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1、分别以石油醚，四氯化碳，二氯甲烷和不同比例的甲醇水分配，得到活性部位为四氯化碳和二氯甲烷部分，四氯化碳部分经硅胶柱层析分成3 0 个流分，活性最高的3 个流分合并，经S e p h a d e x 柱层析和H P L c 制各，得到七个活性化合物I S 一3 I S 一9 和两个甾醇；岩藻甾醇( I S 1 ) 和麦角甾醇过氧化物( I S - 2 ) ( I S - 2 )为首次从本植物中得到。更进一步的研究工作，特别是对高活性部位的分离及所得化合物的结构和活性测定正在进行中。9 11 的测定及药后尿中原型物的检测夏威邓岗陈炜烨耿美玉管华诗( 青岛海洋大学海洋药物与食品研究所2 6 6 0
2、0 3 )9 1 1 是青岛海洋大学海洋药物与食品研究所从海藻中提取并经分子修饰得到的一种低分子量海洋硫酸多糖物质，药理的毒理学研究表明9 1 1 是高效、低毒、口服易吸收的新型抗艾滋病海洋药物，已批准进入临床研究。然而多糖类物质( 尤其是新合成或新发现的多糖) 的代谢研究却十分困难，这主要是因为多糖类物质分子量大，结构复杂，在体内分布广，含量低，分离、提取和纯化条件繁琐且特异性差，易发生多糖之问的相互干扰。目前药物代谢研究一般采用同位素标记法、色谱法、光谱法、生物活性测定法等。同位素标记法缺乏识别原型药物和降解产物的能力，不能准确反映体内原药浓度的变化情况，该法也不适合人体的药物代谢研究；色
3、谱法和光谱法应用范围较广，但进行多糖类药物代谢研究因体内含量低，提取分离困难而受到限制，生物活性测定法在多糖类物质的代谢研究中还未见报道。因此，任何一种新发现( 或合成)的多糖都必须通过大量的基础研究才能找到相应的方法进行代谢研究。9 1 1 的药代动力学是采用放射性同位素3 H 标记法进行的，但该法没有提供药物是原型代谢的直接证据。故本研究目的在于建立9 1 1 的测定方法，并于药后在尿液中检测原型药，以作为标记法药代研究的辅助。1 仪器与药品。1 1 仪器；7 2 2 型分光光度计( 上海第三分析仪器厂) ；D U 6 4 0 型核酸蛋白分析仪( 美国B a c k m a n 公司) ；
4、D L 一5 型离心机( 上海安亭科学仪器厂) ；T G L - 1 6 C 型泰山离心机1 6 7( 上海安亭科学仪器厂) ；B I O - R A D 电泳仪与制冷机( 美国B I o - 队D 公司) lD Y Y I I 一3 8 0 电泳槽( 北京仪器六厂) ；T I T A N I I I 型电泳膜( 美国H e l e n aL a b o r a t o r i e s公司) 。1 2 药品9 1 1 ( 青岛海洋大学海洋药物与食品研究所) ：氯化十六烷基吡啶( c e t y l p y r i d i n i u mc h l o r i d e ，C P C ，美国S i
5、 g m a 公司) ；二甲美兰( d i m e t h y m e t h y l e n eb l u e 。D M B ，德国S e r v a 公司) ：分析纯醋酸锌( 上海亨达精细化学品有限公司) ；分析纯醋酸钡( 上海泗联化工厂) ：硫酸软骨素( c h o n d r o n t i ns u l f a t e 一6 ，C S C ，美国S i g m a 公司) ；阿利辛兰( a l c i a mb l u e ，进口分装) ，实验用其它试剂均为市售分析纯试剂。2 实验方法2 1 分光光度法定量分格9 1 1取一定浓度9 1 l 标准品溶液1 0 0pl ，加入D M B
6、 显色剂( 每升显色剂中含有1 0 7 r a g 二甲美兰，5 5 m m o l L 甲酸，p H 3 3 ) 2 5 0 m l ，于D U 6 4 0 型核酸蛋白分析仪上扫描最大吸收波长。另分别配成2 5 ，5 ，l O ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 pg m l 的9 1 1使用液，取各浓度的使用液1 0 0 p 1 ，加入D M B 显色液2 5 0 m l ，以双蒸水做空白对照，于7 2 2 型分度计上，最大吸收波长处测定吸光值，计算回归方程于9 1 1标准品使用液2 0pg 功l 中，取6 次样品。依上法测定吸光值，计算变异系数。取2 0ug m l 的9 1 1 标
7、准品使用液于最大吸收波长处测定吸光值，每隔段时间测定一次，检验此方法的稳定性。2 2 大鼠药后尿液中原型物的检测2 2 1 动物给药与尿样收集取6 只大鼠于实验室中饲养五天后，一次性口服给药2 0 0 m g k g9 1 1 ，动物置代谢笼中，分别收集药前第一天和药后第一、二、三天尿样，其问不禁饮食。将收集的大鼠尿样测量体积后分别取0 3 m l ，置于- 2 0 冰箱中保存其余尿样按取样时间分别混合。2 2 2 分光光度法检测尿样中总硫酸多糖含量将每次取出的0 3 m l 尿样离, b ( 1 0 0 0 r m i n ，2 m i n ) ，各取1 0 0u1 ，加入2 5 0 m l
8、D M B 显色液，用分光光度计于5 2 5 n m 处检没，计算每天尿液中硫酸多糖的总量，超过检测限的样品稀释后重测。2 2 3 尿样中总硫酸多糖的提取将按时间收集的混合尿样3 0 0 0 r m i n 离1 6 8心l O m i n ，上清液中加入总体积2 的浓度为5 的氯化十六烷基吡啶水溶液，混合液于4 1 2 冰箱内放置过夜。离心后( 5 0 0 0 r m i n ，2 0 m i n ) 弃上清液，沉淀物用无水乙醇洗两次，每次均以离心法分离( 8 0 0 0 r m i n ，l O m i n ) 洗净的沉淀物于空气中干燥，将干燥沉淀物用0 2 m l2 m o l L 的氯
9、化锂溶液洗两次，每次均离心后( 8 0 0 0 r m i n ，l O m i n ) 合并上清液。上清液中加入无水乙醇至终浓度为9 5 ，4 1 2冰箱内放置4 8 h 后离心( 8 0 0 0 r m i n ，l O m i n ) ，倾去上清液，将沉淀物于空气中干燥，即为尿液中提取的总硫酸多糖。2 2 4 电泳法定性分析药后尿液中提取的9 1 1 取两个电泳槽分别加入0 1 m o l L 醋酸锌溶液( p H 6 0 ) 和1 O m o l L 醋酸钡溶液( p H 5 0 ) ，电泳槽分别记为I 、1 I ，将醋酸纤维膜于1 O m o l 几醋酸锌中浸泡3 0 r a i n
10、 ，滤纸吸干电泳膜表面的溶液，于距电泳膜下沿l c m 处加9 11 溶液，硫酸软骨素标准品溶液各3p1 ( I m g m 1 ) 。将载样电泳膜放入I 中，保持8 毫安恒电流电泳l O m i n 。取出电泳膜，于0 1 m o l L 醋酸钡溶液( p H 5 O ) 浸泡5 m i n ，放入中，保持1 3 毫安恒电流电泳l O m i n 。再取出电泳膜于含1 5 乙醇的0 1 m o l L 醋酸钡溶液中浸泡5 m i n ，在中电泳2 0 m i n 最后把电泳膜于含5 乙醇的0 1 m o l 几醋酸钡溶液中浸泡5 m i n ，在中电泳3 0 m i n 。取出后将电泳膜置于
11、0 5 的阿利辛兰水溶液中染色3 0 m i n ，1 的醋酸水溶液中脱色。将尿样提取的硫酸多糖分别溶于一定量含有痕量苯酚红的蒸馏水中，取3 “1 样品，如上述方法电泳( 以标准品9 1 1 ，C S C 作为标准) 。3 实验结果3 1 分光光度法定量分析9 ll 实验扫描最大吸收波长( 图I 略) 为5 2 5 n m ，测定标准曲线方程：A = O 0 0 2 0 4 5 C + 0 0 0 3 3 7 4 ，其中A 为吸光值，C 为上样浓度。结果表明9 1 1 标准品溶液在2 5 4 0 ug m 1 内线性良好r 2 - - - - O 9 9 6 ( 图2 略) 。变异系数为C V
12、 1 3 6 ，显色剂在1 h 内颜色稳定。3 2 分光光度法测定药后尿样中总硫酸多糖的含量实验测得尿液中总硫酸多糖的含量( 图3 略) 。结果表明与药前相比，药后第一天尿中总硫酸多糖量显著升高，大约升高至原来的四倍左右，第二、三天尿中总硫酸多糖量和药前第一天比较，无显著变化( P 0 0 1 ) 。3 3 电泳法定性分析药后尿液中提取的9 11 电泳法区分标准9 11 与硫酸软骨素，表明在此条件下可将9 1 1 与C S C 分开。将此法应用于尿液提取物( 图4 略) ，6 口定性分析尿中9 1 1 原型物，证明了9 1 1 在体内是原型代谢。4 讨论代谢研究是多糖类物质研究的制约的制约因素
13、之一，因大分子多糖难吸收以及肠胃道微生物的降解作用等因素，真正能进入血液并出现在尿液中的原型物般很少，如自木屑中提取的硫酸多聚戊糖口服后的尿液中仅能出现3 的原型物，每天内源性硫酸多糖代谢到尿液中的原型物也仅有1 0 左右9 1 1 是一种新型海洋硫酸多糖，虽然代谢研究发现口服后部分出现在尿液中( 未发表结果) ，但因采用氚标记方法，故无法确定其是否为原型代谢。本文在建立9 1 1 分光光度法测定方法的基础上，发现口服后尿液中的总硫酸多糖大幅提高，经过硫酸多糖的提取和电泳，检测到了尿液中的原型9 1 1 ，为药后9 1 1 的原型代谢提供确凿证据。( 参考文献略)海带中褐藻糖胶的组成分析李林罗
14、琼1 张声华2( 武汉市卫生防疫站4 3 0 0 2 21 湖北医科大学卫生学教研室；2 华中农业大学食品科学系)海带( L a m i n a r i aj a p o n i c aA r e s c h ) 中褐藻糖胶系1 9 1 3 年K y l i n 首次从褐藻掌状海带( L a m i n a r i ad i g i t a t a ) 中发现的一种细胞间多糖，特别在细胞壁外层占优势。此后，国内外学者对其提取、组成及生理功能也进行了研究但所用的实验材料多是褐藻糖胶粗制品，对其组成还不够明确，只知是含硫酸酯的杂多糖，影响了实验的精确性。本实验室从海带中提取纯化了褐藻糖胶，对其具体组成进行探讨，以便为进一步研究海带中褐藻糖胶及各类多糖的结构、生理功能及开发第三代保健食品提供依据。l 材料与方法1 1 材料与试剂褐藻糖胶由本实验室从福建省连江县产袋装干海带( L a m i n a r i aj a p o n i c aA r e s c h ) 中提取纯化，并经纯度鉴定。1 2 实验方法
