《人转化生长因子-β1基因转染对人牙龈成纤维细胞成骨特性的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人转化生长因子-β1基因转染对人牙龈成纤维细胞成骨特性的影响（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 基因转染对人牙龈成纤维细胞基因转染对人牙龈成纤维细胞成骨特性的影响成骨特性的影响人转化生长因子-1 基因转染对人牙龈成纤维细胞成骨特性的影响作者：储庆 吴织芬 王勤涛 何海丽 万玲 刘玲侠 作者单位：第四军医大学口腔医院 牙周病黏膜病科，陕西 西安 710032 【摘要】 目的 观察并评价基因转染后牙龈成纤维细胞（GF）表达外源目的基因人转化生长因子-1（hTGF-1）对其分化、成骨特性的影响。方法 采用碱性磷酸酶（ALP）活性检测方法检测转染对 GF ALP 活性的影响，免疫组化染色及图像分析评价基因转染后骨钙素（OC） 、骨桥素（OPN） 、骨涎蛋
2、白（BSP） 、骨结合素（ON）含量的变化，体外矿化结节形成实验检测转染后细胞成骨特性的变化。结果 转染后 GF 的 ALP 活性较未转染组有显著的提高（P0.05） 。OC 含量检测显示转染后 GF 的 OC 含量与未转染组和 PDLCs 组相比，其差异均无统计学意义（P0.05） 。免疫组化染色后，转染组 GF 所表达的 OPN、ON、BSP 含量均高于未转染组GF（P0.05） 。第 21天和第 24 天时，在矿化液作用下 PDLCs 及转染 GF 在倒置显微镜下可见致密的结节形成，von Kossa 染色可见紫色的矿化结节形成。未转染 GF 未见结节形成。而转染 GF 在未经矿化液诱导
3、情况下，虽出现显著的细胞聚集，但 von Kossa 染色未见紫色矿化结节形成。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 转染 pcDNA3-hTGF-1 后的 GF 可表达一定的成骨细胞特性，但这种成骨特性有限。 【关键词】 人转化生长因子-1 基因转染 牙龈成纤维细胞 成骨Influence of transfection with human transforming growth factor-1 gene on the osteogenic potential of the cultured human gingival fibroblast CHU Qing，WU Zhi-fen，
4、WANG Qin-tao，HE Hai-li，WAN Ling，LIU Ling-xia. （Dept. of Periodontology and Oral Medicine，School of Stomatology, The Fourth Military Medical University，Xian 710032, China）Abstract Objective To study the influence of transfection with human transforming growth factor-1（hTGF-1） gene on the osteogenic p
5、otential and differentiation of the cultured human gingival fibroblast（GF）. Methods Enzyme kinetics method was used to measure the effects of the transfection on the alkaline phosphatase（ALP） activity. Im-munohistochemistry stain and image analysis were applied to evaluate the alteration of the cont
6、ent of osteopontin（OPN）, bone sialoprotein（BSP）, osteonectin（ON）, osteocalcin（OC） in the GF with transfection. Mineralization nodules formation in vitro was also used. Results The ALP activity of the GF after transfection was higher than the GF without transfection significantly（P0.05）. KKME-专业医学搜索引
7、擎 http:/ content of OC in GFwas not improved after transfection, was similar with that of PDLCs（P0.05）. Under immunohistochemistry stain, thecontents of OPN, ON, BSP expressed in GF with transfection were higher than those of GF without transfection（P0.05）. In the mineralized cultured medium, the no
8、dules were observed in the GF with transfection and PDLCs after 21 days and 24 days alternatively. After von Kossa stain, purple mineralization nodules were observed. Conclusion The GF transfected with pcDNA3-hTGF-1 could express some osteogenic characters, though these characters are restricted. Ke
9、y words human transforming growth factor-1； gene transfection； gingival fibroblast； osteogenesis人转化生长因子-1-pcDNA3 质粒真核表达载体（pcDNA3-human transforming growth factor-1，pcDNA3-hTGF-1）能够转染牙龈成纤维细胞（gingi-val fibroblast，GF） ，并在其内获得稳定表达1。外源性人转化生长因子-1（human transforming growthfactor-1，hTGF-1）对 GF 的作用比较肯定，但基因转染
10、后 GF 表达外源目的基因 hTGF-1 后对其生物学性状，尤其是对细胞分化、成骨特性的影响尚不清楚。本研究观察pcDNA3-hTGF-1 转染对 GF 生物学性状的影响，为进一步观察转染 pcDNA3-hTGF-1 并能够稳定表达 hTGF-1 的 GF 植入体内后诱导牙周组织再生的能力奠定基础。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 材料和方法1.1 主要试剂和仪器hTGF-1 表达载体 pcDNA3-hTGF-1 由第四军医大学口腔医院口腔内科学实验室构建，G-418、DMEM 培养基（Gibco 公司，美国） ，胎牛血清（杭州四季青公司） ，噻唑蓝（methyl thiazolyl
11、tetrazolium，MTT） 、-甘油磷酸钠、-维生素 C、地塞米松（Sigma 公司，美国） ，兔抗人 TGF-1 抗体、SABC 免疫组化试剂盒、兔抗人骨桥素抗体、兔抗人骨涎蛋白抗体、兔抗人骨结合素抗体（武汉博士德公司） ，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（北京中生生物工程高技术公司） 。1.2 pcDNA3-hTGF-1 转染对细胞 ALP 活性的影响分别收获已转染 pcDNA3-hTGF-1 并经 G418 筛选 4 周的GF 和未转染 pcDNA3-hTGF-1 的 GF 以及同一个体的牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament
12、cells，PDLCs） ，制备单细胞悬液，计数，调整细胞密度为每毫升 5104 个，将 PDLCs、未转染组和转染组GF 分别接种于 96 孔板，接种每种细胞各 6 孔，每孔 200 L，置5%CO2 培养箱内培养。于贴壁后 2 d 进行 ALP 检测。具体操作步骤为：取新配制的工作液 100 L，加入待测检品 50 L，37 孵育30 min，每孔加入 0.2 mol/L NaOH 50 L 终止反应，于波长 410 nm的酶联免疫仪上行光密度值测定，取平均值进行统计学处理。1.3 骨相关蛋白含量的检测 1.3.1 骨钙素（osteocalcin，OC）含量的检测 取转染后KKME-专业医
13、学搜索引擎 http:/ 5 代 GF 和未转染 GF 以及同一个体的 PDLCs，以细胞密度为每毫升 5104 个接种于 96 孔板中，每孔 200 L，在含有 100 mL/L FBS 的 DMEM、标准环境下培养 5 d。取待测各组细胞上清液 100 L、125I 标记的 OC 抗体 100 L 和未标记的 OC 抗体 100 L 混合后，4 放置 24 h。每管加入分离剂 0.5 mL，混匀后室温放置 20 min，4 下 3 500 r/min 离心 20 min，弃上清，检测沉淀物的放射剂量。由自动 计数仪预先编好的程序，直接输入相关数据、标准曲线及样品质量浓度，最后以 ng/mL
14、 表示。取均值进行统计学分析。1.3.2 骨桥素（osteopontin，OPN）含量的检测 细胞标本经 3 mL/L 的过氧化氢甲醇溶液及 3 mL/L triton-X100 处理，正常山羊血清封闭 20 min，加一抗（兔源性骨桥素抗体，滴度为1150）室温 2 h，0.01 mol/L PBS（pH7.4）冲洗，加二抗 20 min，PBS 冲洗，加 SABC 20 min，DAB 显色。设阴性对照，即以正常兔血清替代一抗。1.3.3 骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）含量的检测 细胞标本经 3 mL/L 的过氧化氢甲醇溶液及 3 mL/L triton-X100
15、处理，正常山羊血清封闭 20 min，加一抗（兔源性骨涎蛋白抗体，滴度为1150）室温 2 h，0.01 mol/L PBS（pH7.4）冲洗，加二抗 20 min，PBS 冲洗，加 SABC 20 min，DAB 显色。设阴性对照，即以正常兔血清替代一抗。1.3.4 骨结合素（osteonectin，ON）含量的检测 细胞标本经 3 mL/L 的过氧化氢甲醇溶液及 3 mL/L triton-X100 处理，正常KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 20 min，加一抗（兔源性骨结合素抗体，滴度为1150）室温 2 h，0.01 mol/L PBS（pH7.4）冲洗，加二抗 20 min，PBS 冲洗，加 SABC 20 min，DAB 显色。设阴性对照，即以正常兔血清替代一抗。1.3.5 免疫组化结果判断 免疫组化染色阳性细胞间质呈棕褐色。应用 LeicaQ 550IW 计算机图像分析系统及其软件定量评价呈阳性免疫组化染色的细胞间质的灰度值（灰度分级 0255 级，0级为最深，255 级为最浅） ，每组分别取 3 张细胞爬片，每张随机采集 3 个高倍视野进行测定（200，向同一个方向移动细胞爬片，不重叠，不重复） ，测得结果取平均值，作为每张细胞爬片视野内棕褐色的平均灰度值，再取每组 3 张的灰度平均值，作为各组细胞OPN、BSP、ON 表达的间接数值。1
