( 2 1 8 4 0 5 ) = I g - 1 0 8 9 1 0 = 7 7 8 ( g m 1 )治疗指数为：T I = T C 5 0 E C 5 0 = 7 7 8 1 0 3 4 4 4 = 1 7 5 22 1 49 1 1 体外对H 9 细胞的毒性
16、实验取对数期生长的H 9 细胞，调整细胞浓度为5 1 0 5 l ，9 6 孔培养板每孔1 0 0 l a1 与不同药物1 0 0 pl 于3 7 C 、5 C 0 2 、饱和湿条条件下共同培养4 天，同时设阴性对照孔。采用M T T 法测各孔吸光度，计算半数中毒浓度T C S O 、治疗指数T I 。结果见表4 。表4编号0123459 1 1 体外对H 9 细胞的毒性药物浓度( m g m 1 )01 5 6 33 1 2 56 2 5 01 2 5 0 02 5 0 0 00 D 5 7 00 8 8 40 8 7 70 7 2 3O 5 1 50 2 0 0O 1 2 2抑制率( )0
17、。0 8、1 8 24 1 77 7 48 6 2对H 9 细胞的半数中毒浓度为：T C 5 0 = I g - I 1 9 2 5 O - 1 9 2 X ( 2 2 4 3 - 0 5 ) - - - I g 一10 8 7 3 2 = 7 4 7 ( m g m 1 )治疗指数为：T I = T C 5 0 E C 5 0 = 7 4 7 1 0 3 o 3 1 5 = 2 3 7 1 42 29 1 1 体内对S I V 感染猴的影响2 2 I 试验方法取恒河猴1 6 只，雌雄各半，随机分为模型组，9 1 16 4 m g 只组、9 1 13 2 0 m g 只组及阳性药A Z T I
18、 O O m g 只组，静脉注射S I Y m a c 2 3 9 病毒l m l 只，除模型组外，其余各组均于感染病毒后3 0 m i n 服相应药物进行治疗，连续给药6 0 天，每日给2 2 2药一次。观察实验前后各组动物体重、营养状况、饮食、大小便等的变化情况；并收集感染S P 前和感染后第l ，2 ，3 ，4 ，6 周实验猴血浆或全血标本，果用敏感细胞株C E M X1 7 4 进特培养滴定，采用定量P C R ( Q c P C R ) 法进行病毒载量：的测定，采用I F A 法测定荧光抗体水平，采用流式细胞术测定外周血c D+4百分率及绝对数。2 2 2 试验结果2 2 2 1一般
19、情况观察：除感染病毒两周后各组实验猴体外全身淋巴结肿大外，所有动物一般情况良好，各组体重变化无明显差别，见图1 ( 略) 2 2 2 29 1 1 对S I V 感染猴血浆病毒滴度的影响；不同时间各组病毒海度及抑制率的变化见图2 、3 ( 略) 。感染对照组从感染后7 天开始所有动物血浆中分离到病毒，2 周左右病毒滴度达到高峰，以后病毒血症水平逐渐降低，8 周时仍存在低水平的病毒血症；而A Z T 治疗组l O 天方有病毒出现，且滴度低于对。照组：9 1 1 6 4 及9 1 1 3 2 0 m g 只两组动物的病毒血症水平与感染对照组相比均表现出了不同程度的抑制作用，主要表现在：在病毒感染后
20、7 天病毒血症出现时，两组动物病毒分离阳性率较感染对照组动物低，分别为2 4 、2 4 ；在病毒感染后2 周病毒血症达到高峰时，两组动物的病毒血症水平明显低于病毒感染对照组：病毒感染后3 、4 、6 周时，两组动物均有病毒分离阴性出现，病莓分离阳性率均低于病毒感染对照组动物相应的时间点表明9 1 1 及A Z T 均可显三葺降低血浆病毒滴度，抑制病毒增殖。2 2 2 3 病毒R N A 拷贝数测定：取不时间制备的感染S i X 猴血浆，采用Q c P C R 方法测定血浆中病毒P , N A 拷贝数，结果见图4 、5 ( 略) ，9 1 1 及A Z T 均可明显降低感染S I V 猴血浆中病
21、毒R N A 拷贝数，尤以3 2 0 m g 只效果最为明显2 2 2 4 血清抗体检查：1 4 、2 8 、4 2 天血浆标本用I F A 法测定荧光抗体水平，结果发现，9 1 1 6 4 、3 2 0 m g 只均可明显升高S I V 感染猴血浆病毒抗体含量( 图6 略)2 2 2 59 1 1 对S I V 感染猴血液C D + 4 淋巴细胞数影响：9 1 1 对S I V 感染猴血液中C D + 4 T 淋巴细胞数具有一定的维持作用，可以保护其免受病毒侵袭( 图7略)3 讨论本文研究发现9 1 1 体外科明显抑制H I V 一1 的复制，对猴体内S I V 的增殖也2 2 3具有明显抑
22、制作用，提示9 1 1 是一个较强的艾滋病毒增殖抑制剂。艾滋病的特点是H I V 选择性攻击患者的C D + 4 细胞，具有一定的宿主特异性，致使缺乏合适的艾滋病动物模型，为抗艾滋病药物的体内筛选造成了一定因难猴免疫缺陷病毒( S i r ) 具有与H I V 相同的生活周期，可选择性攻击猴C D + 4 细胞。恒河猴感染S I V 后出现与人艾滋病相似的发病过程和病理特征，是当前研究抗艾滋病药物的较理想的模型。本文选用S I V m a c 2 3 9 静脉注射感染恒河猴，从感染病毒后第7 天开始全部动物血浆中分离到病毒，2 周左右病毒滴度达到高峰，以后病毒血症水平逐渐降低，8 周时仍有一半
23、动物存在低水平的病毒血症；血浆病毒R N A 的测定结果同病毒滴定测定结果相一致，这符合S I V m a c 2 3 9 的感染，特征：9 1 l 于药后第二周开始可明显降低感染S I V 猴血浆病毒滴度，表明9 1 1对猴体内S I V 增殖具有明显抑制作用，血浆病毒R N A 测定结果也证明了这一点。C D + 4 T 淋巴细胞是艾滋病的选择性宿主细胞，病毒在C D + 4 细胞中的增殖导致C D + 4 T 淋巴细胞数量显著下降，这是艾滋病的一个显著特征，并作为诊断艾滋病及疾病好转的一个指标。C D + 4 T 淋巴细胞的降低导致患者免疫功能低下，易患各种并发症，艾滋病患者最后多死于各
24、种并发症。9 1 1 可明显保护感染S I V猴血浆C D + 4 T 淋巴细胞，也从另一方面显示其对猴体内S I V 增殖具有明显抑制作用，从而保护了C D + 4 T 淋巴细胞的破坏；同时C D + 4 T 淋巴细胞数的增加也可能是9 1 1 免疫增强作用的体现。，机体感染艾滋病毒之后血浆中病毒抗体显著增加，这是机体自身免疫保护作用的体现，并作为病毒感染早期的诊断指标。本文研究发现9 1 l 对感染S I V猴血液病毒抗体量具有明显升高作用，提示9 1 l 可明显增强感染S I V 猴免疫功能，这与前期的研究结果相一致。总之，9 1 1 体内外对艾滋病毒的增殖均具有明显抑制作用，作用机理可能于提高机体免疫功能有关，至于其它详细机理有特于进一步研究。( 参考文献略)
