发酵液预处理与固液分离

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1、发酵液的预处理和固液分离方法综述发酵液的预处理和固液分离方法综述摘要：摘要：从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个重要步骤，就是预 处理和固液分离。其目的不仅在于分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒，还希望除 去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后续的各步操作。关键字：关键字：预处理 固液分离正文：正文：1 1、发酵液预处理发酵液预处理微生物发酵和细胞培养的目标产物主要有菌体、胞内产物和胞外产物三类 物质。从发酵液和细胞培养液中提取所需的生化物质，第一步就需进行预处理， 以便于固液分离，使代谢产物后续的分离纯化工序顺利进行。其原因有三个方 面：首先，发酵液多为悬浮液，粘度大，为非牛顿型流

2、体，不易过滤，而所需 的生化物质往往只有分布在液相，才能有效地提纯。并且，在有些发酵液中， 菌体自溶，核酸、蛋白质及其他有机粘性物质这三类物质会造成滤液混浊、滤 速极慢，必须设法增大悬浮物的颗粒直径，提高沉降速度，以利于过滤；其次， 目标产物在发酵液中的浓度通常较低；此外，发酵液的成分复杂，大量的菌丝 体、菌种代谢物和剩余培养基会对提取造成很大的影响。所以，对发酵液进行 适当的预处理，从而分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（如细胞碎片、核酸以及 蛋白质的沉淀物） ，并除去部分可溶性杂质和改变发酵液的过滤性能，是生化物 质分离纯化过程中必不可少的首要步骤。预处理方法要根据发酵产品、所用菌种和发酵液特性

3、来选择。大多数发酵产 品存于发酵液中，少数存于菌体中，而发酵液和菌体中都有产物存在的情形也 比较常见。如果目的产物是胞外产物，则通过离心或过滤实现固液分离，使其 转入液相；而对于胞内产物而言，收集细胞是预处理的首要一步。细胞经破碎 或整体细胞萃取使目的产物释放，转入液相，再进行细胞碎片的分离。如果所 需的产物为细胞，离心或过滤所得固相经干燥等过程就可得到菌体。图 11 为 生化产品分离纯化的一般步骤，图中虚线以上为预处理过程示意图。 图 11 生化产品分离纯化的一般步骤【1】1.1 预处理简述预处理简述 发酵液经过预处理，一些物理性质会改变，从悬浮液中分离固形物的速度 随之提高，过滤操作更易进

4、行；在预处理过程中，产物大多转移进入易于后处 理的相中（一般为液相） 。同时，发酵液中的部分杂质也得以去除。 发酵液的预处理过程一般包括以下几部分：（1）发酵液杂质的去除：包括除去蛋白质、无机离子以及色素、热原质、 毒性物质等有机物质。（2）改善培养液的处理性能：主要通过降低发酵液的粘度，调节适宜的 pH 值和温度1及絮凝与凝聚等操作来实现。预处理在生物技术产品的加工和提纯过程中相当重要。目的产物不同，采 用的预处理方法也不同。并且，由于具体发酵液的实际情况差别很大，预处理方法就更加灵活，多样，应根据生产需要进行选择和改进。发酵液预处理之后，再进行固液分离，进入后续的分离纯化工艺。1.21.2

5、 发酵液杂质的去除发酵液杂质的去除发酵液成分复杂，目的产品与许多溶解的和悬浮的杂质夹杂在一起。在这些杂质中对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白。在采用离子交换法提炼时，高价无机离子，尤其是 Ca2+ 、Mg2+ 、Fe3+的存在，会影响树脂对生化物质的交换容量。而杂蛋白，一方面，在采用离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时会降低吸附能力，另一方面，在采用有机溶剂或两水相萃取时，常有乳化现象，使两相分离不清。除此之外，在常规过滤或膜过滤时，杂蛋白还会使滤速下降，污染滤膜。因此，在预处理时，应尽量除去这些杂质。 【2】1.2.1 无机离子的去除无机离子的去除由于培养基或水中含有无机盐，发酵液中往往存

6、在许多无机离子，如Mg2+、Ca2+等，因而需要经常测定并除去无机离子。去除的方法比较固定，因此，在这方面的研究也比较少。1.2.2 可溶性蛋白质的去除及其生化机理可溶性蛋白质的去除及其生化机理在发酵液中除了上述高价无机离子外，还存在可溶性杂蛋白。一般来讲， 对于无机或有机酸、碱及其金属盐类，在特定条件下，通过溶媒转向、离子交 换等方法可使其与产物逐步分离。但对于可溶性杂蛋白，如果任其进入滤液， 将给以后各步的分离精制工作带来极大的不便。因此发酵液的预处理，从根本 上说，是如何使可溶性杂蛋白形成沉淀，以便随固形物一同除去的过程。在各 种方法中，变性沉淀最为常用。正确认识蛋白质的性质和变性理论很

7、重要，因 为它是发酵液预处理所依据的生化机理3。1.31.3 有色物质的去除有色物质的去除在发酵的过程中，培养基本身可能带入色素，如糖蜜、玉米浸出液等都带有颜色，使得发酵液的颜色加深；此外，微生物在代谢过程中，本身也可能产生有色物质。但是，从提高产物的质量的观点来看，又必须除去发酵液中有色物质【3】 。色素的化学结构比较复杂，性质多样，给脱色工作带来了相当大的麻烦。常用的脱色方法为吸附法，如活性炭吸附，树脂吸附等。吸附法可以不用或少用有机溶剂，操作简便，设备简单，生产过程中的 pH 值变化范围小。陈碧娥等人采用 K15 颗粒活性炭作脱色剂对 L乳酸发酵液进行脱色，脱色率达到97%，而乳酸钙的损

8、耗仅为 1%左右。常用于吸附的树脂又称为“脱色树脂” ，它表面积大，具有多孔性，吸附能力强等特点。在发酵工业中多用于脱色、吸附大分子的产物和除去蛋白质。近年来出现的大网格树脂孔隙大，树脂内表面积大，也可应用于脱色工艺。例如食品工业上的糖浆脱色时多用大网格树脂。此外，脱色工艺还可以利用某些离子交换树脂进行。例如，采用强碱性阴离子交换树脂，使果胶酶溶液脱色，酶活损失率不超过 15%20%。阴离子交换树脂对糖浆中的有色物质具有很强的吸附能力，可以用在谷氨酸发酵液的脱色中，树脂的最佳操作形式为磷酸盐式。用 DEAE纤维素从含酶溶剂中吸附有色物质，通常可同时除去非活性蛋白质，使主产物纯化 25 倍。另外

9、，现在的预处理工艺也采用工业酶制剂完成，如净化发酵产物、除去干扰性浑浊物。用淀粉酶将发酵液中残留的不溶性多糖转为单糖，可以提高过滤速度；用带电胶体如鱼胶添加到浑浊的饮料中以除去悬浮体等等。2.1.2.1.液处理性能的改善液处理性能的改善2.1.12.1.1 降低发酵液的粘度降低发酵液的粘度 根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，因此降低 液体粘度可以有效的提高过滤速率。降低液体粘度的常用方法有加热法和加水 稀释法两种。 升高发酵液的温度可以有效的降低液体粘度，提高过滤速率。同时，在合 适的温度和受热时间下，蛋白质会凝聚，形成大颗粒的凝聚物，发酵液的过滤 特性得到了进一步的改善

10、。但是，生物产品往往对温度敏感，因此，加热时必 须严格的控制加热温度和加热时间。首先，加热温度必须低于目的产物的变性 温度：其次，温度过高或时间过长，细胞溶解，会使胞外物质外溢，反而增加 了发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。例如，在 40时，12Be 麦芽汁的粘度为 1.210-3Pas，当温度升至 75时，粘度可下降一半，过滤 速率加倍。对于链霉素的发酵液，在 pH 值 3.0 的条件下，升温至 70后维持 半小时，可使液体粘度下降 1/6，过滤速率增大 10100 倍。 加水稀释法也是降低发酵液粘度的方法。但是，稀释后悬浮液的体积增大， 加大了后续过程的处理任务。针对过滤操作而言，

11、稀释后过滤速率提高的百分 比必须大于加水比，才能认为有效，即若加水一倍，稀释后液体粘度应下降一 半以上，过滤速率才能得到有效提高。 2.2.22.2.2 调节调节 pHpH 值值 调节 pH 值是发酵液预处理的常用方法之一。因为 pH 值直接影响发酵液中 某些物质的电离度和电荷性质，通过调节 pH 值可以改善其过滤特性。首先，对于氨基酸和蛋白质等两性物质而言，将 pH 值调至等电点，即可沉淀除去。其次， 在膜过滤时，发酵液中的大分子物质容易吸附于膜上，调节发酵液的 pH 值可改 变易吸附分子的电荷性质，减少膜的堵塞和污染。此外，在合适的 pH 值下，细 胞和细胞碎片及某些胶体物质会趋于絮凝状态

12、，形成较大的颗粒，有利于过滤 操作的进行。 除降低粘度和调节 pH 值外，还可采用絮凝操作改善发酵液的处理性能。由 于絮凝是一种重要而且常用的预处理方法。3.3.预处理总结与展望预处理总结与展望目前，预处理的研究，一方面是改进传统的处理方法；另一方面，在生化分离技术走向整合的大背景下，全发酵液的提取技术（将预处理与后续提取纯化操作相结合）倍受关注。由于发酵液的预处理是生化分离过程中首要的一步，因此，正确高效的预处理是得到目标产物的关键。越来越多的人已经认识到了预处理的重要性。随着对其研究的深入，预处理环节必将对提高产品质量和产率作出巨大贡献。2、固液分离技术固液分离技术1. 概述固液分离是生物

13、产品分离纯化过程中重要的单元操作。在生产中，培养基、发酵液、一些中间产品和半成品均须进行固液分离。其中，发酵液的种类多、成分复杂、粘度大，属于非牛顿型流体，因此，发酵液的固液分离最为困难。生物产品的生产中，固液分离的方法有分离筛、悬浮分离、重力沉降以及离心和过滤等。在这些方法中，用于发酵液固液分离的主要是离心和过滤操作。具体的固液分离方法和设备应根据发酵液的特性进行选择。对于丝状菌，如霉菌和放线菌，体形比较大，一般采用过滤的方法处理发酵液；而单细胞的细菌和酵母菌，其菌体大小一般在 110m，高速离心的效果比较好。但是，当固形物粒径较小时，通过预处理改善发酵液的特性，就可用过滤实现固液分离。例如

14、，在氨基酸的发酵液中，菌体很小，如果在预处理过程中进行絮凝，并添加助滤剂，就可使用板框过滤机分离菌体。由此看来，发酵液的预处理为固液分离及后处理作了准备工作。表【4】21 给出了主要的固液分离技术，并从原理、设备和优缺点四个方面进行了比较。表 21 主要的固液分离技术及其特点序号方法原理设备特点缺点1离心在离心产 生的重力 场作用下， 加快颗粒 的沉降速 度高速冷冻 离心机碟片式离心机管式离心机倾析式离心机框式离心机适用于粒径小、热稳 定差的物质回收，常 用于实验室适用于大规模工业应 用，可连续或批式操 作，操作稳定性较好， 易放大、推广批式操作、转速高， 固液分离效果较好、 含水低，易放大推

15、广连续操作，易放大， 易工业应用，操作稳 定实质为离心力作用下 的过滤。适用于大颗 粒固形物的回收，放 大容易，操作较简单、 稳定、适用于工业应 用产量小，连续操作 困难，大规模工业 应用差半连续或批式操作 时出渣、清洗复杂， 连续操作固形物含 水量高，总的分离 效率低 容量有限，拆装频 繁、处理量小、噪 声大对很小颗粒的固形 物回收困难，设备 投资高批式操作或半连续 操作，转速低，分 离效果较差，操作 繁重，离心的设备 投资高，操作成本 高2过滤依据过滤 介质的孔 隙大小进 行分离板框过滤机、 平板过滤机、 真空旋转过滤 机、管式过滤 器、蜂窝式过 滤器、深层过 滤器设备简单，操作容易，适用

16、大规模工业应用， 适用于大颗粒固体过 滤分离速度低，分离 效果受物料性质变 化的影响，劳动强 度大3膜分离依据被分 离分子和 膜孔大小 进行分离板框式、管式、 中空纤维式和 螺旋卷式等膜 过滤器。主要用于分离细胞。 操作简单，效果好， 可无菌操作，适用性 好，易放大膜易污染，分离效 果与操作技巧关系 密切，需要精心保 养、清洗，膜易污 染，分离效果与物料性质密切相关2.2. 过滤过滤过滤就是利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮物中的固体颗粒，从而实现固液分离的方法。微生物发酵液属于非牛顿型液体，在悬浮液中含有大量的菌体，细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基，这些固体颗粒均可通过过滤操作减少或除去。目前，在生化工业中，过滤的方法还是以传统的板框过滤或真空过滤等为主。随着膜分离技术的发展，过滤已超出了传统意义上固液分离的范畴。选择性和高效性使膜分离技术在生物产品的分离提取中蕴含着巨大的潜力。2.1 传统的过滤方法传统的过滤方法传统的过滤单元操作，据过滤机理的不同，可分为深层过滤和滤饼过滤两种。深层过滤所用的过滤介质为硅藻土、