《斑马鱼胸腺苷酸合成酶基因的克隆与表达调控》由会员分享，可在线阅读，更多相关《斑马鱼胸腺苷酸合成酶基因的克隆与表达调控（103页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、摘要摘要胸腺普酸合成酶 ( T h y m i d y l a t e s y n t h a s e ,简称T S )催化 B U M P生成 d T M P和二氢叶酸，d T M P 再进一步转化为d T T P ，后者是D N A 合成的重要前体。多年来丁 S一直作为癌症化疗的一个重要靶点，斑马鱼作为一种重要的模式生物，已成功用于多种药物筛选模型的构建， 但斑马鱼T S 的序列分析、表达调控规律以及在发育过程中的功能尚未见报道。本研究的主要目的是分析T S 在斑马鱼体内的表达调控机制，阐明T S 在斑马鱼发育过程中的作用，为构建斑马鱼药物筛选模型提供理论基础。采用R T - P C R
2、和R A C E 技术， 从斑马鱼胚胎中克隆出T S 的c D N A 全长序列， 分析表明它的编码框序列含有9 5 7 个核昔酸， 编码一个分子量为3 6 k D的3 1 8 个氨基酸的蛋白 序列。将斑马鱼T S 蛋白 完整编码序列连接到p E T - 2 8 a 表达载体上，构建表达载体p E T - 2 8 1 Z - T S ，转化进大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) 进行I P T G 诱导性融合表达， 实验表明在1 m m的I P T G 浓度条件下， 诱导表达3 h ， 斑马鱼T S 融合蛋白表达量达到比较高的水平。而几种不同浓度的1 P T G 诱导对融合蛋白的表达量影
3、响较小。 利用亲和层析技术分离纯化， 获得均一性T S 蛋白。酶学性质研究表明纯化的斑马鱼T S 蛋白在较低的温度仍呈现酶的催化活性， 2 8 催化活性达到高峰。测定它与胸胸腺普酸合成酶;基因克隆;蛋白表达与纯化;R N A 干扰摘要C l o n i n g o f t h y m i d y l a t e s y n t h a s e f rom z e b r a fi s h , D a n i o r e r i o a n d i t s e x p r e s s io nr e g u l a t i o nD u C h a n g q i n g ( Ma r i n
4、e B i o l o g y )D i r e c t e d b y p r o f e s s o r X i u k u n L i n a n d P e ij u n Z h a n gABS TRACTT h y m i d y l a t e s y n t h a s e ( T S ) i s a f o l a t e - d e p e n d e n t e n z y m e t h a t c a t a l y z e s t h er e d u c t i v e m e t h y l a t io n o f 2 - d e o x y u r i d
5、i n e - 5 - m o n o p h o s p h a t e ( d U MP ) t o d i h y d r o f o l a t ea n d t h y m i d y l a t e ( d T MP ) , a n e s s e n t i a l p r e c u r s o r f o r D N A s y n t h e s i s . T S r e p r e s e n t s a ni m p o r ta n t t a r g e t f o r c a n c e r c h e m o t h e r a p y . Z e b r a
6、 f i s h h a s b e e n d e v e l o p e d s u c c e s s f u l l ya s a s c r e e n i n g m o d e l f o r m a n y d r u g s i n r e c e n t y e a r s . H o w e v e r , t h e T S g e n e s e q u e n c ea n a l y s i s , m e c h a n i s m o f r e g u l a t i o n a n d t h e r o l e i n z e b r a f i s h
7、 d e v e l o p m e n t h a v e n o tb e e n r e p o rt e d y e t . T h e a i m o f t h e r e s e a r c h i s t o a d d r e s s m e c h a n i s m o f t h e T Sr e g u l a t i o n i n z e b r a f i s h , t o d o c u m e n t i t s r o l e i n z e b r a f i s h d e v e lo p m e n t a n d d e v e l o pz
8、e b r a f r s h a s a m o d e l f o r T S i n h i b i t o r s c ree n i n gT h e c o m p l e t e T S c D N A w a s a m p l i f i e d b y R T P C R a n d R A C E . T h e o p e n re a d i n gf r a m e ( O R F ) o f z e b r a f i s h T S c D N A s e q u e n c e w a s 9 5 7 n u c l e o t id e s , e n c
9、o d i n g a3 1 8 - a m i n o a c i d p r o t e i n w i t h a c a l c u l a t e d m o l e c u la r w e i g h t o f 3 6 k D . T h e c o m p l e t eO R F e n c o d i n g t h e z e b r a f i s h T S g e n e w a s P C R a m p l if i e d a n d i n s e rt e d i n t o p E T2 8 at o c o n s t r u c t a n e x
10、 p r e s s i o n v e c t o r p E T - 2 8 / Z - T S . T h e e x p r e s s i o n o f z e b r a f i s h T Sp r o t e i n w a s i n d u c e d b y I P T G i n E . c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) . H i g h l e v e l e x p r e s s i o n o fz e b r a f r s h T S w a s f o u n d a t 1 m M I P T G c o n d i t i o n
11、 a ft e r i n c u b a t i o n f o r 3 h . H o w e v e r ,i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n o f I P T G h a d l i t t l e e f f e c tT S w a s p u r i f i e d t o h o m o g e n e i t y u s i n g N i - N T Ao n p r o t e in e x p r e s s io n . T h e z e b r a f i s hs p i n c o l u m n f r
12、o m t h e t o t a l c e l l u l a rp r o t e i n s . E n z y m a t i c a n a ly s i s c o n f i r m e d t h a t t h e p u r i f i e d z e b r a f i s h T S s h o w e d t h eh i g h e s t a c t iv i t y a t 2 8 0C w i t h s i m i l a r K m v a l u e a s h u m a n T S .We s t e rn b l o t a n a l y s
13、i s w a s u s e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e p u r i f ie d z e b r a f i s h T Sc o u l d b e r e c o g n i z e d b y h u m a n T S m o n o c l o n a l a n t i b o d y . O u r r e s u l t s c o n f i r m e d t h a tz e b r a f i s h T S p r o t e i n i n t e r a c t s w i t h h u m a
14、 n T S - 1 0 6 m o n o c l o n a l a n t i b o d y w i th a s i m i l a ra f f in i t y w i t h h u m a n T S . S o w e c o u l d u s e t h i s m e t h o d t o d e t e r m i n e t h e e x p r e s s i o np r o f i l e o f z e b r a f i s h T S d u r in g e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t u s i
15、n g h u m a n T S m o n o c l o n a l摘要a n t i b o d y . C a r e f u l a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t z e b r a f i s h T S w a s s i g n i f i c a n t l y e x p r e s s e d i ne m b ry o s a t d i f f e r e n t s t a g e s w i t h h i g h e s t l e v e l a t 1 - c e l l t o 2 - c e l l s
16、 t a g e s .T o s t u d y t h e f u n c t i o n o f T S i n z e b r a f i s h d e v e l o p m e n t , w e g e n e r a t e a s h o r t h a i r p i nR N A ( s h R N A ) e x p r e s s i o n v e c t o r , p S i l e n c e r 4 . 1 - C MV / T S , a n d m ic r o i n j e c t e d th ep l a s m i d i n t o z e b r a f i s h e m b ry o s a t t h e 1 - c e l l t o 2 - c e l l s t a g e . A b n o r m a l g e n o t y p e o fz e b r a f i s h e m b r y o s , e s p e c i a l l y w it h h e a d a n d t a i l
