《ABO血型全自动微板检测法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ABO血型全自动微板检测法（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、本站最近研究开发了 ABO 血型全自动微板检测法，并对 2857 名献血者进行 ABO 血型鉴定， 一 次判读准确率达到 99.83%。该法的应用大大地降低了实验者的工作强度，避免了人为 因素 导致的错判血型，确保了临床输血的安全。笔者着重对该方法的可靠性和干扰因素进 行研究 ，结果报告如下。1 1 材料和方法材料和方法1.11.1 材料材料 2857 份献血者血液标本（2.5mgEDTANa 2/ml 抗凝全血）；Genesis RSP- 100 型全自动样本处理 系统，SLT 自动扫描酶标仪及随机购置的支持软件 Soft2000(瑞士 TECAN 公司产品)；T.S 温控 孵育振荡仪（奥地
2、利 Anthos 公司）；KUBOTA Ks-5000 平板式 离心机（日本久保田公司）；9 6 孔硬质 U 型板（丹麦）；单克隆抗-A、抗-B 血清（长春 生物制品研究所）；5% 3 人份 以上混合试剂红细胞（自制）；A2亚型红细胞（Ortho 公 司产品），经盐水洗涤 2 次配成 5 %的盐水悬液。1.21.2 全自动微板检测法（简称微板法）全自动微板检测法（简称微板法） 用 96 孔 U 型微量反应板，通过全自 动加样 器 处理样本和试剂。正定型中，分别加入标准抗血清 30l 和 5%样本红细胞 30l，反定 型中， 分 别加入样本血浆 50l 和 5%标准红细胞 30l。经孵育、离心、
3、悬浮和静止， 再用自动酶标仪 取 620nm 波长对反应板进行扫描、判读，随后在电脑中进行正反定型结 果配对比较，确认无误 后，将最终正确结果经站电脑网络与相应献血者资料存放在一起。 经多次正交试验 检测和各参数指标间的对比试验，优化得出 ABO 正反定型检测最终试 验 条件为，孵育：3min，500r/min，2level；离心：400g，90s；悬浮：3min，900r/min，3 level；静止：正定型 12min，反定型 56min；判读：620nm 波长，40 点扫描，Tc15% 为凝 集反应，Tc10 为非凝集反应，10Tc15 为可疑，需手工法重新鉴定。依据 Soft20 00
4、 支持软件结构，微凝板经扫描后每孔都可获得一最小透光率（minimum transmission, Tn）和最大透光率(maximum transmission,Tm)，非凝集孔 Tm 与 Tn 的差 值 （contrast transmission,Tc）较小，凝集孔 Tc 值较大；当 Tc 值超过一特定值时，提 示细胞 凝集，结果判为阳性；反之，Tc 值较小时表明细胞不凝集，结果判为阴性。根据 ABO 正反定 型原则3，确定其血型。1.31.3 试管法，平板法试管法，平板法 见文献3方法。2 2 结果结果2.12.1 方法的可靠性方法的可靠性2.1.1 可重复性 取 8 份样本，连续进行
5、20 次反定型，每次得阳性 Tc 值 9 个，阴 性 Tc 值 7 个 ，分别算出它们的平均 Tc 值，然后对 20 份阳性和阴性的平均 Tc 值分别进行 数理统计，依次得 标准差(s)为 2.091、0.295 和变异系数(cv)为 2.91%、8.03%，均 10%，说明该试验 具有良好的可重复性。2.1.2 稳定性 取 48 份标本，连续进行 3 次正反定型，每次间隔 11 d,显示：正定 型凝集试验中均为 4+，无任何变化;而对反定型凝集试验中的 Tc 值按配对资料的两两比 较进行数理统计，无显著性差别、(t0.387，n=62，经查表，t0.05 =2.000,故 P0.05)。2.
6、1.3 准确率 通过 2857 份献血者样品的正反定型，得出正反定型 试验 1 次判读准 确率 为 99.83%，证明该试验方法完全可靠。异常结果主要出现在反定型中，其中 3 份样 本为严重 脂血，2 份为血型抗体极弱。2.1.4 敏感性 将单克隆-抗 A 血型试剂倍比稀释，每种稀释度加样 30 l，再分别 加 入 5%A 型和 A2亚型红细胞悬液 30l，按上述 3 种方法进行操作，分别测得其结果（表 1） 。 用 B 型血浆代替上述单克隆抗-A，加样量改为 50l，其余不变，分别测得其结果 （ 表 2）。 表 1 A 和 A2亚型红细胞在 3 种方法中测得单克隆抗-A 效价单抗 A 血型试
7、剂倍比稀释原液 12 14 18 116 1321641128 1256 1512效价A 58.5 67.6 77.2 80.582.676.760 . 226.717.65.8256微板法 A258.7 72.4 78.9 79.874.260.151.418.06.73.1128A4444432 128试管法 A2444331 64A4444321128平板法 A244 333164 表 2 分别用 A 和 A2亚型红细胞在 3 种方法中测 B 型血浆中抗-A 效价B 型血浆倍比稀释原液1214181161321641128效价A75.771.461.537.517.515.47.35.5
8、32微板法 A271.943.419.715.98.86.14.64.48A443216试管法 A24218A332116平板法 A233282.22.2 干扰因素干扰因素 主要从溶血、脂血和黄疸对该试验结果的影响程度来研究该试验是否 存在假阳性和假阴性情况。将市售血红蛋白、三油酸甘油酯和胆红素用 A 或 B 型血浆配成 系列浓度，然后分别吸取 50ml 加入 96 孔 U 型微量板中，每种浓度做 8 孔，作微板法（表 35）。 表 3 溶血(血红蛋白)对 TC 值的影响血红蛋白含量(g/L)652.54537.53022.5157.50无凝集0.450.310.710.601.510.791
9、.3 51.753.14凝 集0.761.682.835.207.4511.221.831.977.9 表 4 脂质(三油酸甘油酯)对 Tc 值的影响三油 酸甘油酯含量(mg/L)366 .8320.95275.1229.25183.4137.5591.745.850 无凝集1.9 32.82.912.843.553.744.384.484.96凝 集4.698.6910.012.7113.917.941.055.9 59.9 表 5 黄疸(胆红素)对 Tc 值的影响胆红素含量(mol/L)684598.551342 7.5342256.517185.50无凝集2.292.653.033.39
10、2.643.14 2.842.764.05凝 集68.465.867.365.867.066.262.365.064.93 讨论讨论全自动微板法具有很好的重复性和稳定性，经 28 57 名献血者 ABO 血型鉴定，一次判 读准确率达到 99.83%，与国外文献报道的 98.8%（用 Kemble ，BG15 系统检测）8和 98.5%（PK7200 分析系统检测）6相似。单克隆抗-A 试剂呈兰色，对 620nm 波长有吸收干扰作用，在本实验(表 1) 中得到了证 实。但在对献血者样本用单克隆抗-A 原液进行正定型时，发现凝集试验的 Tc 值全部在 35 以 上，且 Tc 值在 45 以上占 9
11、9.82%。针对该方法的 Cut off15 为凝集反应来说，其实 际 影响程度并不大，只要保证单克隆抗体的效价在 128 以上且亲和力10s 即可。微板法中测定单克隆抗-A 效价，不论是用 A 型还是 A2亚型红细 胞， 都比试管法或 平板法高一个滴度，此说明正定型中微板法的灵敏度优于试管、平板法；在反 定型中微板 法对 A 细胞的灵敏度优于试管、平板法，而对 A2亚型 3 种方法无差异(表 1，2)。从表 35 中可见，脂质、溶血对该试验判读有一定的干扰，而胆红质对 该试验没有 任何影响。在对 2857 份献血者样本反定型中就发现有 3 份脂血和 2 份弱抗体 样本产生假 阴性结果（表 35），故在实际工作中除了尽量避免脂血和溶血样本的发生， 还要保证 5%的 3 人份以上混合而成的试剂红细胞悬液的新鲜。如果碰到 ABO 正反定型不符时，应该由经典的常规方法确认，以考虑是否有亚型、 弱抗体和假凝集等因素存在。
