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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ (天津市第一中心医院骨科，天津 300192;中国医学科学院生物医学工程研究所，天津 300192)摘要:目的 制备 PLGA-bBMP，PLGA-bBMP-IGF-，PLGA-bBMP-IGF-bFGF 三种诱导骨再生膜并比较其修复兔桡骨骨缺损的效果，探讨其作用机制。 方法 将 IGF-，bFGF 和bBMP，分别与 PLGA 复合成具有生物活性的三种诱导骨再生膜，用其修复兔桡骨骨缺损，以单纯 PLGA 膜作为对照组，分别在2、4、8 周进行大体、组织形态学、四环素示踪和组织形态计量学观察骨缺损的修复情况，并作统计学分析;免疫组织化学检测三种生长因子
2、存在时间。 结果 提取的小牛骨 bBMP 能诱导成骨，三种诱导骨再生膜均能在体内诱导新骨的形成，明显优于 PLGA(对照组)，其诱导效果呈现 PLGA/bBMP(B 组)关键词: 诱导骨再生膜;聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物;生长因子;桡骨骨缺损;诱导成骨Construction of Three Kinds of Membrane Guided Bone Regeneration and Comparison of Their Osteogenesis Capability in VivoJING Wen-xue，CAO Xian-lin，XU Dong-ming，HU Mao-zhong，YOU
3、 Jia，SUN Hong-fan(Department of Orthopaedics，the First Central Hospital of KKME-专业医学搜索引擎 http:/ of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC，Tianjin300192，China)Abstract:Objective To construct three kinds of artificial periosteum with PLGA/bBMP(bovine bone morpho-genetic protein)，PLGA/bBMP+IGF-(Isulin
4、-like Growth Factor-)，PLGA/bBMP+IGF-+bBFGF(fibroblast growth factor-2)and compare their effects of inductive ostegogenesis in repairing the rabbits radius defect，so as to study the mechanism.Methods The Artificial Periosteums were constructed by attaching bBMP、IGF-and b FGF on the PLGA membrane and
5、were implanted into the defects of radius in18rabbits models，gross，histological and im-munohistochemical examination was studied and tetracycline labelling，metrical histological analysis were studied at2，4，8，weeks.Results The bBMP could induce bone regeneration in muscle and three kinds of artificia
6、l periosteum was superior to the control group(A 组)，The osteogenic ability of three kinds of artificial periosteum was superior to the control group(A 组)，The osteogenic ability of three kinds of Artificial Periosteum was PLGA/bBMP(B)Key words:artificial periosteum;polylacticl-glycolic acid copolymer
7、;growth factor;radius defect;induced os-teogenesis膜引导骨再生(membrane guided bone regeneration，MGBR)是利用生物相容性良好的膜材料植入骨缺损周围，隔绝和保护骨缺KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 。实验证明，聚乳酸-聚羟基乙酸(polylacticl-glycolic acid copolymer，PLGA)膜具有良好的骨引导作用，但其本身无骨诱导作用。近年来，很多学者倡导将 MGBR 技术与骨生长因子联合应用，以促进骨再生，获得了比单纯使用 MGBR 技术更好的效果4 。本实验将碱性成纤维细胞生长
8、因子(basic fibroblast growth factar，bFGF)、胰岛素样生长因子-(insulin-like growth factors-，IGF-)和牛骨形态发生蛋白(bovine bone morphogenetic pro-tein，bBMP)与 PLGA膜复合，制备三种诱导骨再生膜，通过其修复兔桡骨缺损的实验，观察 MGBR 作用、降解特性、生长因子的缓释作用及诱导成骨作用，旨在研制具有骨引导和骨诱导双重成骨作用的可降解性诱导骨再生膜。1 材料与方法1.1 实验动物 昆明小鼠 10 只(北京动物所)，鼠龄 1.5 个月，体重 2528g。日本大耳白兔 27 只(天津实
9、验动物中心)，兔龄 5 个月，体重 2.03.0kg。1.2 bBMP 提取及肌袋诱导成骨试验 参照 Urist 方法5 提取新鲜小牛长骨的 bBMP，将提取 bBMP 冻干粉埋植于 12 只小鼠左下肢肌肉内，5mg/只;右下肢为对照侧，模拟手术注射生理盐水。于植入术后 1、2、3 周切取局部组织，HE 染色观察。1.3 三种诱导骨再生膜的制备 将 90mg/mL 的 PLGA 三氯甲烷溶液，在载玻片上流沿成膜，室温挥发 15min，得到 PLGA 膜;KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 5mg 的 bBMP，40 活性单位 IGF-和 5g bFGF 吸附在 PLGA 膜上，室温挥发
10、24h 至干燥，得到PLGA/bBMP，PLGA/bBMP+IGF-，PLGA/BMP+IGF-+bFGF 三种膜，塑料袋封装，环氧乙烷消毒备用。扫描电镜观察膜表面微观结构。1.4 建立动物模型和实验分组 27 只日本大耳白兔，随机分3 组，每组 9 只，按文献方法6 建立双前肢桡骨 10mm 节段性骨缺损模型，植入三种诱导骨再生膜(见图 1)，一侧为实验组，另一侧为对照组。单纯 PLGA 膜作为对照组(A 组)，实验组分为 B 组:PLGA/bBMP;C 组:PLGA/bBMP+IGF-;D 组:PLGA/bBMP+IGF-+bFGF。分别于 2、4 及 8 周处死，通过大体观察、Giems
11、a 组织学染色、四环素荧光标记7 及组织计量学分析8 ，结果采用方差分析。图 1 诱导骨再生膜管安放位置(略)1.5 外源性生长因子的免疫组化检测 免疫组化采用 SP 法，DAB 方法显色，苏木精复染，中性树胶封固。PBS 代替抗作为阴性对照。兔抗人 IGF-抗体(Sigma)工作浓度为 1125，兔抗牛BMP(Sigma)工作浓度为 1300，兔抗人 bFGF(Sigma)工作浓度为1500。2、4、8 周时，分别对 PL-GA 组和 PLGA/bBMP+IGF-+bFGF 组的组织切片经二 甲苯脱脂，梯度乙醇脱水后行免疫组化染色，呈棕褐色颗粒为阳性。2 结果KKME-专业医学搜索引擎 ht
12、tp:/ PLGA/bBMP 膜的表面微结构观察 扫描电镜观察结果显示，PLGA/bBMP 膜未见孔隙，表面粘附了生长因子后，膜的一侧形成珊瑚状粗糙面(见图 2)，另一侧呈光滑面。图 2 诱导骨再生膜扫描电镜(略)2.2 bBMP 的骨诱导活性 局部解剖观察:bBMP 植入后 1 周时植入区出现小结节团块，质稍硬;2 周时植入区内结节渐增大，淡黄色，质较硬，与周围肌肉组织界限不清;3 周时结节处骨化，形成硬质骨，有白色骨皮质和少许红色似骨髓样物质，与股骨不连，新生骨体积大约 0.5cm0.4cm0.3cm。对照侧均未发现新骨形成。组织学观察:bBMP 植入 7d 时植入区可见大量间充质细胞和成
13、纤维细胞增生，并向其周肌间隙浸润性生长，肌纤维被分割成条索状，间充质细胞肥大，胞核增大，并开始向软骨细胞分化，软骨细胞从周围向中央逐渐成熟，部分区域可见孤立的软骨岛，可见未成熟的前软骨细胞;第 14 天植入区包块内出现陷窝样特征的软骨细胞和新生骨，细胞周围形成软骨基质，新生软骨为弹性软骨样特征，肌肉组织中新骨明显可见，钙化的骨样组织呈蓝色，见髓腔形成;第21 天可见骨基质形成和不规则的骨髓腔出现，新骨增多，有骨小梁及骨髓形成。2.3 诱导骨再生膜的骨修复功能2.3.1 PLGA 诱导骨再生膜(A 组) Giemsa 染色:术后 2 周PLGA 膜完整，膜管外结缔组织大量增生，对膜管形成严密包裹
14、(见图 3a);4 周时缺损区内间充质细胞保持增殖活跃状态，形成条状软骨KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 3b);8 周时膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂，但生长方向紊乱(见图 3c)。荧光镜下:术后 2 周缺损区内骨小梁表面可见模糊的荧光线(见图 4a);4 周可见连续的双标记线(见图 4b);8周缺损区内可见多条粗大的双标记荧光线，骨小梁增多(见图 4c)。图 3 PLGA 组的 Giemsa 染色(HE，200)(略)a:术后 2 周 PLGA 膜完整，膜管外结缔组织大量增生;b:4 周时缺损区内间充质细胞保持增殖活跃状态，形成条状软骨;c:8 周时膜管内骨缺损已被
15、新生骨所连接，膜外形成少量骨痂，但生长方向紊乱。图 4 PLGA 组的四环素荧光观察(HE，200)a:术后 2 周，缺损区内骨小梁表面可见模糊的荧光线;b:术后 4 周可见连续的双标记线;c:8 周缺损区内可见多条粗大的双标记荧光线，骨小梁增多。2.3.2 PLGA/bBMP 实验组观察(B 组) Giemsa 染色:术后 2周 PLGA/bBMP 膜完整，膜管外结缔组织大量增生，可见来自骨端的间充质细胞长入，缺损区断端少许骨皮质坏死，缺损区有少量新骨形成(见图 5a);4 周缺损区内形成较多新骨，成骨细胞和成软骨细胞增殖较活跃(见图 5b);8 周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂(见图 5c)。荧光镜下:术后 2 周缺损区内可见稀疏的骨小梁，骨小梁表面可见双标记荧光线(见图 6a);4 周骨小梁增多，骨小梁表面荧光带增宽，骨的矿化和改建较活跃(见图 6b);8 周缺损区内骨小梁连接较密，骨小梁表面有宽的双标记荧光线，骨的矿化和KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 6c)。图 5 PLGA/bBMP 组 Giemsa 染色(HE，
