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1、叶酸偶联 5 氟尿嘧啶壳聚糖纳米粒的制备及其体外性质研究【摘要】 目的 研究叶酸偶联壳聚糖载 5 氟尿嘧啶纳米粒的制备方法及体外性质。方法 根据叶酸与壳聚糖的偶联比选择最佳工艺条件,通过叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应,制备叶酸偶联壳聚糖,再通过离子交联法制备叶酸偶联壳聚糖纳米粒包合 5 氟尿嘧啶,从而制成载药纳米粒。结果 制备了叶酸壳聚糖偶联物,并包合 5 氟尿嘧啶成纳米粒,载药量为 10.4%，包封率为 50.5%，8 h 累积释药量达 35.9%。结论 优化了叶酸偶联 5 氟尿嘧啶壳聚糖纳米粒的制备工艺。 【关键词】 叶酸;纳米粒;5 氟尿嘧啶;壳聚糖Abstract:Objective
2、To prepare folate conjugated 5 fluorouracil chitosan nanoparticles (5 FU CSNP folate) and evaluate its property in vitro. Methods The optimal technological conditions were selected according to the conjugated ratio of folate and chitosan. Folate conjugated chitosan was prepared by the reaction of th
3、e activated folate ester with the amine group of chitosan. Folate conjugated 5 fluorouracil chitosan nanoparticles were then prepared with ionic cross linking. Results Folate conjugated 5 fluorouracil loaded chitosan was prepared through different ways, and nanoparticles loading 5 FU was prepared. T
4、he encapsulation ratio of 5 FU CSNP folate was 50.5% and the drug loading was 10.4%. The total amount of accumulated release was 35.9% at the eighth hour. Conclusions The preparation condition of 5 FU CSNP folate was optimized.Key words:folate; nanoparticles; 5 fluorouracil; chitosan5 氟尿嘧啶(5 fluorou
5、racil，5 FU)属抗代谢类抗癌药,对消化道恶性肿瘤及其他实体瘤具有良好的治疗效果,但单独使用常产生胃肠道毒性及骨髓抑制等毒副作用,且对肝、肾功能均有损害。近年来，通过化学修饰或将 5 FU 包裹在不同载体材料中制成纳米球，以形成一种新型的药物控释体系来降低 5 FU 毒副作用的研究已成为研究热点。叶酸（Folate，F）受体靶向就是一种近来备受青睐的新型抗肿瘤机制，它是利用叶酸受体在某些肿瘤部位的过度表达而在正常组织低水平表达的特性而实现叶酸偶联药物的靶向输送。而偶联载体以大分子物质为主有利于延长体内保留时间，提高疗效。壳聚糖是一种价廉易得、便于修饰、无毒、生物相容性好,并兼有一定抗肿瘤
6、活性的生物大分子,广泛用于药物治疗载体。此外,近来被广泛应用到制药工艺中的纳米技术可进一步提高药物的稳定性，并实现缓释和控释给药。本课题选择壳聚糖(chitosan，CS)为抗肿瘤药物给药系统的载体材料，通过叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应,制得叶酸偶联的壳聚糖，并以5 FU 为抗肿瘤模型药物,通过离子交联法制得叶酸偶联的载 5 FU壳聚糖纳米粒。1 材料与仪器1.1 材料壳聚糖 (CS,山东奥康有限公司,脱乙酰度为 95.8%)，多聚磷酸钠(TPP,天津市福晨化学试剂)，SephadexG 25 葡聚糖凝胶(pharmacia)，5 氟尿嘧啶（5 FU，南通精华制药有限公司）,叶酸(上海新量化
7、工试剂有限公司), 无水二甲基亚砜(DMSO)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N 羟基琥珀酰亚胺(NHS)等试剂均为国产分析纯 。1.2 仪器SHZ 82 恒温震荡器（金坛市富华仪器有限公司），TU1700 紫外可见分光光度计（苏州岛津仪器有限公司），H 600 透射电镜（HITACHI），1000HSA 激光粒度分布仪（英国马尔文公司）。2 叶酸偶联壳聚糖(F CS)的制备和纯化2.1 叶酸活性酯的制备称取叶酸 300 mg(0.67 mmoL),溶于无水 DMSO 10 mL 中,再加入DCC 93 mg(0.45 mmoL)和 NHS 77 mg(0.67 mmoL)及三乙胺 500 L,
8、反应过夜,过滤除去反应副产物二环己基脲（DCU）,减压蒸馏除去部分溶剂,在搅拌中逐滴滴入冰冷的含 30%丙酮的无水乙醚溶液中,得到黄色沉淀物,过滤,真空干燥,得到叶酸活性酯1。2.2 叶酸偶联壳聚糖的制备称取 20 mg 壳聚糖（分子质量 5 kD）,悬浮于 5 mL 无水 DMSO中,磁力搅拌下逐滴滴入叶酸活性酯 DMSO 溶液 2 mL,在适当温度（50 ）下反应 2 h,过滤，滤渣用蒸馏水洗涤数次，用质量分数 2%醋酸溶液 10 mL 溶解,低速离心后取其上清液,用 SephadexG 25 葡聚糖凝胶柱进行分离,收集，冷冻干燥后备用。2.3 叶酸偶联壳聚糖的纯化231 叶酸偶联壳聚糖的
9、纯化 选用 SephadexG 25 葡聚糖凝胶柱进行分离,以质量分数 2%的醋酸溶液为流动相进行洗脱,流速为 1.5 mL/min，在叶酸波长为 363 nm 处监测洗脱过程，叶酸偶联壳聚糖的洗脱曲线见图 1。 由图 1 可见,第一个峰对应的是分子量大的叶酸偶联壳聚糖,第二个峰对应的是分子量较小的游离叶酸,表明 2 者通过凝胶柱的分子筛效应得到了完全的分离。2.3.2 叶酸偶联壳聚糖的紫外扫描 图 2 为纯化后的叶酸偶联壳聚糖及壳聚糖在醋酸水溶液的紫外扫描比较图。由图可见壳聚糖在240500 nm 范围内无紫外吸收,而纯化后的叶酸偶联壳聚糖在 280 nm 处显示了叶酸的特征吸收峰。结果表明
10、叶酸已成功与壳聚糖偶联。广东药学院学报，2008，24(6)第 6 期 何练芹,等.叶酸偶联 5 氟尿嘧啶壳聚糖纳米粒的制备及其体外性质研究2.3.3 叶酸偶联壳聚糖制备工艺优化2.3.3.1 叶酸标准曲线的制备 精密称取叶酸 11.5 mg,置 100 mL 容量瓶中,用醋酸 醋酸钠缓冲液(pH=5.8)溶解并稀释至刻度,分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于 10 mL 容量瓶中,用醋酸 醋酸钠缓冲液稀释至刻度,以醋酸 醋酸钠缓冲液为空白,用紫外分光光度计在363 nm 处测定吸光度,以叶酸质量浓度对吸光度作标准曲线,得回归方程 A=0.0142+0.0034(r=
11、0.999 8)，表明叶酸的质量浓度在5.7534.5 g/mL 范围内与峰面积呈良好线性关系。2332 偶联比的计算 精密称取少许纯化后叶酸偶联壳聚糖的冻干粉,溶解于 2%醋酸中,用 2%醋酸定容至 10 mL,然后在 363 nm 处测定紫外吸光度,计算每毫克叶酸偶联壳聚糖中叶酸的含量。偶联比=被偶联的叶酸的量（mg）被偶联的壳聚糖的量（mg）=M 叶酸N 叶酸 M 壳聚糖N 壳聚糖2333 正交试验 采用 L9（34）正交试验表，以偶联比为指标，考察叶酸 壳聚糖的质量比、反应时间、反应温度 3 个因素。因素水平表及试验结果见表 1-表 3。 表 1 因素水平表表 2 L9（34）正交设计
12、表表 3 方差分析表从上表可知,各因素对偶联比的影响程度为 ABC,反应的最佳工艺条件为 A3B3C1,即叶酸与壳聚糖用量比为 21,反应温度 50 ,反应时间 2 h。按最佳工艺制备叶酸偶联物,所得的叶酸偶联壳聚糖的偶联比为 0.160，即每个壳聚糖分子上大约偶联 18 个叶酸分子。根据文献报道3,在叶酸壳聚糖偶联物上平均一个壳聚糖分子上偶联 3 个叶酸分子已有较强的靶向性,所以笔者认为已达到实验目的。3 载 5 FU 的叶酸偶联壳聚糖纳米粒制备将适量的 5 FU 溶于 NaOH 溶液，往高速搅拌的叶酸偶联的壳聚糖醋酸溶液中逐滴滴加，调节 pH 至 5.0，然后往搅拌的溶液中滴加一定浓度的
13、TPP 溶液，搅拌 10 min，即得载药纳米粒。取一定量的5 FU 叶酸偶联壳聚糖纳米粒于吐温水溶液中超声分散后，在透射电镜下拍照（图 3、图 4）。结果表明所得纳米粒形态圆整，大小均一，粒径在 200 nm 以内，表面较光滑，基本为类球形的实体粒子，空白纳米粒粘连不严重，载药后粘连较严重。粒径分布情况见图 5。4 载药量、包封率和累计释放度的测定4.1 5 FU 标准曲线的制备精密称取 5 FU 20 mg，用 0.1 mol/L 盐酸溶液溶解并配成系列浓度，于 265 nm 波长处测定吸光度，以质量浓度（）对吸光度（A）作线性回归得标准曲线。标准曲线方程为：A=0.0527+0.0206
14、(r=0.999 9),表明 5 FU 的质量浓度在 20120 g/mL 范围内与吸光度呈良好的线性关系。4.2 载药量和包封率的测定将制备的载药纳米粒动态透析 72 h,期间换透析介质水 3 次，除去黏附未包裹的 5 FU,透析后冷冻干燥。精密称取纯化后叶酸偶联壳聚糖载药纳米球约 50 mg,置于 100 mL 烧瓶中,加 0.1 mol/L 盐酸溶液50 mL,60 水浴回流 3 h 使纳米球完全溶解,放冷,定容,过滤,取滤液 1 mL 稀释至 10 mL,于 265 nm 处测定吸光度。按标准曲线计算游离5 FU 的量，并计算包封率和载药量。结果测得包封率为 50.5%，载药量为 10
15、.4%。4.3 载药纳米粒体外释放的测定精密称取冻干后的载药纳米粒 60.0 mg，置预先处理好的透析袋中，加入 50 mL 磷酸缓冲液(PBS,pH7.4),扎紧透析袋两端,悬浮于100.0 mL 具塞锥形瓶中,锥形瓶中加入 45.0 mL 的磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)，将其置水浴振荡器中（温度 37 ，振荡频率为 100 次/min）。于不同时间点取透析袋外 PBS 5.0 mL，在 265 nm 处测定吸光度,同时补入 5.0 mL 等量的新鲜释放介质。根据标准曲线方程，计算其浓度和累积释放量，取 3 次实验的平均值,以累积释药百分率对时间作图,绘制载药纳米粒的释放曲线。5 FU
16、在各时间点的累积释放百分率(Q)计算公式为：Q()=(V0Ct+V t-1n=1C)100 m-1X-1，式中 Ct 为各时间点测得释放介质中的 5 FU 浓度(mgmL-1),m-1为投入的 5 FU 纳米粒的质量),V0 为释放介质的总体积,V 为每次取样体积,X-1 为测得 5 FU 纳米粒的载药量()。5 讨 论 51 针对壳聚糖水溶性差的特性，采用了先偶联叶酸，后制备纳米粒的方法，首次成功制备了叶酸偶联壳聚糖载药纳米粒，并进行了优化工艺的研究。壳聚糖易溶于稀酸溶液中,但在酸性条件下发生降解,所以选用弱酸型刺激性小的醋酸。利用无毒副作用的三聚磷酸钠（TPP）对叶酸偶联壳聚糖进行离子诱导凝胶化，可在一定条件下方便地制备出基于叶酸偶联壳聚糖的纳米给药载体。在室温、搅拌情况下，通过带负电的磷酸根离子与壳聚糖分子链上带正电的质子化氨基发生分子内和分子间交联凝胶化，便可迅速生成纳米粒子。为了获得高产率、稳定且坚固的纳米结构微粒，叶酸偶联壳聚糖与 TPP 的质量比一般控制在 31 到 61 之间。本文选择叶
