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1、专家讲座2 0 0 5 年全国小儿社区获得性呼吸道感染专题研讨会专家讲座6 儿童C A P 病原学实验室诊断研究进展首都医科大学附属北京儿童医院( 1 0 0 0 4 5 )沈叙庄儿童C A P 瘸原学诊断的必要性社区获得性肺炎( c o m m u n i t y - - a c q u i r e dp n e u m o n i a ，C A P ) 是十分常见社区下呼吸道感染，多数研究认为在儿童C A P 病原学中，病毒非常重要。呼吸道合胞病毒( R S V ) ，流感病毒，副流感病毒和腺病毒。有报道人类偏肺病毒( H M P V ) 等是儿童肺炎的重要致病菌。新近冠状病毒变异株( S
2、 A R S 病毒) 、禽流感病毒在亚洲流行是C A P 新发病原。近年来，越来越多证据表明非典型病原体在儿科C A P 中起重要作用。肺炎链球菌、流感嗜血 菌、卡他莫拉菌是儿童C A P 的常见病原菌。一般认为，肺炎支原体在C A P 中占1 0 一3 0 ( 占该病原感染的1 0 ) ，感染多累及为支气管、上呼吸道，1 5 是亚临床状态。快速、准确、特异的病原学诊断不仅是确诊依据，也是合理选择抗生索基础目前在世界范围内，下呼吸道感染采样和病原检测技术尚无突破性进展，检测阳性率一般仅有5 0 左右。值得关注的是，目前病原检测方法统一化、规范化尚待解决，病原学检测方法种类、敏感性、特异性有待提
3、高。检测方法的落后，制约着疾病负担的流行病学调查，阻碍有效预防措施的实行，也是感染性疾病的诊断和治疗发展的瓶颈。美国胸科学会( A T S ) 2 0 0 1 年指南认为大多数门诊儿童C A P 病原学诊断并不重要，。不需要常规作痰涂片和培养，但对于严重的、有合并症肺炎的住院病儿，进行血液、胸液和痰标本的检测是非常重要的。美国感染病学会2 0 0 0 年指南主张普遍进行病原学检测，称尽管阳性率低但多项目检测可提高至7 0 。2 0 0 3 年美国感染病学会改变观点，同意在门诊治疗的C A P 患者不作病原体检测是一种“标准方法”，但同时认为留取脓性痰标本涂片，空气干燥保存，在以后的临床处理中有
4、时可以发挥重要作用。C A P 病原学实验室诊断现状( 一) 下呼吸道感染标本采取C A P 的病原学诊断中关键是标本的采集困难，标本的采集包括非入侵性和侵入性方法。非入侵性方法；取痰液、咽、鼻分泌物等病原学检查，在正常情况下，儿童鼻咽部可以携带多数C A P 致病菌，这些标本不能真实反映肺部细菌感染，必要时，年长儿和青少年可采取痰标本，合格痰标本每个低倍视野应大于2 5 个白细胞，鳞状上皮细胞数小于2 5 个，痰的涂片革兰染色、培养可协助细菌病原的诊断。有人认为经气管负压抽吸分泌物方法可以相对避免鼻咽部病原污染，提高C A P 病原诊断的准确率。另有学者采用尿标本测定病原特异性抗原。入侵性方
5、法包括( 1 ) 血和胸水标本：C A P 常仅有短时的病毒血症或菌血症过程，m 培养分离细菌和病毒等诊断阳性率极低，因此门诊患儿不主张做血培养，只一2 4 2 0 0 5 年全国小儿社区获得性呼吸道感染专题研讨会专家讲座有住院严重肺炎考虑；( 2 ) 肺穿刺获取标本是目前C A P 病原学诊断的黄金标准，这种方法对操作人员技术要求高，在小儿不能很好的配合情况下，可出现较严重的合并症如气胸，肺出血等，患儿及家长不易接受；( 3 ) 经纤维支气管镜采取标本是近年来迅速发展一种诊疗技术，有报道纤维支气管灌洗液培养分离病原较以往的气管抽吸分泌物培养方法阳性率高，准确性更好。( 4 ) 血清标本特异性
6、抗原、抗体、抗原抗体复合物免疫学测定和病原特异性基因检测等是目前常用的C A P 病原学研究样本。( 二) 常用病原学检测方法儿童C A P 病原学诊断方法大致分为三种：( 1 ) 病原培养分离，( 2 ) 免疫学方法检测病原的特异性抗原和抗体，( 3 ) 应用聚合酶链反应技术对病原特异性基因片断进行检测。( 4 ) 感染的其他相关实验室检测，包括白细胞分类计数、C 反应蛋白、血沉等只能作为区别细菌、病毒感染的相对指标，但不能明确病原。病原培养是细菌学检测常用方法，在怀疑耐药菌感染或经验治疗不能覆盖的病原感染时，应做痰、经气管负压抽吸采取分泌物培养、涂片染色，所得结果可在一定程度上对临 床有指
7、导意义。鼻咽分泌物的病毒学检测有协助诊断意义；支原体和衣原体感染常规不推荐培养分离的诊断方法，因为技术要求高。免疫学检测病原中特异性抗原和抗体检测应用最多，常用的方法有补体结合试验、免疫荧光试验、酶免疫测定等，其中采用免疫荧光试验对鼻咽分泌物进行呼吸道七种常见病 毒快速抗原检测是目前C A P 病毒病原诊断较为经典方法。而鼻咽部标本的细菌抗原检测敏感性、特异性均较差，尚不推荐使用。免疫血清抗体测定可作为部分病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体感染的实验室证据，疾病早期特异性I g M 增高、I g G 滴度明显增高结合临床可作出诊断。面病人急性期、恢复期双份血清I g G 滴度四倍增高对C A P 早
8、期诊断无用，一般只提供回顾性诊断，是感染爆发流行病原学追踪较好的检测手段。应用聚合酶链反应及相关技术对病原特异性基因片断检测，对于许多生长周期长、培养条件高，或细胞内生存的病原如病毒、衣原体、支原体、军团菌、结核分支杆菌以及百日咳杆菌等是较实用的方法，目前各种特异性基因片段引物设计研究多数还在试验阶段，无成熟商品试剂盒，特异性有待提高，尚不能常规使用，但它们能提供可能的快速诊断，已经显示有临床价值。( 三) 几种常见病原的实验室检测：1 肺炎链球菌：肺炎链球菌是儿童C A P 的重要病原，在过去几十年中，人们在发展其病原检测技术方面做了大量工作，多是通过测定血和尿中细菌特异性抗原、抗体、免疫复
9、合物或采用 P C R 技术测定肺炎链球菌特异性基因片段。不久前，肺炎链球菌尿抗原检测方法已通过美困F D A 认证，有报道在侵袭性肺炎链球菌感染成人这方法敏感性6 0 9 0 ，特异性1 0 0 。G u t i e r r e z 等人使用N o w 快速免 疫层析膜肺炎链球菌尿抗原诊断试剂盒对4 5 2 例成人C A P 病例进行检测发现，2 7 例肺炎链球菌感染病人中1 9 例尿抗原呈阳性( 7 0 ) ，2 6 9 例无炎链球菌感染证实病人阳性率2 6 ，故认为说明一部漏诊病人可以得到诊断，另在1 5 6 例其它病原感染者中有1 6 例( 1 0 ) 病人尿抗原呈阳性，敏感性7 0
10、，特异性9 0 。意大利、西班牙学者报道采用免疫一2 5 专家讲座2 0 0 5 年全国小儿社区获得性呼吸遭感染专题研讨会色谱层析检测尿中肺炎链球菌抗原，此方法的敏感性7 7 7 ，特异性9 8 8 ，阳性预见值9 3 3 ，阴性预见值9 5 5 。也有研究表明采用N O W 肺炎链球菌尿抗原试剂盒( B i n a x )对成人C A P 尿标本检测，发现菌血症病人检测的敏感性达7 5 一8 5 ，非菌血症5 0 一8 0 。在慢性堵塞性肺疾病的病人带菌者和感染者均可出现尿抗原阳性，而且在肺炎链球菌感染后数周内持续存在。最近，芬兰和英国的报道对病人血清中肺炎链球菌抗原抗体复合物和血、唾液中的
11、抗细菌荚膜多糖抗体检测，对明确诊断很有帮助( 1 2 ) ，有学者认为此方法可能对于两岁以上儿童感染提供快速病原学诊断。有西班牙的报道采取巢式P C R 技术对1 0 2 例C A P 患者鼻咽拭子和血中编码肺炎链球菌的链球菌溶血素基因进行扩增、检测，并结合培养结果，发现敏感性为7 8 ，偶有假阴性，特异性9 3 ；最近，瑞士的报告用荧光定量P C R 测定血标本肺炎链球茵溶血素特异性基因片断，敏感性1 0 0 ，特异性为9 6 。目前对于肺炎链球菌感染病原学诊断除细菌培养外的任何一种实验室诊断方法都不足以作为诊断依据，在现阶段尚需采用多种方法检测并进行综合判断。2 肺炎支原体( M P )
12、：( 1 ) 血清学检测方法：冷凝集试验：冷凝集素是机体对肺炎支原体感染的第一个体液免疫反应，这种自身抗体在肺炎支原体感染6 周后降至原水平，冷凝集试验简单、快速，但敏感性、特异性较差，只在5 0 6 0 肺炎支原体感染病人增高，其它病原癔染冷凝集紊也可增高，如E B 病毒、肺炎克雷白杆菌、细胞巨化病毒感染；自身免疫性疾病、恶性淋巴细胞肿瘤等。补体结合试验( C Ft e s t ) ：已经应用1 0 余年，曾被认为是肺炎支原体感染免疫血清学标准方法，但敏感性、特异性较差，其抗原是氯仿一甲醇糖脂类粹取物，可与人类、细菌、植物抗原结构相似，可产生交叉反应，如在化脑时可有抗体增高。微颗粒凝集试验(
13、 M A G ) ：是一种优于补体结合试验的方法，基本原理是利用肺炎支原体特异性血细胞凝集作用，血细胞被乳胶颗粒代替，以避免非特异性反应。但补体结合试验和微颗粒凝集试验均不能区分抗体种类。特异性I g G 抗体增高较慢，在感染的第一周抗体不增高，病程的第五周达高峰，在感染后此抗体可持续长达四年。低水平的I g G抗体可能提示急性感染的早期阶段或是过去曾经感染。在这种情况下，应在间隔2 3 周 后再测血清抗体水平，观察是否有4 倍增高。只有在C F 试验( 1 ：8 0 ) 或M A G ( 1 ：1 6 0 ) 抗体明显高时，单一次抗体检测可作出诊断。血清特异性I g M 、I g A 、I
14、g G 测定：为了达到快速诊断的目的，分别测定血清特异性I g M 、I g A 、I g G 水平，对诊断有帮助。I g M 抗体出现在病程第一周，三周时达峰值，数周之 后下降至不可测的低水平。I g M 抗体在成人经常不产生，很可能是先前多次感染的结果，相反I g M 测定在儿童很有意义，是可靠的诊断指标。最近的研究显示，特异性I g A 提供一个较好的诊断准确性，这一抗体也在疾病早期产生。特异性I g A 抗体增高是老年人M P 急性感染的早期敏感指标。检测I g A 和I g M 多数基于酶联免疫吸附试验，各种检测试剂盒来自不同公司，一种快速I g M 检测卡( I m m u n o
15、C a r d M p M e r i d i a nC i n c u a t l i O H ，U S A ) 已商品有售。在考虑E l i s a 方法特异性时，主要是避免与其它支原体可能的交叉反应，M P 的P 1 蛋白( 1 6 9 K d a ) ，是M P 重要免疫源性决定簇，与生殖道支原体的一2 62 0 0 5 年全国小儿社区获得性呼吸道感染专题研讨会专家讲座M g P a 蛋白( 1 4 0 K d a ) 相似，两种蛋白是细胞吸附重要物质。为克服这一交叉，人们制备短 链合成肽而不是蛋白。免疫印迹技术：是最近几年发展起来用于M P 诊断，已有商品试剂盒( 德国V i r o
16、 t e c h ，R u s s e l s h e i m ) 。是目前较特异的检测抗M P 抗体技术，且敏感性高。( 2 ) 直接抗原检测和核苷酸杂交方法E l i s a 抗原试剂盒已商品有售( 瑞士，V i r i o n ，R u s c h l i k o n ) ，在没有P C R 仪器地方，是一个方便的呼吸道分泌物M P 检测方法。应用单克隆抗体对病原的直接染色技术是精确的，但敏感性差。特异性探针杂交技术是第一个分子生物学技术应用于M P 诊断，同E l i s a 抗原检测方法敏感性相似，基因探针快速诊断系统( 美国，G e n P r o b e ，圣地亚哥，C A ，) 是针对M P特异的r D N A 序列，碘”5 标记的D N A 探针，在P C R 技术以前这一方法被广泛应用，其敏感性有限，由于放射性标记，操作过程复杂，应用受限。( 3 ) 特异性核苷酸扩增技术P C R 基因扩增方法：1 9 8 9B e r n e t 等人首次应用P C R
