改善移植肺功能的实验研究

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1、论文题目改善移植肺功能的实验研究研究生：杨研导师：吴清玉学科专业：心血管外科入学时间：一九九九年八月所在院所：阜外心血管病医院心血管病研究所= 0 0 三年五月中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究K 研剖蝴c G 皿N OU WL P DA T P 敏感性钾通道环磷酸腺苷环磷酸鸟苷一氧化氮u 血，e r s 时o f w i 8 c o t l s h ( 液)l o w p o t a s s i 眦d 咖a n ( 液)中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的

2、实验研究日U舌1 9 8 3 年，加拿大多伦多大学医院首次成功地为一位肺纤维化患者实施了单肺移植手术，此后近二十年里，肺移植已发展成为多种终末期肺部疾患的有效治疗手段，其适应证主要为肺气肿、肺纤维化和肺动脉高压等。根据国际心肺移植协会的记录显示，截止到2 0 0 2 年全世界已完成了近1 5 ，0 0 0 例肺移植手术，年手术数量已达到了1 5 0 0 例。然而，由于可用的供体肺缺乏，不能满足肺移植数量快速增加的需要，等待肺移植手术的病人数量已达到7 5 ，0 0 0 例，远远超过了能够获得并适合移植的供体肺数量。目前，早期移植物功能障碍( M m a r yg r a f 【筋l u r e

3、 ，P ( 璜) 仍然是肺移植手术后早期死亡的主要原因和晚期并发症的重要相关因索。普遍认为移植肺缺血再灌注损伤是p G F 的最主要原因，同时供体肺低温保存期间的各种损伤因素可以诱发并促进缺血再灌注损伤。因此，降低P G F发生率的努力主要集中在两方面：一、改善肺保存技术以增加适合用于肺移植的供体肺数量；二、发展围术期的有效干预措施以减轻移植肺的缺血再灌注损伤。近十年来，随着对缺血再灌注损伤机制的深入了解，肺保存技术得以逐步完善，外科技术及围术期治疗水平也明显提高，初次移植失败的发生率已由早期的3 0下降至约1 5 2 0 。本实验在建立大鼠离体肺再灌注模型的基础上，进行了两方面研究；一、在缺

4、血期前应用A T P 敏感性钾通道开放剂( P C O s ) 处理供体肺，观察P c O s 对供体肺保存效果的影响；二、控制低温保存后的供体肺再灌注流量，研究再灌注流量的变化对移植肺功能的影响，从而为临床工作提供实验依据。中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究中文摘要第一部分：建立大鼠离体肺再灌注模型小动物离体肺再灌注模型简单、经济而且可靠，被广泛用于供体肺保存效果和低温保存后的供体肺功能评价。静脉化全血具有生理状态下的血气指标，用来灌注离体肺的效果优于一些合成介质。本实验利用微创方法建立大鼠离体肺灌注模型。方法：将一只受体大鼠股动、静脉插管形成控制性交叉

5、循环，引流出股静脉血，经肺动脉灌注低温保存后的供体肺，收集肺静脉流出的氧合血经股动脉回输入受体大鼠体内以解毒、去氧。3 6 只供体大鼠随机分为6 组，供体肺摘取后以4E c 液灌洗并保存8 小时；每只受体大鼠建立控制性交叉循环后，分别在第1 、2 小时中依次灌注两只供体肺，取股静脉流出血样进行血气分析监测D H 、P 0 2 、P C 0 2 和H c t 的变化情况。结果：各组p H 、P 0 2 、P C 0 2 和H 吐经统计学分析无明显差异( P o0 5 ) 。结论：控制性交叉循环下受体大鼠血流动力学稳定，能够较长时间地提供符合生理状态的静脉化全血。第二部分：P c O s 对供体肺

6、保存效果的影响许多实验证明钾离子通道开放剂( P c O s ) 有保护器官免受缺血再灌注损伤的作用，本研究应用具有A I P 敏感性钾通道开放剂( P c O s ) 功能的硝酸烟碱类药物尼可地尔( n i c o r a n d i l ，N c R ) ，在缺血期前处理大鼠供体肺，以观察其对供体肺保存效果的影响。方法：应用上述大鼠离体肺灌注模型设定条件进行对比研究。1 8 只s D 大鼠随机分成3 组，每组6 只：A 组为常规保存组，E C 液灌洗后摘取心肺器官，于4 恒温冰箱中保存8 小时后取出，以5 m l m i l l 流量再灌注6 0 分钟；B 组为N c R组，供体肺灌洗液中

7、含有1 0 0 u m o l 几尼可地尔，余同A 组；c 组为N C R + G L Y组，灌洗前1 5 分钟根据体重取1 I l 彰蛞量选择性K 册阻断剂格列本脲中文摘要中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究( a i b 肌c l 砌d e ，G L ，Y ) 经静脉给药，余同B 组。结果：B 组肺P v 0 2 ，m P A P ，W D 及超微结构改变显著优于A 组和C 组( p o 0 5 ) ，同时，B 组再灌注前、后肺组织M D A 含量较A 组和c 组显著降低( p O 0 5 ) 。A 组和C 组各项指标无显著性差异，G L Y 阻断了N

8、c R 的有益作用。结论：以P C O s 药物处理供体肺能够改善供体肺保存效果和移植后早期供体肺功能。第三部分：再灌注流量对移植肺功能的影响。研究证实，在心肌保护中改变再灌注流量可以有效地减轻冠状动脉内皮细胞损伤和左室功能不全，在肺移植术中控制再灌注流量对移植肺功能可能会有同样作用，本实验应用上述大鼠离体肺灌注模型设定条件进行对比研究，采用3 种再灌注流量方案来研究不同再灌注流量对离体再灌注大鼠移植肺功能的影响。方法；将1 8 只s D 太鼠随机分成3 组，每组6 只：A 组为低流量对照组，以4 m l m i n 的流量灌注供体肺3 0 分钟；B 组为高流量组，以8 m l m i n 的

9、流量灌注供体肺3 0 分钟；c 组为控制流量组，再灌注开始后先以4 m l m i n 流量灌注供体肺5 分钟，然后以8 m 1 ，m m 的流量继续灌注供体肺2 5 分钟。结果：A 组的m P A P ，P 邛，P 0 2 ，w m 和超微结构改变均明显好于B 组和c组( P o 0 5 ) ；同时，C 组各项指标较B 组均有明显改善( P 0 0 5 ) C o n c l u s i o n s ：T h es y n g e n e i cs u p p o r tr a tc 姐d e H v e r sc o n s t a l l ts y s t 砌cV e n o u sb

10、l o o da ts t a b l ep b y s i o l o 画cp a r 锄e t c r st o 也ee xv i v ol u n gb l o c k2 ，T h ei n f l u e n c eo f 仃i p h o s p h a t e - s e n s i t i v ep o t a s s i u m c h 锄e lo p e n e r s( P C O s ) o nd o I l r1 1 1 I l gp r e s e r v a t i o nP C O sh a sb e e ns h a w nt op r o t I 蚍o r g

11、 a na g a 主n s ti s c h e m i a - r 印e r 缸s i o ni n j u r yi naV a r i e t yo f 唧e r i m e n t s W eu s e dN i c o r a n d i l ，an i c o t i n a m i d en i t r a t ew i la d e n o s i n et r i p h o s p h a t e s e n s i t i V ep o t a s s i u m 哐A T P ) c h a n n e lo p e n e ra c t i v 咄a t 恤ei n

12、 d uc I i o no f英文摘要6 中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究i s c h e I I l i at oi n v e s t 远a t ew h e t h e ri tm i g h te n h a n c el u l l gp r e s e 九，a t i o na n dp r e V e ma l l o g r a Rr e p e 血s i o ni 囱u 哆M e t h o d s ：U s i n go u ri s o l a t e d ，v e n t i l a t e d ，b l o o d p e

13、血s e dr a t1 u n gm od e l ，t h r e eG r o u p sw e r es t u d i e d = G r o u pA ( n = 6 ) i sc o m r 0 1G f o u p ，t h el u n g sw e r ef l u s h e dw 汕4 E Cs o h m o na n dp r e s e e df o r8h o u r s ，r e c e i v e dn on i c o r a n 呲i nG r o u pB ( n = 6 ) ，也ed o n o rl u n gr e c e i v e dl l

14、i c o r a I l d i l ( 1 0 0um o l L ) i nt h en u s hs o l u t i o n ；I nG r o u pC ( n = 6 ) g l i b e n c l 蛳d d e ，as e l e c t i v ea d e n o s i n e证p h o s p h a t e - s e n s i t i v ep o t 弘s i u m - c h m e lb l o c k e r w a sa d m i n i s t e r e d1 5m i l l u t e sb e f o r en i c o r 姐d

15、 i la d m i n i s 仃a t i o n R e 蛐l t ：s i g 幽c 妣t l yi m p r o v e dm e a np u h n o n a r ya r t e r yp r e s 踟r e ，a r t 融a l 呵g e n a t i o n ，a n dw e t 舡d r yw e i g h tr a t i om e a s u r e m e n t sa 1 1 du l t r a s t 】n l c t u r ew 盯eo b s e r V e d 血g r o u pB p l l l m o n a r yt i s m

16、 eM D Ac o n c e n t r a t i o nw e r es i g n i f l c a m l yr e d u c e di 1 1 鲫pBb e f o r ea n da f t e rr 印e r f h s i o nc o m p a r e dw i t h 鲈o u pAa n dC ( P O0 5 ) w e t t o d f yw e 啦r a t i o ，a i r w a ya n dp u l I n o n 啊a n e f ) rp r e s s l l r e sw e r en o ts i g n i f i c a n t

17、 l yd i 丘打e n tb 神w e e nt h e 野o u pA 锄dC ，w h i c hm e a n sG l i b e n d a r n i d ee h I n j n a l = e dt h eb e n e f i c i a Je 丘b c t so fn i c o r 眦d i l C o n c l u s i o n s ：M e m b r a n eh y p e 巾o l 砌i o n 、i t haK A T Pc h a n n e lo p e e r 口c O s ) p r a v i d e ss u p e r i o rp m

18、t e c t i o nf r o mi s c h e m i a r 印e 血s i o n 岫u r yi I l 孤mV h om o d e lo f p u l m o n a r yt r 姐S p l a n t 撕0 n3 T h ei n f l u e n c eo fc o n 廿o l l e dr e p e r m s i o nn o wr a t eo n 盯a Rl u n ga R e rh y p o m 砌cp r e s e r v a t j o n S o m ei 芏1 v e s t i g a t o r sh a 、吧s I l g g

19、 e s t e dt h a tc o n t r o l l e dr 印e r 如s i v ef l o wr a t e sd e c r e a s et h er i s ko f8 e v e r ee n d o t l l e I i a li n j u r ya n dl e f tv e n t f i l a rd y s 旬n c t i o nd u r i n gm y o c a r d i a lp r o t e c t i o n W eh y p o t h e s i z e dt h a tc o m r o m n gt h ei i t i

20、a ln o wr a t ew o u l dd e c r e a s et h es e V e r i t yo fl u n gd y s 如n c t i o ni nt h es 嘶n go fl l i g h - n o wr e p e r m s i o nM e t h o d s ：U s i go u ri s o l a t e d ，V e n t i l a t e d ，b l o o d - p e 血s e dr a tl u n gm o d e l ，“lg r o u p su n d e n v e ml u n gh a e s t ，8 -

21、h o u rs t o r 鹋e ( 4C ) ，a n d b l o o dr 印e m s i o n G r o u pA ( 1 0 wn o w ，n = 6 ) u n d e n e n tr e p 嘶舶na t 4 m i n f o r3 0 m i n u t e s ：G r o u p B ( h i g h f l o w ，n= 6 ) u n d e 九v e mr 印e 血s i o na t8m I m i nf o r3 0m i n u t e s ；G r o u pC ( c o n 仃0 U e dn o w n =6 ) u n d e n

22、e n ti 1 1 i t i a l r e p e r 旬s i o na t4m i nf o r5m i n m e s ，f o n o w e db yr 印e r 如s i o na t英文摘要7 中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究8r n l ，m i nf o r2 5m i n u t e s R e s u l t s ：G r o u pAh a ds i g l l i f i c 柚t l yi m p r o v e dp u l m o n a r ya r t e r yp r e s s u r e ，p e a ki

23、 n s p i r a t o r yp r e s s u r e ，a r t e r i a lo x y g e n a t i o n ，w e t t o d r yw e i g h tr a t i om e a s u r e m e n t sa n du l 仃a s t m c 七u r e m p a r e dw i t hg r o u p sBa n dCa f t e r3 0m i n u t e so f r 印e 而s i o n ( P O 0 5 ) H o w 州e r ，G m u pCh a d 血p r o v e dp u l m o n

24、 a r ya n e r yp r e s s u r e ，p e a l ci l l s p i r a t o r yp r e s m r e ，a r t e r i a lo x y g e n a t i O n a n dw e t - t 0 d r yw e i g h tr a t i om e a s u r e m e n t sc o m p 啪dw i n lG f o u pB ( P 0 0 5 ) C o n c l u s i o m ：H i g h - n o wr 印e r m s i o nr e s u l t si ns e v e r e

25、r e p 曲s i o n 面u r yo fd o n o rl u n g C o n t r o l l e dr 印曲s i o nu s i I l gal o wi n j t i a lf l o wr a t ed e c r e 髂e st h es e v e r i t yo fr e p e r f h s i o n 画u r ya s s o c i a t e dw nh i g h - n o wr a t e s中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善穆植肺功能的实验研究第一部分：建立大鼠离体肺再灌注模型早期移植物功能衰竭( P r i a r

26、yg r m 凡i l u r e ，P G F ) 的发生始终是肺移植术后早期的难题，发生率约为1 5 2 0 ，与移植后并发症搅生率及病死率明显相关1 1J 【“。P G F 病因复杂，目前降低P G F 发生率的努力多集中在肺保存方面以减轻供体肺损伤。因此，建立一种简单可靠、重复性好、费用低廉的动物模型来评价肺保存效果非常必要。本实验利用微创方法建立大鼠离体肺灌注模型，将一只转流大鼠股动、静脉插管形成控制性交叉循环，引流出静脉血灌注供体肺，氧合后的血液回输入转流大鼠体内以解毒、去氧。实验材料一、实验动物健康雄性s D 大鼠，均为1 6 2 0 周龄，体重2 5 0 3 5 0 克，由北京

27、医科大学实验动物部提供。二、主要试剂和药品戊巴比妥钠，佛山实验化工厂肝素钠注射液，常州生化千红制药有限公司保迭新( P G E l ) 注射液，英国G 1 “o 公司磷酸氢二钾( K 2 珀0 4 3 H 2 0 ) 分析纯，北京红星化工厂磷酸二氢钾( 也P 0 4 ) 分析纯，北京红星化工厂氯化钾( K c l ) 分析纯，北京红星化工厂硫酸镁( M g s 0 4 ) 分析纯，北京五七六0 一化工厂碳酸氢钠( N a f I c 0 3 ) 分析纯，上海红光化工厂T A L 试剂；灵敏度，O5 E 叭玎l ( 广东省湛江市海洋生物制品厂)T A L 试剂：灵敏度，0 5 E w l l l

28、 l ( 广东省湛江市海洋生物制晶厂)第一部分；建立丈鼠离体肺再灌注模型中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究第一部分：建立大鼠离体肺再灌注模型早期移植物功能衰竭口r i m a r yg r a f t 蹦l u r e ，P G F ) 的发生始终是肺移植术后早期的难题，发生率约为1 5 2 0 ，与移植后并发症发生率及病死率明显相关 】J “。P G F 病因复杂，目前降低P G F 发生率的努力多集中在肺保存方面以减轻供体肺损伤。因此，建立一种简单可靠、重复性好、费用低廉的动物模型来评价肺保存效果非常必要。本实验利用微创方法建立大鼠离体肺灌注模型，将一

29、只转流大鼠股动、静脉插管形成控制性交叉循环，引流出静脉血灌注供体肺，氧合后的血液回输入转流大鼠体内以解毒、去氧。实验材料一、实验动物健康雄性S D 太鼠，均为1 6 2 0 周龄，体重2 5 0 3 5 0 克，由北京医科大学实验动物部提供。二、主要试剂和药品戊巴比妥钠，佛山实验化工厂肝素钠注射液，常州生化千红制药有限公司保达新( P G E l ) 注射液，英国G l a x o 公司磷酸氢二钾( K 2 H P 0 4 3 H 2 0 ) 分析纯，北京红星化工厂磷酸二氢钾( 2 P 0 4 ) 分析纯，北京红星化工厂氯化钾( K C l ) 分析纯，北京红星化工厂硫酸镁( M g s 0

30、4 ) 分析纯，北京五七六。一化工厂碳酸氢钠( N a H C 0 3 ) 分析纯，上海红光化工厂T A L 试剂：灵敏度，05 E U I I l l ( 广东省湛江市海洋生物制品厂)第一部分：建立大鼠离体肺再灌注模型中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究三、主要仪器和设备l呼吸机：D H - 1 5 0 型人工呼吸器( 浙江大学医学仪器厂)2 灌注泵：G 舢 R O 双头滚压泵( G M B R - 0 公司)3 ，压力监测仪：S 皿E C U S T 4 0 3 P 型( 德国西门子公司)4 有机玻璃恒温灌注箱：由宁波菲拉尔公司F c R 1 型贮血滤血

31、器改制5 电热恒温水箱：( 北京医疗设备厂)6 恒温冰箱：S R 3 6 8 型( 美国C A L 0 鼬哑A )7 报时器；D S H Z A 型( 北京环境保护仪器厂)8套管针：1 4 G 、1 6 G 、1 8 G 、2 2 G ( 美国)9 显微镜：上海医学光学仪器厂G X S S2 2 3 型双人双目手术显微镜1 0 显微外科手术器械：上海医疗仪器厂1 1 可调式眼睑撑开器：上海医疗仪器厂1 2 再灌注装置：自制( 见图1 1 )1 3 超纯水制备机：M i Q U F 型( 美国h 血l 邱o r e 公司)1 4 分析天平：D T l 0 0 型( 北京光学仪器厂)1 5 磁力搅

32、拌器；8 5 2 型( 深圳天南海北实业有限公司)1 6 洁净工作台：月坛牌( 北京半导体设备一厂)1 7 不锈钢除菌滤器：S S 4 0 0 1 0 0 0 n l l ( 上海瑞丽分离仪器厂)1 8 O 2 2 u m 混合纤维索酯微孔滤膜( 上海医药业研究院高东药用净化器材厂)1 9 高压蒸汽消毒器：w s 2 8 4 6 4 型( 上海医疗器械二厂)2 0 ，恒温干燥箱：D G 2 0 0 0 2 A 型( 重庆实验设备厂)2 1 酸度计：p H s 3 c 型数字酸度计( 上海雷磁仪器厂)2 2 。离子测定仪：E 4 A 型和c x - 5 型( 美国B e c k m a n 公司

33、)2 3 胶体渗透压测定仪：0 s M O M A T0 5 0 型( 德国G o m o l e c 公司)四、常用试剂和液体的配制( 1 ) 改良E C 保存液成份：每1 0 0 0 l l 药品用量见含见附表2 1附表2 1第一部分；建立大鼠离体肺再灌注模型1 0 中圜医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改菩移植肺功能的实验研究( 2 ) 配制方法：用分析天平称量所用试剂，逐一加入盛有4 0 0 m l 超净水的烧杯中，用磁力搅拌器使试剂溶解，不能加热。将溶解后的试剂倒入1 0 0 0 m l 容量瓶中，加超净水至1 0 0 0 m l 。均匀混合后，在层流室洁净工作台上，用消毒

34、后的除菌过滤器( 除菌膜孔径为O 2 2 u m ) 进行除菌。除菌后的保存液分别装入2 5 0 m l和5 0 0 皿无菌玻璃瓶中，保存在4 冰箱中备用。( 3 ) 保存液检测方法：保护液在使用之前，应进行离子浓度、酸碱度、渗透压、无菌性、热源和内毒素检测。E C 液中的K + ，N a + ，C 1 ，用E 4 A 型离子分析仪检测用S 3 C 型数字酸度计检测保存液的p H 值。用O s M O M A T0 5 0 型胶体渗透压测定仪检测保存液胶体渗透压。无菌性检测采用J u 屯O 公司需氧和厌氧两种血瓶，通过A K z 0 公司B A C T ，A J e n 1 2 0 型微生物检

35、测系统判定。熟源及内毒素通过仉也试剂盒检测，如为阴性即可应用。各种离子浓度见附表2 2附表2 2第一部分：建立大鼠离体肺再灌注模型中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改普移植肺功能的实验研究实验方法一、供体心肺获取：术前6 小时禁食，自由饮水，称重记录。1 戊巴比妥钠( 5 0 m g 瓜g ) 腹腔注射，麻醉成功后仰卧固定于手术台上。颈部纵行切口，气管切开，以1 4 G 套管针行气管插管，打结固定与容量型呼吸机相连，潮气量：5 m l ，频率：5 0 次分，F i 0 2 = 1 O 。剪开剑突，钝性分离胸骨后，正中剪开胸骨，以眼睑撑开器撑开，经下腔静脉肝素化( 1 0 0 0

36、眦g 体重) ，打开心包，经横窦放置结扎线。经右室流出道放置1 6 G 套管针到肺动脉，用于肺灌洗、肺动脉灌注和测压，环绕肺动脉灌注管结扎肺动脉和主动脉。切开左心耳引流，将4 改良E C 液( 5 0 m v k g ) 加P G E l 2ug 以3 0 c m 的高度落差，经肺动脉灌注管灌洗大鼠肺，记录肺动脉灌洗压力和时间到灌洗结束( 图1 4 ) 。在近膈肌处横断下腔静脉，降主动脉和食道，提起食道，打开胸膜，剪断下肺韧带，向上分离后纵隔。取出心肺器官，此间继续保持通气，并检查有无肺损伤和漏气。在吸气末夹住气管，保持肺膨胀状态。将取下的心肺组织，放入装有低温保护液的容器中，外层加盖湿纱布，

37、塑料薄膜覆盖，恒温冰箱4 保存8 小时。整个过程应防止肺不张、损伤肺表面和压迫肺组织。从肺温缺血至心肺组织浸于低温保护液中，时间应在1 0 分钟之内。二、建立受体鼠控制性交叉循环：取一只实验用大鼠，麻醉同上，以台灯照射保温。颈部纵行切口，气管切开，以1 4 G 套管针行气管插管，在显微镜下分离左侧颈内动脉，主干下套过两根1号丝线留置备用，以2 2 G 套管针穿刺，将套管针送入，以一根留置丝线结扎固定，另一根留置丝线结扎颈内动脉穿刺点之远心端，以4 1 2 无创缝线将套管针与其下软组织缝扎固定，缝合皮肤保持体温。左侧腹股沟水平纵行剪开皮肤3 c m ，剪除脂肪层以暴露股动、静脉，严密止血，上眼险

38、撑开器，在显微镜下剪开血管鞘，钝性游离股动、静脉。显露股静脉主要分支静脉汇入点，在其近心侧股静脉主干下套过两根l 号丝线留置备用，以显微外科血管夹夹闭近心端，待静脉充盈第一部分：建立大鼠离体肺再灌注模型中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究后以1 8 G 套管针穿刺，松开血管夹，将套管针送过腹股沟韧带，以留置l 号丝线结扎固定，另一根留置丝线结扎股静脉穿刺点之远心端。静脉推注肝素( 1 0 0 0 眦g 体重) 使转流鼠肝素化。同一区段股动脉下穿过l 号丝线两根，结扎股动脉远心端，近心端丝线留置。股动脉表面滴2 滴罂粟碱，待股动脉痉挛缓解后以2 2 G 套管针

39、穿刺，将套管针送过腹股沟韧带，以留置之1 号丝线结扎固定，少量肝素盐水冲洗套管针( 附图1 5 ，1 6 ) 。分别以4 1 2 无创缝线将两根套管针与其下软组织缝扎固定，缝合皮肤以保持体温。三、离体再灌注：以新鲜肝素化大鼠( 1 0 0 0 u m g 体重) 血液l O d 预充管道，转机充分排气，检查管路确保通畅并连接紧密。取出保存后的心肺组织，悬置于有机玻璃恒温灌注箱内，用热循环水保持箱内湿度和温度( 3 7 3 9 ) 。灌注前检查供体肺是否漏气，给供体肺通氧气，设定潮气量5 m l ，频率5 0 次分。通过重力作用，将受体大鼠股静脉经管道引流入l 号血池，管道加装调节阀控制引流速度

40、。通过肺动脉灌注管，将1 号血池中的静脉血经肺动脉泵入灌注供体肺，从供体肺引流出的氧合血汇集于2 号血池，用泵经股动脉回输给转流大鼠。依据大鼠颈动脉压可反映转流大鼠体液的出入量，通过调节回输速度来维持平衡，保持颈动脉压在8 0 m m H g以上。四、实验分组：将3 6 只S D 大鼠作为供体鼠随机分成6 组，每组6 只，供体肺保存和再灌注条件见第二、第三部分，每只受体大鼠建立控制性交叉循环后，分别在第1 、2 小时中灌注两只供体肺。1 组：常规保存组6 只2 组：N C R 组6 只3 组：N C R + G L Y 组6 只4 组：低流量对照组6 只5 组：高流量组6 只6 组：控制流量组

41、6 只第一部分：建立大鼠离俸肺再灌注模型中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究五、评价模型的指标：血气分析检查：分别于再灌注期间开始后3 0 分钟和6 0 分钟取股静脉流出血样l 份，分别测定p H 、P 0 2 、P C 0 2 和H c t 的变化情况。六、统计学分析所有数据以x s D 表示，实验数据应用s P s s l Oo 软件进行统计学分析，统计方法采用单向方差分析( A N O V A ) ，多重比较采用D u n n e t t 法，p 00 5 。各组间p H 值D u n n e t t 法多重比较，无显著性差异( P O0 5 ) 。第

42、一部分：建立丈鼠离体肺再漕注模型6543217777777中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究5 04 03 0看2 01 0023456 ( g r o u p )各组间P v C 0 2 经D 删法多重比较，无显著性差异( P O ，0 5 )2345各组间P v 0 2 经D l l n n e t t 法多重比较，无显著性差异( P O0 5 )456 ( g r o u p )各组间H c t 经D u 肌e t t 法多重比较，无显著性差异( P 00 5 )M看目蛐加加。中图医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究图

43、1 1 大鼠离体肺再灌注模型。图1 2 大鼠离体肺再灌注模型示意图甘l 纛醵中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究图1 - 3 上海医学光学仪器厂G X - S S 2 2 3 型双人双目手术显徽镜。图1 - 4 以4 的E C 液以3 0 c m 的高度落差，经肺动脉灌洗大鼠肺。第一部分：建立大鼠离体肺再灌注模型1 7 iii 。- - _ _ _ - H _ - _ _ _ 一中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究圈1 5 左侧腹股沟水平开始向下纵行剪开皮肤3 c m ，上眼睑撑开器。图1 6 股动静、脉插管，结扎及缝合固

44、定。第一部分：建立大鼠离体肺再灌注模型1 8 中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究讨论小动物离体灌注模型具有简单、经济等优点，被广泛用于低温保存后的供体肺功能评价。这类模型的原理是用静脉血或合成介质来灌注离体肺，同时测定有关肺循环阻力、肺顺应性和肺换气功能指标，也可以研究肺形态学变化和渗出系数( K f ) 等，其中静脉化全血具有生理状态下的血气指标，用来灌注离体肺的效果优于一些合成介质，后者不能反映白细胞功能易导致肺水肿，而在一定程度上影响实验结果。早期的研究者们认为离体全血灌注模型并不实用，因为当时没有利用活体动物血液灌注技术，一次实验往往需要杀死多只动

45、物提供足够的血液1 3 1 。而应用人工去氧装置将血液循环利用，虽然可以减少用血量，但由于毒性代谢产物的堆积改变了P H 值和一些血液成分，会逐渐偏离生理状态【4 】。1 9 8 9 年w i n g 等 5 】首先应用兔肺离体再灌注模型进行供体肺功能研究，虽然受到血液量限制再灌注时间仅为I o 分钟，却一度得到广泛应用。1 9 9 1 年w e d e r等【6 咐其进行了改进，利用受体兔静脉静脉转流进行氧合血解毒、去氧，减少了血液用量，使再灌注时间得到延长并更加接近生理状态，但其模型需要受体动物机械通气，而且经静脉回输氧合血和补液可能造成静脉血氧增高和受体心脏负担加重。1 9 9 6 年H

46、 o p k i n s o n 等同等采用正中切口双上腔静脉插管，并行循环下以静脉血灌注离体肺，但具有创伤大，受体大鼠需要机械通气等不足。本实验模型采用受体鼠股静脉中引流出的静脉血灌注离体肺，流出的氧合血再经股动脉输回受体鼠体内以解毒、去氧，不会造成有毒代谢产物堆积，不需要人工去氧设备，受体动物无须机械通气，可以最大程度地模仿正常生理状态。正常情况下，大鼠心输出量为4 7 m I m i n ，明显高于本实验中5 m l m i n 的转流量，因此本实验模型中受体大鼠可以稳定、可靠地将回输动脉血静脉化并通过肝脏代谢充分去毒。实验结果中连续3 组间静脉血氧分压，二氧化碳分压，H c t 和p

47、H 均无明显差异( p 0 0 5 ) ，说明此模型可以保证连续2 小时提供稳定、合格的静脉血。利用活体动物提供血液灌注离体器官的这类模型，经常面临着同样的问题：即受体动物血流动力学不稳定而引起相应体液因素的变化，同样会作用于离体器第一部分：建立大鼠离体肺再灌注模型1 9 中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验面堕官效应器，从而影响离体器官的功能指标产生实验误差。如受体动物血压下降会引起儿茶酚胺生成增加，可以引起供体器官灌注压升高等现象干扰实验结果，本实验保持了受体动物血压、体温、酸碱平衡及麻醉平稳，可防止上述现象的发生。本模型中氧合血经段动脉而非静脉回输，有以下

48、优点；( 1 ) 可以减轻受体大鼠心脏负担，有利于保持血流动力学稳定；( 2 ) 静脉血氧分压不受影响而相对恒定；( 3 ) 离体肺或循环管道中产生的微栓颗粒会被受体大鼠的外周循环滤过，不会再进入受体大鼠心肺循环或离体肺循环中，进一步保持血流动力学稳定和防止供体肺功能指标受干扰。该模型应用范围广泛，在供体肺保存方面可进行灌洗前用药、保存液成份、保存温度、充气成份或状态、再灌注阶段代谢变化，白细胞功能以及组织学改变等诸多种研究。如改为以股动脉血液灌注，收集流出液经静脉回输，则可用于多种器官离体再灌注实验。由于延长了再灌注时间，许多再灌注损伤的病理改变均可出现，因而结果评价准确、可靠。该模型所需实

49、验经费少，出结果快，并可同期进行多组实验。大动物双肺或心肺移植模型，虽然可以更近似地模拟人体肺保护情况。但所需实验经费多，实验难度大，干扰因素不易排除，实验成功率( 动物存活率) 不稳定。因此，在对比研究和确定研究方向等方面，大鼠肺离体连续再灌注模型，是一种较理想的实验动物模型。本模型为离体灌注模型，与在体移植模型呼吸模式有所不同。在体移植模型胸腔为负压，肺脏的充气与排气由胸廓和膈肌情况影响；离体肺的充气过程则由呼吸机控制，更直接地反映肺顺应性等指标。在体移植肺血供来自心脏，近似生理状态，但各组间的肺灌注量多不一致，也易受动物体液因素的影响；离体肺由机械泵供血，属非生理状态，但灌注流量易于控制

50、。用来检测保存和移植后肺功能的指标很多，例如气体交换、肺循环阻力、呼吸道阻力、血管通透性、组织学、代谢以及放射学变化等。目前多数人认为气体交换能力最能够反映肺受破坏的情况，因为肺泡毛细血管膜结构，对缺血再灌注损伤非常敏感，早期的肺损伤可以影响气体交换能力而不出现形态学改变口l 。肺脏的主要功能就是进行血气交换，因此在观察指标中，血气分析结果能更可靠地第一部分；建立大鼠离体肺再灌注模型中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究反映供体肺功能的保护情况。有实验证明，供体肺流出血P 0 2 ，比病理、生化、血液动力学和放射学等检测指标，能更可靠地反映供体肺的保护情况【6

51、 】。离体肺再灌注模型能够有效地控制流入肺动脉的血液成分、流量以及通气成分和潮气量，使流出血的分析更有可比性。建立模型操作要点：1 供体肺摘取过程中，尽量避免失血，供体大鼠失血可能引起肺血管收缩而影响肺灌洗效果。沿胸骨正中线剪开胸骨可避免伤及肋间动脉，如出血偏多可以直止血钳钳夹两侧胸壁；2 整个实验过程中，应采用n o - t o u c h 技术避免肺不张和肺出血，灌洗过程中钳夹心脏进行操作，取出供体肺时可钳夹食管将肺游离提出；3 受体大鼠操作中应注意保温和严密止血，防止低温和失血影响循环，建立循环过程应在2 0 分钟左右；4 再灌注转流过程中，除给供体大鼠输注同源新鲜血和少量5 N a H

52、 C 0 3 外，不应加用其它心血管药物，通过调节阀控制静脉引流量，依据颈动脉压决定补液量，维持血压平稳。结论1 大鼠离体肺再灌注模型操作简单，所需经费少，重复性好，可靠性高，应用范围广泛，判定结果快。2 控制性交叉循环下受体大鼠血流动力学稳定，能够较长时间地提供符合生理状态的静脉血。第一部分：建立大鼠离俸肺再港注模型中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究参考文献1 H e n zM ，T 如l o rD ，T m l o c kE ，e ta 1T h eR e g i s t r yo f t h eI n t e m a t i o n a lS o c

53、 i e t yf o rH e a r ta l l dL u n gT r a n s p l a n t a t i o n ：n i n e t e e n t ho m c i a l r e p o r t -2 0 0 2 JH e a nL u n gT r a n s p l a m2 0 0 2 ；2 1 ：9 5 0 一9 7 02C h r i s t i eJ D ，B a V a r j aJ E ，P a l e v s l 【ym ，e ta 1 P 妇a r yg r a R 硒l u r ef o l l o w i n gp u l m o n a r y

54、 咖l a m a t i o n C h e s t1 9 9 8 ；1 1 4 ：5 l - 6 0 3 胁m a r a 眦A g e v i n eL S ，Y o s h i oO T h ei s o l a t e dp e m s e dl u n g ac r _ 妯c a le v 山a t i o n T b x o c o l1 9 8 1 ：2 l ：l - 5 4N i e m i e rR WT h ei s o l a t e dp e 血s e dl u g E v 曲nH e a l t hP e r s p e c t1 9 8 4 ：5 6 ：3 5 3

55、 9 5 ，、) l 佳m gL S ，Y b s h 墩锄aK ，M i y o s h iS ，吼a 1 T h ee f f e c to fi s c h e m i ct i m e觚dt e m p e r a t u r eo nl u n gp r e s e a t i o ni as i m p l ee xv i v or a b b i tm o d e lu s e df o rf I l n c t i o n a la s s e s s m e n t JT h o r a cC a r d i o v a s cS W g1 9 8 9 ：9 8 ：3 3 3

56、 - 3 4 26W j d e rW ：H a r p e rB ，S h i o k a 、珊S ，e ta 1 I n f l u c eo fi n t r a a l v e o l a ro x y g e nc o n c e t r a t i o no nl u n gp r e s e v a t i o ni 1 1ar a b b i tm o d e lJH e a nL u n gT r a n s p l 姐t1 9 9 1 ；1 0 1 ：1 0 3 7 一1 0 4 1 7 H 叩h s o D N ，B h a b r aM S ，O d o mN J ，e

57、 ta 王C o n t r o U e dp r e s s u r er e p e r f h s i o no fp u l m o n a r yg r a f t sy i e l d si m p r o v e d如n c t i o na f t e r柳e n t y - f o u r - h o u r s ，sc o l ds t o r a g ei nU n i v e r s i t yo fW i s c o n s i ns o l u t hJH e a r th m gT r a n s p l a n t l 9 9 6 ；1 5 ：2 8 3 - 2

58、 8 78 L e h t o l aA ，H a 巧u l a H e i l 【k n aL ，e ta 1S i n 9 1 el u n ga l l o t r a J l s p l a n t a t i o ni np i g s Am o r p h o l o 酉cs t u d yo ft i s s u ep r e s e n ，a t i o nw i t hm o d m e dE u m 。c o U i n sa n d舢o r o c a r b o ns o l u t i o n - JH e 叭L l l n gT r a n s p I a n t1

59、 9 9 0 ：4 9 ：1 0 6 6 】0 7 4中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究第二部分P C o s 对供体肺保存效果影响的研究根据国际心肺移植协会的多因素分析结果，肺移植术死亡的两大危险因素是供体年龄和肺缺血时间【l 】。因此延长肺保存时间、改善肺保存效果以减轻缺血再灌注损伤依然是临床肺移植手术成功的关键。许多实验证明钾离子通道开放剂( P C O s ) 有保护器官免受缺血再灌注损伤的作用【2 引，本研究应用具有A T P 敏感性钾通道开放剂( P C 0 s ) 功能的硝酸烟碱类药物尼可地尔1 4 l 汹c o r 锄d i l ，N C

60、R ) ，在缺血期前处理大鼠供体肺，以观察其对供体肺保存效果的影响。实验材料一、实验动物健康雄性s D 大鼠，均为1 6 2 0 周龄，体重2 5 0 3 5 0 克，由北京医科大学实验动物部提供。二、主要试剂和药品戊巴比妥钠，佛山实验化工厂肝素钠注射液，常州生化千红制药有限公司保达新( P G E l ) 注射液，英国G 1 a x o 公司尼可地尔( N i c o r 姐d i l l N C R ) 试剂，日本公司格列本脲( a i b e n d a m i d e ，G L Y ) 试剂，美国S 蜘a 公司产品l O 福尔马林，北京阜外医院病理科3 戊二醛缓冲液，北京阜外医院病理科

61、二甲基亚砜( D M S O ) ，北京化工厂其它同第一部分三、主要仪器分析天平：D T l o o 型( 北京光学仪器厂)第二部分：P c 0 8 对供体肺保存效果影响的研究中国医学科学院中国协和医科丈学博士研究生学位论文改普移植肺功能的实验研究洁净工作台：月坛牌( 北京半导体设备一厂)恒温干燥箱：D G ，2 0 0 0 2 A 型( 重庆实验设备厂)其它同第一部分四、常用试剂和液体的配制1 改良E C 液配置：见第一部分2 尼可地尔溶液：尼可地尔O 2 0 4 9 溶于1 0 0 m l 蒸馏水溶解，浓度为1 0 ，0 0 0 “m o l L ，保存在4冰箱中备用。于供体肺摘取前取于供

62、体肺摘取前取O 2 m l 加入1 9 8 1 1 灌洗液中，浓度为l o o u m o J L 。3 格列本脲溶液将格列本脲溶于0 0 0 1 二甲基亚砜( D M s O ) 溶液中保存在4 冰箱中备用，供体肺灌洗前1 5 分钟根据体重取l m g 门( g 量经静脉给药。实验方法一、实验分组：取供体大鼠1 戊巴比妥钠( 5 0 m g 瓜g ) 腹腔注射麻醉后，行气管插管，打结固定与容量型呼吸机相连，通1 0 0 氧气，潮气量：5 I l l l ，频率：5 0 次分。正中剪开胸骨，以眼睑撑开器撑开，经下腔静脉肝素化( 1 0 0 0 U l ( g 体重) ，打开心包，经右室流出道放

63、置1 6 G 肺灌洗套管针。切开左心耳，将4 肺保护液( 5 0 m 1 堍改良E c 液加P G E l 2ug ) 以3 0 c m 的高度落差，经肺动脉灌注管灌洗大鼠肺。将1 8 只s D 大鼠随机分成3 组，每组6 只：A 组为常规保存组，E c 液灌洗后摘取心肺器官，4 恒温冰箱中保存8 小时后取出，以5 m l m i n 流量再灌注6 0 分钟；B 组为N C R 组，供体肺灌洗液中含有1 0 0 pm o l L 尼可地尔，余同A 组；C 组为N c R + G L Y 组，灌洗前10 分钟根据体重取1 m 班g 量格列本脲经静脉给药，余同B 组。二、检测指标l ，肺换气功能：

64、第二部分：P c O s 对供体肺保存效果影响的研究2 4 中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究再灌注期间，每间隔2 0 分钟取供体肺流出血样l 份，分别测定血气P 0 2 变化情况，用于反映供体肺换气功能。2 肺血管阻力( P t )连续测定m P A P ：在肺灌注量不变的前提下，每1 0 分钟记录m P A P 一次，计算肺血管阻力用于反映供体肺循环阻力变化情况。P V R = = m P AP Q P3 肺通气阻力( L R )连续测定b ：在潮气量恒定的前提下，每1 0 分钟记录P P 一次，计算肺通气阻力用于反映供体肺的顺应性。U 净P v t4

65、 湿干比( W D )再灌注结束后，迅速用吸纸吸净表面液体，称量供体左肺的湿重( m w ) ，再将其放入8 0 干燥箱内2 4 小时烘干，测量干重( m d ) ，计算湿干比用于反映供体肺水肿程度。、N 瞪卢盥w | m a5 形态学检查：( 1 ) 光镜检查：再灌后取右肺中叶组织标本1 1 c m ，1 0 福尔马林固定，经梯度乙醇脱水、低温石蜡包埋、切片、H E 染色后，显微镜下观察并摄片。( 2 ) 电镜检查：取再灌后右肺组织中叶标本1 l 删n 3 ，迅速用3 戊二醛缓冲液固定，1 锇酸固定2 小时，乙醇逐渐脱水，E P 0 8 1 2 环氧树脂包埋，超薄切片机切片。每块肺组织标本制

66、超薄切片铜网2 张，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色。所有标本均行日立H 6 0 0 透射电镜观察。6 肺组织M D A 含量测定：采用硫代巴比妥酸( 血i o b a r b i m r i ca c i d ，T B A ) 法。( 1 ) 器材：7 5 l 型分光光度计；瑞士产电子天平；北京医疗设备总厂产恒温水浴箱；江苏太仓产w H 6 8 l 漩涡混旋器，低温离心机。( 2 ) 试剂盒：由南京建成生物工程研究所提供( 3 ) 取材：分别于保存后、再灌注后取右肺下叶，迅速将肺组织拭干，称取第二部分：P c O s 对供体肺保存效果影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植

67、肺功能的实验研究2 0 0 m g ，放入组织研磨器中，加生理盐水至2 1 n 1 ，冰浴中研成组织匀浆。经低温离心机以1 0 0 0 转分离心1 0 分钟，取上清液用生理盐水按1 ：1 稀释成5 匀浆，待测。( 4 ) 考马亮兰( G B B G 2 5 0 ) 法测定组织蛋白含量：操作表、空白管标准管测定管蒸馏水( m 1 )O0 5l n 蜘l 标准液( m 1 )0 0 5样品( m 1 )00 5G B B G 2 5 0 显色剂( I n l )3 O3O3 O混匀，静止1 0 分钟，于5 9 5 n m 处，1 c m 光径，空白管调零，测各管吸光度。蛋白含量( g L ) ：(

68、 测定管值一空白管值) ，( 测定管值一空白管值) 标准管浓度( g L )( 5 ) M D A 含量测定：操作步骤：标准管标准空白管测定管钡9 定空白管l O n m o l n l l 标准品0 1n d无水乙醇( m 1 )O1I n l测试样品( I n l )O 1 m lO 1 m l试剂一( m 1 )0 1m l0 1I n lO 1I I l l0ln l l摇动混匀后，继续以下步骤l 试剂二( I I l l )1 5 m l1 5 m l1 5 m l1 5 m ll 试剂三( r n l )15 m l15 m l1 5 m l5 0 冰醋酸( m 1 )15 m 1

69、漩涡混旋器充分混匀，9 5 水浴8 0r n i n 后，流水冷却。以3 5 0 0f p m 离心1 0m i n 。取上层液萤光测定，设定在波长5 3 2 皿处，光径1 c m 。肺组织M D A 含量( n m o l m g p r ) = ( 测定管值一测定空白管值) ( 标准管值一标准空白管值) 标准管浓度蛋白含量( m 咖1 )三、统计学分析所有数据以x S D 表示。实验数据应用S P S S l O 0 软件进行统计学分析。统计方法包括单向方差分析和D u n n e t t 法多重对比分析。p 0 J 畸) 。2 三组大鼠供体肺流出血P v 0 2 变化情况( 见附表2 2

70、 及附图2 1 )附表2 2注：。与C 组比较，p 0 惦B 组P 0 2 均值显著高于A 组( p O ，0 5 ) ；也显著高于c 组( p O 0 5 ) 。3 三组大鼠供体肺I n P A P 变化情况( 见附表2 3 ) 及肺血管阻力情况( 见第二部分：P C o s 对供体肺保存效果影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究附图2 2 )附表2 - 3A 组B 组C 组c o n t 邢lN C RN C R + ( 辽Y舶P P 细m 丑【gl 2 0 3 3 士1 8 61 6 3 3 士2 勰2 0 8 3 2 0 矿l0 2 3 1

71、6 1 9 41 7 3 3 土2 S 8 2 S 1 9 4 。2 0 ，2 2 2 6 1 9 61 6 8 3 1 昭。2 3 5 0 士2 3 3 0 “2 8 81 8 帅1 9 0 6 7 土2 7 3 。4 0 2 5 1 7 3 4 31 8 1 7 士1 9 4 2 3 3 3 士2 4 r5 0 26 6 7 士3 0 72 0 1 7 z 朽2 5 0 士1 3 矿6 0 2 7 6 7 2 1 62 1 O O 2 1 9 12 5 3 3 士1 6 矿注：与C 组比较，p o 0 5B 组础均值显著低于A 组( p 0 0 5 ) 。4 三组大鼠供体肺P 球变化情况见

72、附表2 4 及肺通气阻力变化情况见附图2 3 ：附表2 _ 4A 组B 组C 组c 蛐t r o lN C RN C R + G I YP d c m H 2 0l 2 5 6 7 2 4 22 3 8 3 n 7 51 0 2 0 3 0 4 0 5 0 2 5 5 0 士2 2 62 4 8 3 0 7 5矩3 3 2 3 42 5 1 7 o 9 82 6 1 7 1 9 42 4 8 3 0 7 52 5 8 3 1 6 02 5 1 7 o 7 52 6 S O 1 7 62 5 3 3 n s 22 5 1 7 1 1 72 5 0 7 52 6 t 1 7 1 1 72 5 8

73、3 士1 3 32 5 5 0 1 6 42 5 5 0 1 0 56 0 2 6 5 0 2 3 42 5 5 0 惦42 6 5 0 1 1 0 4三组大鼠供体肺P 口未见显著差异P O0 5 。5 三组大鼠供体肺含水量及再灌注前后组织M D A 情况( 见附表2 5 及附中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究图2 4 ，2 5 )附表2 5 ：注：t 与C 组比较，p 锄帖；# 与A 组比较，p 0 惦B 组肺含水量及再灌注前、后组织M D A 显著低于A 组( p O 0 5 ) ，也显著低于C 组( p O 0 5 ) 。6 ，形态学检查：( 1 )

74、 光镜检查：A 组与c 组肺小血管充血、水肿明显，有弥漫性肺间质出血、水肿，可见以中性粒细胞为主的炎细胞浸润，肺泡腔内可见水肿液、红细胞以及渗出的炎性细胞( 附图2 6 ，8 ) 。B 组肺毛细血管充血，散在肺泡腔出血、水肿，肺间质轻度水肿，炎细胞浸润程度较轻( 附图2 7 ) 。( 2 ) 电镜检查：A 组和c 组电镜下见明显间质水肿，毛细血管内中性粒细胞、血小板聚集，肺泡I 型上皮细胞肿胀变性，核增大，I I 型上皮细胞线粒体明显肿胀，嵴排列紊乱，板层小体数目减少( 附图2 9 ，1 1 ) 。B 组电镜下主要见间质轻度水肿，肺泡I 型上皮细胞轻度肿胀，表面微绒毛形成指状突起，I I 型上

75、皮细胞胞浆内线粒体肿胀，但尚能保持原有结构完整( 附图2 1 0 ) 。B 组超微结构形态改变较A 组及c 组轻。第二部分：P c O s 对供体肺保存效果影响的研究中固医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究2 0 4 0 6 0( 再灌注时间)附图2 - l ：B 组P 0 2 均值显著高于A 组( p o 0 5 ) ；也显著高于c 组( p O 0 5 ) 。陲匿附图2 - 2 ：B 组肺血管阻力均值显著低于A 组( p O 0 5 ) ，也显著低于C 组( p O 0 5 ) 。：一5蚕：82：1 0 2 0 3 0 4 0 ，5 0 ，6 Dr( 再灌注

76、时间)附图2 3 ：三组大鼠供体肺肺通气阻力末见显著差异p o 0 5 。圈中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究1 21 086420W D 组B 组C 组附图2 - 4 ：B 组肺含水量显著低于A 组( p o 0 5 ) ，也显著低于C 组( p 0 0 5 ) 。差：腿B 组C 组附图2 - 5 ：B 组肺再灌注前后组织M D A 显著低于A 组( p 0 0 5 ) ，也显著低于C 组( p 0 0 5 ) 。第二部分：P c o s 对供体肺保存效果影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究附图2 - 6 ：

77、A 组光镜检查2 0 0 ：部分肺泡萎陷，肺间质出血、水肿明显，可见到以中性粒细胞为主的炎细胞大量浸润。附图2 7 ：B 组光镜检查2 0 0 ：肺泡结构完整，毛细血管充血，肺间质轻度水肿，肺泡腔内偶见散在红细胞。第二部分；P C 0 s 对供体肺保存效果影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究附图2 - 8 ：C 组光镜检查2 0 0 ：部分肺泡萎陷，肺充血、水肿明显，肺泡间隔炎细胞浸润。肺泡腔内可见水肿液和红细胞及渗出的炎细胞。附图2 - 9 ：A 组电镜检查5 0 0 0 ：电镜下见间质水肿，血管内皮不平整并有胞质表层脱落，肺泡I 型上皮细胞肿胀

78、变性，核增大。I I 型上皮细胞线粒体电子密度降低，肿胀明显，嵴变短，排列紊乱，板层体数目减少。第二部分：P c O s 对供体肺保存效果影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究附图2 1 0 B 组电镜5 0 0 0 ：见间质轻度水肿，肺泡I 型上皮细胞轻度肿胀微绒毛肿胀。I I 型细胞胞浆内线粒体结构尚完整，可见大量板层小体。附图2 1 1 ：C 组电镜8 0 0 0 ：电镜下见间质水肿，I I 型细胞胞浆内线粒体肿胀空化变性，板层体数目减少，排空增多。第二部分：P c o s 对供体肺保存效果影响的研究中国医学科学院中国协和医科太学博士研究生学位

79、论文改善移植肺功能的实验研究讨论供体肺缺血再灌注损伤在肺移植手术早期移植物功能障碍( P r i m a r yg r a 矗蹦1 u r e ，P G F ) 中起着重要作用。普遍认为再灌注后氧自由基的生成、内皮功能不良与激活的中性粒细胞之间的相互作用等因素参与了缺血再灌注损伤，而钠泵失活和细胞内钙蓄积等造成的肺损伤，早在低温缺血保存期就开始了【5 】。随着认识的深入，肺保存技术在最近十年得以逐步完善，多种新策略被用于临床，使P G F 发生率己由3 0 降至1 5 左右【1 】。更多的新技术尚处于实验研究阶段，其中血红素加氧酶途径，基因疗法和预适应被认为是新的发展方向。组织暴露于某种伤害因

80、素后可以增加对再次伤害的耐受性，这种生物学适应模式就是预适应。其中，反复短暂缺血可使心肌在后续的持续缺血中得到保护的现象称为缺血预适应( i s c h e m i cp r e c o n d i t i o 血g ，m C ) ，是最早被发现的预适应现象。P C 的机制较复杂，有大量假说在各种动物模型上证实，现普遍认为细胞A T P 敏感型钾通道( K 册) 是终末效应器【6 】。目前发现可诱导预适应的因素已从缺血、物理、化学原性扩展到药理性预适应，即应用药物来替代预缺血、高温等产生的保护作用。许多药物能够模拟殚C 作用，如钾离子通道开放剂( P c O s )吡那地尔( p i n a

81、c i d i l ) 、阿普里卡林( 印缺a l i l n ) 、尼可地尔( n i c o r a n d i I ，N c R ) 等，均能显著缩小心肌梗死范围或保护心肌收缩功能，这对冠脉搭桥、冠脉成型术具有重要意义【7 】。预适应的保护作用不仅可发生于缺血心肌，也可发生于心外组织，己证实口c 能够减轻大鼠供体肺缺血再灌注损伤【8 9 】，但P C 0 s 类药物应用于大鼠肺保存的研究尚未见报道。在药理学上，钾离子通道被分为4 组：电压依赖型、钙敏感型、受体耦联型以及包括K 艋P 在内的其他钾通道【1 0 】。K 加、P 在正常状态下呈关闭状态，其是否开放取决于细胞内- T P 浓度。

82、在A T P 浓度高时，该通道关闭；在A T P 浓度低( 缺血、缺氧) 时，该通道开放，使细胞内钾外流增加导致细胞膜结构超极化【1 1 】。同时，K 职可以被A T P 和磺脲类试剂如格列本脲( G 1 i b e n c l a m i d t 盟Y ) 所阻断。K 灯P 在血管内皮细胞，平滑肌，骨骼肌，内分泌细胞，神经元和心肌细胞中广泛第二部分：P c o s 对供体肺保存效果影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究存在【1 2 1 。N o m a 于1 9 8 3 年首先描述了K 册在许多组织器官膜兴奋偶联，分子生物能量学和细胞保护方面起重要

83、的作用。肺保存策略是心脏外科手术心肌保护的延伸，其中保护液的作用是将缺血器官新陈代谢的能量消耗减到最少，方法是以高钾溶液使可兴奋细胞胞膜去极化，造成电机械阻断。然而，在可兴奋细胞，例如肌细胞、肺泡细胞等，即使膜电位在去极化状态也存在着消耗能量的钠泵和钙泵活动【1 4 】。而且，在膜电位去极化状态，跨膜离子梯度的紊乱导致了异常的离子流动，如N a + 、K 十、c l 、c a 2 + 等等，会引起血管收缩、钙超载和细胞肿胀，保存期低温加重了这些变化I l “。低温、高钾、去极化阻滞被做为心脏手术中心肌保护的标准方法广泛应用了近3 0 年，而后又被用于心脏和肺移植手术的器官保存。然而，这种保护方

84、式并不理想，术后心肌功能和肺功能不良经常出现，因此，超极化阻断开始引起了研究者们的注意。c o h e n 【1 6 】等首先证实，以P C O s 药理学诱导的超极化心脏停搏可以提供更好的心肌保护以防止缺血再灌注损伤。P C O s 可以开放K 册增加胞膜内钾外流而使胞膜超极化，此时膜电位接近静息电位，跨膜离子阶差基本平衡，几乎不会激活离子泵和离子通道，钙向细胞内流动和肌浆网钙释放也随之减少，从而避免了细胞内钙超载，最大限度地保存了高能磷酸能量贮备。虽然大多数的P C 0 s 效应的研究集中在心肌保护，但从理论上讲P C O s 的保护效应可以扩展到肺。作为传统肺保护策略的改进，应努力做到尽

85、早地干预以减少肺的缺血再灌注损伤，合理的措施应该在缺血前开始，而不仅限于再灌注期。本实验中在肺缺血期前应用尼可地尔处理大鼠供体肺，结果显示，N c R 组的供体肺回流血P a 0 2 显著高于常规保存对照组，而肺血管阻力显著低于常规保存对照组，说明N C R 处理后的供体肺能够更好地保存氧合能力，减轻肺血管收缩。缺血再灌注损伤机制之是氧自由基的产生，氧自由基具有高反应性极不稳定，可与所接触的结构发生反应，常常氧化细胞膜的脂质成分，形成脂质过氧化产物，其中M D A 是一种主要成分，因此测定组织中M D A 含量可以反映脂质过氧化的程度，间接地反映缺血再灌注损伤的情况。本实验中N c R 组再灌

86、注前、后的肺组织M D A 含量均显著低于对照组，间接地说明N C R 处理无论在缺血保第二部分：P C 0 8 对供体肺保存效果影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究存期和再灌注期，均有减轻大鼠供体肺组织氧自由基损伤的作用。肺组织形态学检查结果也显示N C R 组供体肺超微结构病变较轻。N c R 同时具备钾离子通道开放剂和硝酸酯类药物的特性，除能够限制可兴奋细胞兴奋性、减少新陈代谢需要外，还可以通过多种机制改善肺保存效果，减轻缺血再灌注损伤。首先，N C R 能够通过两种机制产生血管舒张作用，在一定程度上拮抗高钾保存液去极化引起的缩血管作用：其一

87、是通过激活K A T P ，促进胞内钾外流，使血管平滑肌细胞膜结构超极化，从而减少细胞外钙的内流和细胞内钙库中c a 2 + 释放，降低细胞内收缩因子对钙的敏感性；其二是硝酸酯样作用，通过生成N O 增加细胞内c G M P 的生成，引起血管舒张1 1 7 1 。其次，由于细胞膜超极化，此时膜电位接近静息电位，N a + 通道关闭，最大限度地减少了N a + 内流及超载，可以对抗低温保存期间钠泵失活的不利影响。此外，有报道P c O s 还具有其他生物学功能，例如抑制中性粒细胞超氧化阴离子和巨噬细胞曰妤a 的生成【19 l 等，可以减轻白细胞介导的损伤。作为硝酸盐，N C R 有潜在的生成N

88、0 的作用，后者已被证实具有肺保护功能。N O 是在体内血管内皮细胞由精氨酸合成的一种内皮衍生舒张因子，它可与鸟苷酰环化酶结合使c G M P 增加，既而使平滑肌舒张。一些研究证实了N 0 和N 0 供体可以减轻肺的缺血再灌注损伤【2 0 0 ”。为了鉴别在肺保存中，N c R 的P c O s特性和N O 生成剂特性中哪一种起主要作用，实验中设计一组大鼠提前应用了选择性K 口阻断剂G I Y ，结果显示N c R 的保护作用被完全阻断，G L Y + N c R 组与对照组的结果无显著差异，提示N O 在N c R 减轻供体肺缺血再灌注损伤中的可能不起主要的作用。为符合当前临床惯例，本实验采

89、用了高钾E C 液及8 小时保存时间，面离体模型的局限性是观察再灌注的时间较短，P c O s 对移植肺远期功能的影响有待于进一步研究。目前已知道A T P 敏感性钾通道在膜兴奋偶联分子生物能和细胞保护方面起着重要的作用，并参与了预适应的机制，已在许多物种的大量组织器官中都得到了证明。维持可兴奋细胞膜结构超极化的保护策略可以限制可兴奋细胞兴奋性，将跨膜离子流动减到最少，减少新陈代谢的需要，因此限制了缺血再灌注效应。第二部分。P c O s 对供体肺保存散果影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究利用更符合生理学的超极化新陈代谢阻滞比高钾去极化肺保存效果

90、好，理论上说这提供了一种更接近生理状态的缺血保护方法，因此我们认为P c O s 类药物在器官保护方面可能会有广阔的应用前景。结论P C O s 药物处理供体肺能够减轻保存期和移植后缺血再灌注损伤，改善移植后早期供体肺功能。第二部分：P c O s 对供体肺保存效果影响的研究3 8 中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究参考文献1 H o s 衄p u dJ D ，B e n n e 伉L E ，e ta lT h eR e g i 泖o f 恤I m e m a t i o n a lS o c i e t yf o rH e a na 1 1 dL u n

91、 g1 协s p l a I l t 撕0 n ：S e v e m e e n t h0 m c i a lR e p O n - 一2 0 0 0 JH e a nL u n gT r 弛s p l 姐t ，2 0 0 0 ；1 9 ：9 0 9 - 9 2 12 e i n 既，P i c hS ，L 础e r t - H e 洫i b e f gS ，e ta 1 C o m p a 饿i v es t u d yo n 也ee 如c t so fi n t r a c o r a n a r yn i c o r 如m la 丑dn i 仃U 9 1 y c e r i ni ni

92、s c h e 血c ，r e p e 血s e dp o r c h 地h e a r t s E u rH e a r tJ1 9 9 5 ；1 6 ：6 0 3 93 J a n i g r o D ，w e s t D 凡G o r g o n E L ，e ta 1 册一s e n s m e K + c h a n n e l s i nr a ta o 血锄d b r 血m i c r o 、r 踮c I l l a re n d o t h e h a lc e u s A mJp h y s i o l l 9 9 3 ；2 6 5 ：C 81 2 2 14 L a z d

93、u m 虹M J T P - s e 衄i t i v ep o t 船s i u mc h a n n e l s ：锄0 v e r v i e wJC a r d i o v a s cP h 啦a c o l l 9 9 4 ；2 4 p p l4 ) ：S l S 5 5 K e l l yR Fc L l r r e ms 讹t 9 9 i e si nl u n gp r e s e r v a t i o nJL 丑bC l i nM e d2 0 0 0 ；1 3 6 ：4 2 7 4 4 0 6 P a a t tJ & P o s s i b i H t i e sf o

94、 rt h ep h a r m a c o l o g i c a le x p l o i t a t i o no fi s c h e m j cp r e c o n d i 伯n i n g JM 0 1C e l lC a r d i o l l 9 9 5 ；2 4 ：9 9 一1 1 07 m c h a f dVK 丑e 脑N ，T h u i l l e zC D e l a y e dp r o t e c t i o no ft I l ei s c h e m i ch e a n疗o mp a t h o p h y s i o l o 时t ot h e r a

95、 p e u t i c 印p l i c a t i o n s JF I l n d a mC I i mP h a r m a c o l ，1 9 9 6 ：1 0 ：4 0 9 4 1 5 ，8 ，D uZ Y n c k sM ，W a wD ，e ta 1 I s c h e m i cp r e c o n d i t i o n i n ge n l l a n c e sd o n o rl u n g p r e s e n r a t i o n i n t h er a t J H e a r t L u 鸣T r 锄p l a n t1 9 9 6 ；1 5 ：1

96、2 5 8 - 1 2 6 79 F e a t h e r s t o n eR L ，C h 锄b e r sD J ，K e l l yF J I s c h e m i cp r e c o n d m o n i n ge n h a n c e sr e c o V e r yo fi s o l a t e dr a tl u n g sa f t e rh y p o t h e r m i cp r e s e r v a t i o nA n nT h o r a cS u 唱2 0 0 0 ；6 9 ：2 3 7 2 4 2 10 ，G uK ，S i nS ，S a 位

97、o h 、e ta lC a r d i o p r o t e c t i v ee 檬j c to fI l i c o r a n d i li nh i s t i d i n e 一时p o p h a n _ k e t o g I u r a t es 0 1 u t i o nd u 血gt h ec o l ds t o r a g eo fi s l o l a t e dh e a n sT r a n s p l a n t a t i o n1 9 9 6 ；6 1 ：1 5 7 2 1 5 7 511L a z d u n s k iM A T P - s e n

98、s i t i v ep o t a s s i u mc h a I l I l e l s ：a no v e r v i e wJC a r d i o v a s c第二部分：P c o s 对供体肺保存效果影响的研究! 里垦兰登兰堕主里堡塑璧翌查兰堕主堑塞生兰焦笙茎垦董整堇堕兰壁塑茎墼翌窒P h 唧l a c 0 11 9 9 4 ；2 4 ( g u p p l4 ) ：S l - S 5 1 2 圳g r oD ，w e s tD 气G o r g o nE L ，e ta lA T P s e n s i t i v eK + c h 啪e l si nr a ta o r t

99、 a姐d b r a i n1 1 1 i c r o s c u l a re n d o t l l e l i a lc e l l s A mJP h y s i o l l 9 9 3 ；2 6 5 ：C 8 1 2 8 2 11 3N o mA 灯P - r 号g I l I a t e dK +c h 蛆l si nc a r d i a cm y o c y t e g N a t u r e1 9 8 3 ：3 0 5 ：1 4 7 1 5 1 1 4L 咖s I 【iM ，F r e l i nC ，V 培P T h es o d i u m ，h y d r o g e

100、ne x c h a n g es y s t e m 血c ar d i a cc e l l s ：i t sb i o c h e m i c a la n dp h a r m a c o l o 百c a lp r o p e m e s 趾di t s r o l e i nr e g u l a t i n gi n t e m a lc o n c 叫t m t i o n so fs o d i u ma n di n t 锄】a lp HJM o lC e l lC a r d i o l l 9 8 5 ：1 7 ：1 0 2 9 - 1 0 4 2 1 5 C h 锄e

101、 r sD J ，H e 盯D J ，D e v e l o p m e n t si nc a r d i o p r o t e G t i o n ：”P o l a r i z e d “a e s ta sa na l t e r n a t i v et oD e p o l a r i z e d ”a r r e s t 加mT h o r a cS u 唱1 9 9 9 ：6 8 ：1 9 6 0 1 9 6 6 16 C o h e nN M ，W i s eR M ，W 毫c h s l e rA S ，e ca 1 E l e c t i v ec a r d i a

102、ca r r e s tw i t hah y p e r p o l a r i 2 血ga d e n o s i n e 协p h o s p h a t e - s e n s m V ep o t a s s i u mc h a l l n e lo p e n e rJ1 1 1 0 r a cC a r d 诂v 弱cS u r g 1 9 9 3 ：1 0 6 ：3 1 7 - 3 2 21 7 K u k o v e t zW R H o l z m 姐nS ，B r a i dC ，e ta 1 D I l a lm e c h a l l i s mo ft h er

103、e l a X i n ge ff e c to fn i c Q r 阻d i lb ys t 咖l a t i o no fc y c l i cG f b 珊a t i o na n db yh y p e r p o l a 出a t io n JC a 础o v a s cP h a 珊丑c 0 1 1 9 9 1 ；17 ：6 2 7 - 6 3 318 G r o s sG J ，A u c h a m p a c hJ AM 叭l y 锄aM ，e ta 1 C a r d i o p r o t e c t i V ee 髓c t so fn i c o r a n d i

104、l Jc a r d i a 、，a s cP h 撇a c o l1 9 9 2 ；2 0 9 ( s u p p l3 ) ：s 2 2 - 2 81 9P o g r e b n i a l cH 豫M a t t h e w sw P a s sm 触t e f a b o n s 协m a c r o p h a g ef b er a d i c a l姐dt u m o rn e c r o s i sf 缸o rp r o d u c t i o nb yap o t a s s i u mc h a n n e la c t i V a t o fJS u 唱R e s19

105、9 2 ：5 2 ：3 9 5 4 0 02 0 S t n l b e rMH 删n g e rWE m s tM ，e ta 1 I n h a l e dn i t I j co X i d ea sap r o p h y J a c t i ct r e a t m e n t 鸥a i n s tr e p e r m s i o ni n j u r yo ft 1 1 el u n gJT h o r a c i cC a r d i o V a s cs u 唱1 9 9 9 ：4 7 ：1 7 9 - 1 8 5 21 n gR C ，B i n n s0 人K 枷t h

106、a I l o nR C ，e ta 1 L o W - d o s es o d i u mn h o p m s s j d er e d u c e s ”1 m o n a r yr e p e 血s i o ni 面u 珥A J l nT h o r a cS u r g1 9 9 7 ；6 3 ：1 3 9 8 1 4 0 2第二部分；P C O s 对供体肺保存效果影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究第三部分再灌注流量对移植肺功能影响的研究研究证实在心肌保护中改变再灌注流量可以有效地减轻冠状动脉内皮细胞损伤和左室功能不全1 一，在肺移

107、植术中恢复血供时控制再灌注流量，对移植肺功能会有同样作用，本实验采用3 种再灌注流量方案来研究再灌注流量变化对移植肺功能的影响。实验材料一、实验动物健康雄性s D 大鼠，均为1 6 2 0 周龄，体重2 5 0 3 5 0 克，由北京医科大学实验动物部提供。二、主要试剂和药品戊巴比妥钠，佛山实验化工厂肝素钠注射液，常州生化千红制药有限公司保达新( P G E l ) 注射液，英国G l a x o 公司l O 福尔马林，北京阜外医院病理科3 戊二醛缓冲液，北京阜外医院病理科三、主要仪器周第一、二部分四、常用试剂和液体的配制同第一、二部分第三部分：再灌注流量对移植肺功能影响的研究中国医学科学院中

108、国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究实验方法一、实验分组：取供体大鼠1 戊巴比妥钠( 5 0 m g k g ) 腹腔注射麻醉盾，行气管插管，打结固定与容量型呼吸机相连，通l O O 氧气，潮气量：5 m l ，频率：5 0 次分。正中剪开胸骨，以眼睑撑开器撑开，经下腔静脉肝素化( 1 0 0 0 U k g 体重) ，经右室流出道放置1 6 G 肺灌洗套管针到肺动脉，环绕肺动脉灌注管结扎肺动脉和主动脉。切开左心耳，将4 肺保护液( 5 0 m l l ( g 改良E c 液加P G E l 2 u g ) 以3 0 c m的高度落差，经肺动脉灌注管灌洗大鼠肺，记录肺动脉灌

109、洗压力和时间到灌洗结束。取出心肺器官，在吸气末夹住气管，将取下的心肺组织，放入装有低温保护液的容器中，恒温冰箱4 保存8 小时。取出保存后的心肺组织，悬置于有机玻璃恒温灌注箱内，用热循环水保持箱内湿度和温度( 3 7 3 9 ) 。设定潮气量5 m 1 ，频率5 0 次份。将1 8 只S D 大鼠随机分成3 组，每组6 只：A 组为低流量对照组，以4 删n 血的流量灌注供体肺3 0 分钟；B 组为高流量组，以8 r n l 1 i I l 的流量灌注供体肺3 0 分钟；C 组为控制流量组，再灌注开始后先以4 m 妇1 i 1 1 流量灌注供体肺5 分钟，然后以8 n l 恤m 的流量继续灌注供

110、体肺2 5 分钟。二、检测指标1 肺换气功能：再灌注期间，每间隔1 0 分钟取流出供体肺血样1 份，分别测定P 0 2 变化情况，用于反映供体肺换气功能。2 肺动脉平均压( m P A P )连续测定I n P A P ：在肺灌注量不变的前提下，每5 分钟记录瑚P A P 一次，用于反映供体肺循环阻力变化情况。3 ，肺吸气相峰压( P I P )连续测定P I P ：在潮气量恒定的前提下，每5 分钟记录聆一次，用于反映供体肺的顺应性。第三部分：再灌注流量对移植肺功能影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究4 湿干比( W 仍)再灌注结束后，迅速用吸纸吸

111、挣表面液体，称量供体左肺的湿重( m w ) ，取病理后再将其放入8 0 干燥箱内约2 4 小时，测量干重( m d ) ，计算湿干比用于反映供体肺水肿程度。W D = 锄w m d5 形态学检查：( 1 ) 光镜检查：再灌后取右肺下叶组织标本1 1 c m ，1 0 福尔马林固定，H E 染色后显微镜下观察。( 2 ) 电镜检查：取再灌后右肺组织下叶标本l l m m 3 ，迅速用2 5 戊二醛缓冲液固定，l 锇酸固定2 小时，乙醇逐渐脱水，E P 0 8 1 2 环氧树脂包埋，超薄切片机切片。每块肺组织标本制超薄切片铜网2 张，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色。所有标本均行日立H 6 0 0 透射

112、电镜观察。三、统计学分析所有数据以x 士S D 表示。实验数据应用S P S S l O 0 软件进行统计学分析。统计方法包括分组单向方差分析和D u l l n e 仕法多重对比分析。p o0 5 ) 。2 三组大鼠供体肺流出血P 0 2 变化情况( 见附表3 2 及附图3 1 )附表3 2注；与c 组比较p 砘蝤；# 与A 组比较p o 惦B 组再灌注1 0 后P 0 2 均值显著低于C 组( p 0 0 5 ) ；C 组再灌注1 0 后P 0 2均值显著低于A 组( D O 0 5 ) 。3 三组大鼠供体肺m P A P 变化情况( 见附表3 3 ，附图3 2 )附表3 3A 组B 组C

113、 组低漉量对照组高流量组控制流量组m 附( m m 1 ，2 1 5 0 1 3 74 6 5 0 4 3 7 2 2 14 15 ，：3 5 0 o 8 34 3 3 3 4 3 7 3 3 1 7 2 6 ，1 0 2 2 6 7 O 8 14 2 3 3 2 9 4 3 n 3 3 1 8 6 ”1 5 2 3 3 3 0 8 24 3 8 3 3 6 5 2 8 8 3 0 9 8 2 0 2 3 5 0 士1 帖4 3 1 7 4 5 0 3 0 s o 士2 9 ，2 5 “5 7 1 3 74 3 3 3 3 9 8 3 0 5 0 1 7 3 0 2 5 5 0 土1 2 24

114、 4 8 3 2 4 8 。3 0 1 7 2 4 8注：与C 组比较p 0 0 5 ；# 与A 组比较p 0 0 5B 组m n 心均值显著高于C 组( p 00 5 ) ；c 组于再灌注5 1 0 1 5 2 0 ，2 5 ，圩1 p A P均值显著高于A 组( D O 0 5 ) 。4 三组大鼠供体肺P 口变化情况( 见附表3 4 及附图3 3 )中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究附表3 4注：与C 组比较p 如艏：与B 组比较p 娜0 sB 组再灌注2 0 2 5 3 0 P P 均值显著高于C 组( p O 0 5 ) ，c 组再灌注l O 1

115、5 P D均值显著高于A 组( p 。5 三组大鼠供体肺含水量( 见附表3 5 及附图3 - 4 )附表3 5 ：注：。与C 组比较p 0 皓，# 与A 组比较p 0 0 5B 组肺含水量显著高于C 组( p O 0 5 ) ，c 组显著高于A 组( p 0 0 5 ) 。6 形态学检查：( 1 ) 光镜检查；A 组肺泡膨胀良好，毛细血管轻度充血，肺泡腔偶见红细胞( 附图3 5 ) 。B 组部分肺泡萎陷，肺毛细血管充血、水肿明显，有弥漫性肺实质出血、水肿，肺泡间隔以中性粒细胞为主的炎细胞浸润，肺泡腔内可见水肿液和红细胞及渗出的炎细胞( 附图3 6 ) 。c 组肺毛细血管充血，肺泡间质水肿程度较

116、B 组轻，肺泡腔可见中等量红细胞( 附图3 7 ) 。第三部分：再灌注流量对移植肺功能影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究( 2 ) 电镜检查：A 组电镜下主要见间质轻度水肿，肺泡中少量血液渗出。肺泡I 型上皮细胞肿胀，表面微绒毛形成指状突起，I I 型上皮细胞胞浆疏松，线粒体轻、中度肿胀，但尚保存原有结构，嵴变短可见板层小体( 附图3 - 8 ) 。B 组电镜下见间质水肿明显，内皮细胞有脱落，毛细血管内中性粒细胞聚集，肺泡I I型上皮细胞肿胀变性，核增大，线粒体明显肿胀，嵴排列紊乱，肺泡中、大量血液渗出( 附图3 9 ) 。C 组内皮细胞吞饮小泡

117、增多，空化变性，表面微绒毛形成指状突起，基底膜水肿、增厚，型上皮细胞线粒体轻、中度肿胀( 附图3 1 0 ) 。C 组超微结构形态改变较B 组为轻。第三部分；再灌注流量对移植肺功能影响的研究! 里垦兰型兰堕! 里塑塑墨型查兰堕主堡壅兰兰些丝奎垦董堑垫堕挚丝塑壅墼堕塑附图3 1 ：B 组再灌注1 0 后P 0 2 均值显著低于c 组( p O 0 5 ) ；c 组再灌注1 0后P 0 2 均值显著高于A 组( p 0 0 5 )附图3 2 ：B 组m n 心均值显著高于C 组( p O0 5 ) ；c 组于再灌注5 1 0 1 5 2 0 2 5m P A P 均值显著高于A 组( p O 0

118、5 ) 。第三部分：再灌注流量对移植肺功能影响的研究_ 4 7 中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究附图3 3 ：B 组再灌注2 0 2 5 3 0 P 口均值显著高于C 组( p 0 0 5 ) ，c 组再灌注l O 1 5 P I P 均值显著高于A 组( p o 0 5 ) 。附图3 4 ；B 组肺含水量显著高于c 组( p O 0 5 ) ，c 组显著高于A 组( p O 0 5 ) 。第三部分；再灌注流量对移植肺功能影响的研究- 4 8 中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究附图3 5 ：A 组光镜检查2 0 0

119、：肺泡膨胀良好，毛细血管轻度充血，肺泡腔偶见红细胞。附图3 6 ：B 组光镜检查2 0 0 ：肺泡间隔水肿明显，内皮细胞肿胀，其间以中性粒细胞为主的炎细胞浸润，肺泡腔内可见大量红细胞和渗出的炎细胞第三部分：再灌注流量对移植肺功能影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究附图3 7 ：C 组光镜检查2 0 0 ：肺泡间质水肿程度较B 组轻，肺泡腔可见中等量红细胞。附图3 8 ：A 组电镜检查8 0 0 0 ：基底膜水肿、增厚，I I 型上皮细胞胞浆疏松线粒体轻、中度肿胀，但尚保存原有结构，嵴变短可见板层小体。第三部分t 再港注流量对移植肺功能影响的研究中国

120、医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究附图3 9 ：A 组电镜检查5 0 0 0 ：I I 型上皮细胞胞浆疏松，线粒体肿胀，嵴消失，局灶性空化变性，肺泡中、大量血液渗出。附图3 1 0 ：A 组电镜检查5 0 0 0 ：内皮细胞吞饮小泡增多，空化变性，表面微绒毛形成指状突起，基底膜水肿、增厚，I I 型上皮细胞线粒体轻、中度肿胀，肺泡中量血液渗出。第三部分；再灌注流量对移植肺功能影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究讨论肺移植手术及相关的肺保存技术发展较快，P G F 发生率已由3 0 下降至1 5 或更低，尽管P G

121、F 在一定程度上是可逆的，但经常会造成I c U 时间延长以及死亡率的增加【3 4 1 。术前存在肺动脉高压的受体单肺移植术后P G F 发生率较高，包括原发肺动脉高压或继发于先天性心脏病的艾森曼格综合征 5 一。由于供体肺严重短缺和等待肺移植手术的肺动脉高压患者很多，曾提倡对这类患者施行单肺移植术1 7 1 J 这使P G F 问题更加突出。研究显示内皮细胞损伤可能是P G F 的触发点，而内皮细胞与中性粒细胞相互作用加重了缺血再灌注损伤。尽管供体肺损伤从缺血期就开始了，更主要的损伤则是发生在移植后再灌注阶段【8 】。再灌注时氧供恢复激活了大量体液因子，导致内皮细胞功能不良，N O 和前列腺

122、素等血管舒张因子合成减少，同时一些趋化因子和黏附分子等促使中性粒细胞与内皮吸附及浸润组织，激活的中性粒细胞释放大量的炎性介质进一步加重细胞损伤和内皮功能不良【9 1 。在肺动脉高压患者，单肺移植术后几乎全部心输出量转向了新植入的供体肺，高流量再灌注加重了移植肺血管内皮损伤，使P G F 发生率增加。高流量损伤血管内皮的机制可能有几种，首先是肺血管内皮被机械性地撕裂，造成肺水肿和肺功能障碍；另外一种机制可能是肺动脉压力增高加大了流体静力梯度，驱使液体通过内皮细胞膜；最后，肺血管内皮撕裂造成胶原暴露，能够激活循环中的白细胞，后者是肺移植后再灌注损伤的主要介质【9 l 州。改变再灌注条件已证明可以有

123、效地减轻冠状动脉内皮细胞缺血再灌注损伤和左室功能不全【l ，2 】，可以预测低流量再灌注同样可以减轻供体肺的内皮细胞损伤，降低肺动脉压和继发的水肿程度。目前，大量的实验研究集中在供体肺缺血保存期，进行着有关保存温度、保存液成份、灌洗方法以及辅助药物等研究，而涉及再灌注过程中使用的措施较少，一些实验证明有效的方法，例如加入自由基清除剂或血小板激活因子拮抗剂等，尚未被临床所采纳。控制性再灌注是一种机械性的保护方法，容易应用于临床实践因而值得进一步研究。已有实验证明控制第三部分，再灌注流量对移植肺功能影响的研究中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究再灌注压力可以减轻

124、移植肺缺血再灌注损伤I u l ，而在实际工作中，尤其是心肺联合移植等需要体外循环支持的情况下，控制流量更加方便实用；同时，实验证明长期低流量再灌注会增加微血管损伤【1 2 】，因此应在特定的时间段应用控制性再灌注以达到最好的效果。本实验是在模仿临床肺保存条件下，以3 种不同方案来控制再灌注流量对比移植肺功能情况。结果显示高流量组( B 组) 肺氧合能力下降，肺阻力增加，肺动脉压力增高，肺顺应性下降，湿干比增加，与低流量对照组( A 组) 有显著差异( P o 0 5 ) ，而控制流量组( c 组) 相对于B 组以上指标均有改善( p v i d i oF D a d d iN 。e ta 1

125、 R e c i p i e n ti n t r a m u s c u i a rg e l l e 仃a n s f e ro fa c t i v et r a n s f o r m i n 譬g r o 叭hf a c t o r b e t a la 壮e n u a t e sa t el u n gr e i e c t i o n A n n T h O r a cS u 旭2 0 0 1 ：7 l ：1 6 5 1 1 6 5 6 1 4 5I t a n oH Z h a n gWR i t t e rm ，e ta 1 A d e n o v i r u s - m

126、e d i a t e dg e n et 眦s f 打o fh u m a ni m e r l e u k 主n1 0a m e l i o r a t e sr e p e r f h s i o nin i u r vo f r a tl u n gi s o 珊R s JT h o r a cC a r d i o v a s cS u r g2 0 0 0 ：12 0 ：9 4 7 9 5 61 4 6 D O v i d i oED a d d iN ，S u d aT ，e ta 1 E m c i e mn a k e dp l a s m i dc d t r a n s

127、f e c t i o no fl u n gg r a R sb ye ) ( t e n d e dl u n g p l a s m i de x p o s u r et i m e A 1 1 nT h o r a cS u r g2 0 0 l ：7 l ：1 8 1 7 1 8 2 31 4 7F i g c h e rS ，L i uM ，M a c l e a nA e ta LI I lv ot r a n S t r a c h e a la d e n o v i m s m e d i a t e dt r a n s f e ro fh u m a ni n t e

128、 r l e u k i n 1 0g e n et 0d o n o rl u n g s8 2 中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究a m e l i o r a t e si s c h e m i a r e p e r m s i o ni 玛u r ya n di m p r o v e se a r l yp o s t t r a l l s p l a n tg r a Rf I m c t i o ni nt h er a tH u mG e n eT h e r2 0 0 1 ；1 2 ：1 5 1 3 - 1 5 2 6 1 4 8

129、Y 缸I oM ，M o r aB N ，m t t e rJ M ，吐a 1 E xv i v 0t r 柚s f b c t i o no f t r a n s f o r m i n gg r o ，c h 觚o I b e t a lg e n et op u l m o n a r ya r t e r ys e g m e 址si nl u n g 掣a f I sJT h o r a cC a r d i o v 船cS u r g1 9 9 9 ：1 1 7 ：7 0 5 7 1 3 1 4 9 C h 印e l i e r D a n e lC ，M a z m a n i

130、 a nM ，e ta 1 G e t h e r 印yi nl u n gt r 眦s p l 舭t g t i o n ：f e a s i b i l “yo fe x 、，i v oa d e o v i m s - m e d i a t e dg e n et r a l l s f 旨t ot h eg r m l u mG e n eT h e r1 9 9 6 ；7 ：1 8 3 7 1 8 4 5 1 5 0 a w a s u d aT ，D a d d iN ，e ta 1 L o w - d o s ee n d o b m n c h i a lg e n et r

131、 a n s f e rt o 锄e l i o r a t el u n g 舒心i s c h e m i a - r 印柏s i o n 坷u 珥JT h o 忸cC a r d i o V a s cS u 理2 0 0 2 ：1 2 3 ：7 9 5 - 8 0 2 1 5 1 E p p i n g 盯，W 打dP 气B o i l i n gS F e ta 1 R e g u l a t o r ye f r e c t so fi n t 盯l e u k i n _ 1 0o nl u n 譬i s c h e m i a r e p e r m s i o ni n i

132、u r 矿JT h o r a cC a r d i a v a s cS u 琅1 9 9 6 ：1 1 2 ：1 3 0 1 1 3 0 5 15 2 M a n i n sS C ，d eP e r r o tM ，I m a iYe fa 1 E n d o s c o p i cd e l i v e I o fa d e n o v i r a l m e d i 砒e dh u m a ni m e r l e u k i n - l Og e n et o 血ed o n o r 洫p r o v e sp o s tt r 哪p l 姐t l u n g f I l n c

133、t i o n i na l 盯g ea n i m a lm o d e lJ H e a r t L u n gT f a n s p l a I n2 0 0 2 ：2 1 ：2 1 2 中菌医学科学院中国挤和医科大学博士研究生学位论文改普移檀肺功能的实验研究致谢首先，感谢我的导师吴清玉教授，导师渊博的知识、高尚的道德、精湛的医术、严谨的工作作风和认真求实的科研态度，是我永远学习的榜样。多年的工作、学习生活中，导师对我严格要求、耐心辅导、谆谆教诲，都令我终身难忘，导师“业精于勤，荒于嬉”的教诲将永远铭记我心。感谢阜外医院的各位同事们，多年来在临床工作中，他们给予了我无私的帮助，使我能够在

134、医疗技术方面不断取得进步。感谢器官移植研究室的丁素秋主任、刘小燕和唐棣老师给予的帮助，感谢郭宏伟、杨秀滨、杨斌、盂强、邵孟平等学友们多方面的协助。感谢病理科阮英茆主任、王清峙同事的在切片、读片方面的帮助。感谢郑军同学在摄影方面的协助。感谢邱宏同学在科研设备方面的协助。感谢阜外医院动物实验室的陆淑琴、孙瑞成、王沛河和实验外科孟亮同事在实验材料方面提供的帮助。感谢教育处金铭处长、侯健老师、牛雨老师在学习生活中的指导和帮助。最后，感谢我的父母、家人对我的关心和支持。致谢中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生学位论文改善移植肺功能的实验研究姓名：杨研性别：男出生年月：1 9 7 2 4民族：汉籍贯：上海市个人简历学习经历；1 9 8 9 - 1 9 9 4哈尔滨医科大学临床医学系1 9 9 9 中国协和医科大学工作经历：1 9 9 4 一1 9 9 9北京阜外医院心血管外科2 0 0 0 -北京阜外医院心血管外科医学学士医学博士住院医师主治医师个人简历